Integracja nieprawidłowej protrombiny (PIVKA-II), alfa-fetoproteiny i rutynowych zmiennych klinicznych w celu wczesnego wykrywania raka hepatokomórkowego

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje powtarzalny schemat postępowania w celu zintegrowania PIVKA-II, AFP oraz rutynowych zmiennych klinicznych w modelu diagnostycznym opartym na regresji logistycznej dla raka hepatokomórkowego, wraz z walidacją w przypadku choroby we wczesnym stadium oraz wyników AFP-ujemnych.

Streszczenie

Wczesne wykrywanie raka wątrobowokomórkowego (HCC) pozostaje ograniczone przez niepełną czułość alfa-fetoproteiny (AFP), szczególnie w przypadku nowotworów we wczesnym stadium oraz tych z wynikiem AFP-ujemnym. W niniejszym badaniu oceniono, czy nieprawidłowy poziom protrombiny/białka indukowanego brakiem witaminy K-II (PIVKA-II), AFP oraz rutynowe zmienne kliniczne mogą zostać zintegrowane w powtarzalny model diagnostyczny HCC. Do opracowania modelu wykorzystano retrospektywną kohortę treningową składającą się z 205 uczestników, w tym 112 przypadków HCC potwierdzonych obrazowo i 93 osób z grupy kontrolnej (non-HCC). Do testów poza próbą, bez ponownego dopasowania modelu, wykorzystano niezależną prospektywną kohortę walidacyjną obejmującą 184 uczestników, w tym 58 przypadków HCC i 126 osób z grupy kontrolnej (non-HCC). Próbki krwi pobrane przed badaniami obrazowymi posłużyły do pomiaru AFP i PIVKA-II, a zmienne kliniczne wyekstrahowano z tego samego okna diagnostycznego. Końcowy wieloczynnikowy model regresji logistycznej połączył ln(AFP), ln(PIVKA-II), wiek, płeć, albuminy, międzynarodowy wskaźnik skrzepiania (INR) oraz liczbę płytek krwi. Model łączony osiągnął wartość AUC wynoszącą 0,93 w kohorcie treningowej oraz 0,89 w kohorcie walidacyjnej. W walidacji czułość wyniosła 84,5%, a swoistość 90,5%. Czułość utrzymała się na poziomie 72,7% dla HCC we wczesnym stadium oraz 73,1% dla HCC z wynikiem AFP-ujemnym, przewyższając w obu podgrupach wyniki uzyskane przy użyciu wyłącznie AFP. Kalibracja i walidacja metodą bootstrap potwierdziły dopuszczalną stabilność modelu. Wyniki te pokazują, w jaki sposób PIVKA-II, AFP i rutynowo dostępne zmienne kliniczne mogą zostać połączone w praktyczne narzędzie do triage'u diagnostycznego dla populacji z chorobami wątroby o wysokim ryzyku.

Wprowadzenie

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest główną przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami i zazwyczaj rozwija się u pacjentów z przewlekłymi chorobami wątroby, w tym przy zakażeniach wirusem zapalenia wątroby B, zakażeniach wirusem zapalenia wątroby C, alkoholowej chorobie wątroby oraz stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną¹. Wczesne wykrycie ma kluczowe znaczenie kliniczne, ponieważ leczenie przyczynowe jest najskuteczniejsze, gdy guzy zostaną znalezione przed naciekiem naczyniowym, przerzutami pozawątrobowymi lub znacznym pogorszeniem rezerwy wątrobowej. Obecne strategie nadzoru opierają się zazwyczaj na ultrasonografii wątroby z oznaczeniem lub bez oznaczenia poziomu alfa-fetoproteiny (AFP) w surowicy². W rutynowej praktyce skuteczność nadzoru jest jednak ograniczana przez zależność od operatora, mały rozmiar guzów, heterogeniczne guzki marskie, trudności w obrazowaniu związane z otyłością oraz guzy, które produkują mało lub wcale nie produkują AFP^3,4.

AFP pozostaje powszechnie stosowane, ponieważ jest niedrogie, dostępne i znane klinicystom. Jego wartość diagnostyczna jest ograniczona przez niepełną czułość i niedoskonałą swoistość. Przy konwencjonalnym progu 20 ng/mL AFP może nie wykryć znacznej proporcji HCC we wczesnym stadium oraz HCC AFP-ujemnych. Niższe progi mogą poprawić czułość, ale zwiększają liczbę wyników fałszywie dodatnich u pacjentów z aktywnym zapaleniem wątroby, marskością lub innymi zapalnymi schorzeniami wątroby^5,6. Ograniczenia te sprawiają, że interpretacja pojedynczego markera jest niewystarczająca do triażu diagnostycznego w populacjach z wysokim ryzykiem chorób wątroby.

Nieprawidłowa protrombina, znana również jako białko indukowane brakiem witaminy K-II (PIVKA-II) lub des-γ-karboksyprotrombina, jest uwalniana, gdy złośliwe hepatocyty produkują niepełnie karboksylowaną protrombinę. PIVKA-II odzwierciedla biologię nowotworu związaną z krzepliwością, a nie wydzielanie AFP, i może pozostać informacyjna w przypadku niskiego poziomu AFP⁷. Poprzednie badania i metaanalizy wykazały, że PIVKA-II poprawia wykrywalność HCC, szczególnie w połączeniu z AFP, i może wnosić wartość diagnostyczną we wczesnym stadium choroby lub w przypadku choroby AFP-ujemnej^8,9. Strategie opierające się wyłącznie na markerach nie uwzględniają jednak w pełni tła gospodarza, rezerwy wątrobowej, liczby płytek krwi, stanu krzepliwości ani podstawowej choroby wątroby.

Złożone modele diagnostyczne stanowią praktyczny sposób interpretacji wyników markerów nowotworowych w połączeniu z kontekstem klinicznym. Modele GALAD, GAAD oraz modele pokrewne wykazały, że zmienne demograficzne i biomarkery mogą być łączone w celu poprawy wykrywalności HCC w różnych etiologiach i populacjach^10,11. Ich skuteczność przemawia za stosowaniem wielowymiarowej oceny ryzyka zamiast opierania się na izolowanych progach dla pojedynczych biomarkerów. Jednocześnie niektóre modele obejmują testy, które nie są dostępne we wszystkich laboratoriach, a wartości odcięcia mogą różnić się w zależności od regionu, profilu etiologicznego, stadium choroby oraz zamierzonego zastosowania klinicznego¹². Model opracowany na podstawie powszechnie dostępnych biomarkerów i rutynowych zmiennych laboratoryjnych może być łatwiejszy do wdrożenia w standardowych procesach diagnostycznych. W przeciwieństwie do wcześniej publikowanych modeli, które mogą opierać się na specjalistycznych biomarkerach lub strategiach odcięcia specyficznych dla danej populacji, w niniejszym badaniu oceniono wielowymiarowy model diagnostyczny oparty na powszechnie dostępnych biomarkerach i rutynowych zmiennych klinicznych, a następnie zwalidowano jego skuteczność w niezależnej kohorcie prospektywnej.

PIVKA-II nadaje się do tego schematu, ponieważ uzupełnia AFP i może być mierzony na zautomatyzowanych platformach do testów immunoenzymatycznych, które są już wykorzystywane w laboratoriach klinicznych. Zmienne rutynowe, takie jak wiek, płeć, poziom albumin, bilirubiny, liczba płytek krwi, międzynarodowy wskaźnik INR oraz historia choroby wątroby, są dostępne podczas tej samej wizyty klinicznej i mogą dostarczać informacji o rezerwach wątroby lub krzepliwości krwi istotnych dla ryzyka HCC¹³. Połączenie tych zmiennych z AFP i PIVKA-II może poprawić rozróżnialność, unikając jednocześnie zależności od pojedynczego punktu odcięcia.

W związku z tym oceniono PIVKA-II, AFP oraz rutynowe zmienne kliniczne, stosując diagnostyczny schemat z dwiema kohortami. Wieloczynnikowy model regresji logistycznej opracowano w retrospektywnej kohorcie treningowej, a następnie przetestowano w niezależnej prospektywnej kohorcie walidacyjnej bez ponownego dopasowania modelu. Skuteczność diagnostyczną porównano z wynikami uzyskanymi wyłącznie dla AFP, PIVKA-II oraz zmiennych klinicznych, zwracając szczególną uwagę na HCC we wczesnym stadium, HCC AFP-ujemne, interpretację wartości progowych, kalibrację oraz wewnętrzną walidację metodą bootstrapową.

Protokół

Badanie to zostało przejrzane i zatwierdzone przez Komisję Etyki Affiliated Hangzhou First People's Hospital, School of Medicine, Westlake University. Numer zatwierdzenia wynosił IIT-20230528-0108-01. Przed pobraniem krwi uzyskano pisemną świadomą zgodę od uczestników włączonych do badania prospektywnie. W przypadku retrospektywnie włączonych rekordów klinicznych oraz zarchiwizowanych pozostałości próbek pobranych podczas rutynowej opieki, komisja etyki zrezygnowała z wymogu uzyskania świadomej zgody, ponieważ wykorzystano zanonimizowane dane i nie przeprowadzono żadnych dodatkowych interwencji.

Powtarzalność, kontrola błędów systematycznych i integralność danych

Kryteria kwalifikacji, punkty czasowe pobierania krwi, zasady oceny obrazowania, definicje podgrup, potencjalne predyktory, definicje wartości odcięcia, zasady postępowania z brakującymi danymi oraz procedury walidacyjne zostały określone przed przeprowadzeniem analizy statystycznej. Próbki krwi pobrano przed potwierdzeniem obrazowym z użyciem kontrastu oraz przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia przeciwnowotworowego. W badaniach laboratoryjnych zastosowano zanonimizowane identyfikatory badania, a próbki z kohorty treningowej i walidacyjnej badano w kolejności randomizowanej. Personel laboratoryjny nie posiadał informacji o ostatecznej diagnozie, przydziale do kohorty, stopniu zaawansowania według klasyfikacji BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer) oraz statusie AFP-ujemnym. Diagnoza obrazowa i stopień zaawansowania zostały określone niezależnie od badań laboratoryjnych. Wprowadzenie danych, konwersja jednostek, przydział do kohorty, kodowanie wykluczeń, kodowanie brakujących wartości oraz zbiory danych statystycznych zostały sprawdzone przez dwóch badaczy przed dopasowaniem modelu. Kohorta treningowa i walidacyjna pozostawały oddzielone podczas przesiewania zmiennych, dopasowywania modelu, wyznaczania wartości odcięcia oraz walidacji.

Populacja i projekt badania

W niniejszym diagnostycznym badaniu z dwiema kohortami opracowano i zwalidowano wieloczynnikowy model wykrywania HCC z wykorzystaniem nieprawidłowego poziomu protrombiny/białka indukowanego przez PIVKA-II, AFP oraz rutynowych zmiennych klinicznych. Retrospektycznie sformowana kohorta treningowa obejmowała uczestników badanych między 1 stycznia 2021 r. a 31 grudnia 2023 r. Kohorta ta została wykorzystana do przesiewu zmiennych, dopasowania modelu, wyznaczenia wartości odcięcia oraz wewnętrznej walidacji metodą bootstrap. Prospektywnie zrekrutowana kohorta walidacyjna obejmowała uczestników badanych między 1 stycznia 2024 r. a 31 grudnia 2025 r. Kohorta ta służyła wyłącznie do testowania poza próbką. W kohorcie walidacyjnej nie przeprowadzono ponownego wyboru zmiennych, ponownego dopasowania modelu, aktualizacji współczynników, ponownej optymalizacji wartości odcięcia ani rekalibracji w oparciu o podgrupy. Przepływ uczestników, przydział do kohort, pobieranie krwi, przetwarzanie osocza, testowanie biomarkerów, ocena obrazowa oraz schemat analizy statystycznej przedstawione są na Ryc. 1.

Uczestników zrekrutowano z grupy pacjentów objętych nadzorem nad chorobami wątroby wysokiego ryzyka lub ścieżki diagnostycznej w Affiliated Hangzhou First People's Hospital, School of Medicine, Westlake University. Status wysokiego ryzyka określono jako przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby B, przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby C, marskość wątroby o dowolnej etiologii lub stłuszczeniową chorobę wątroby z udokumentowaną włóknicą na podstawie oceny klinicznej, dokumentacji laboratoryjnej lub wcześniejszych badań obrazowych. Kryteria włączenia obejmowały osoby dorosłe w wieku ≥18 lat, które poddały się pobraniu krwi przed badaniem obrazowym oraz wielofazowej tomografii komputerowej (CT) z kontrastem i/lub dynamicznemu rezonansowi magnetycznemu (MRI) z kontrastem w ciągu 14 dni po pobraniu krwi. Kryteria wykluczenia obejmowały wcześniejsze leczenie HCC, w tym resekcję, ablację, terapię przezcewnikową lub terapię systemową; podanie witaminy K w ciągu 7 dni przed pobraniem próbki; terapię antagonistami witaminy K lub inną terapię przeciwzakrzepową, która mogłaby wpłynąć na interpretację krzepliwości; ostre zapalenie dróg żółciowych lub niedrożność dróg żółciowych w momencie pobrania próbki; ciążę; brak wyników AFP, PIVKA-II lub ostatecznej diagnozy obrazowej; oraz nieakceptowalną jakość próbki przy braku możliwości pobrania prawidłowej próbki powtórnej.

Ostateczna populacja badawcza obejmowała 389 uczestników. Kohorta treningowa składała się z 205 uczestników, w tym z 112 przypadków HCC potwierdzonych obrazowo oraz 93 kontroli nie-HCC. Kohorta walidacyjna obejmowała 184 uczestników, w tym 58 przypadków HCC potwierdzonych obrazowo oraz 126 kontroli nie-HCC. W kohorcie treningowej grupa 93 kontroli nie-HCC obejmowała 30 zdrowych kontroli oraz 63 kontroli z przewlekłą chorobą wątroby. W kohorcie walidacyjnej grupa 126 kontroli nie-HCC obejmowała 0 zdrowych kontroli oraz 126 kontroli z przewlekłą chorobą wątroby.

Status objawowego przebiegu choroby nie przypisywano wyłącznie na podstawie historii zapaleń wątroby lub zrekompensowanej marskości. Uczestnika klasyfikowano jako objawowego tylko wtedy, gdy w dokumentacji sprzed obrazowania odnotowano nowy lub nasilający się ból w prawym górnym kwadrancie brzucha, niewyjaśnioną utratę masy ciała, wzdęcie brzucha, żółtaczkę, ciemny mocz lub klinicznie udokumentowaną dekompensację, której nie wyjaśniono inną potwierdzoną przyczyną. Uczestników bez tych objawów klasyfikowano jako bezobjawowych lub wykrytych w ramach nadzoru.

Rozstrzyganie diagnostyczne i stopniowanie

Ostateczny status HCC ustalono w drodze oceny z wykorzystaniem wielofazowej tomografii komputerowej (CT) z kontrastem i/lub dynamicznego rezonansu magnetycznego (MRI) z kontrastem, wykonanych w ramach rutynowej opieki. Obrazowanie musiało obejmować co najmniej fazę tętniczą oraz fazę żylną wrotnej; w przypadku dostępności uwzględniano również wyniki z fazy opóźnionej. Zmianę klasyfikowano jako HCC, gdy obrazowanie wątroby osób z grup ryzyka wykazało hiperwzmocnienie w fazie tętniczej z wypłukiwaniem kontrastu w fazie żylnej wrotnej i/lub fazie opóźnionej, z obecnością lub bez obecności wzmacniającej się torebki. Uczestników bez cech obrazowych zgodnych z HCC i bez innej diagnozy nowotworowej złośliwego zakwalifikowano do grupy non-HCC.

Informacje obrazowe zostały wyodrębnione za pomocą uprzednio określonego formularza, w którym odnotowano modalność obrazowania, uzyskane fazy, hiperwzmocnienie w fazie tętniczej, wypłukiwanie (washout), wygląd torebki, liczbę zmian, maksymalną średnicę zmiany, naciekanie makronaczyniowe oraz rozsiew pozawątrobowy. Dwóch przeszkolonych badaczy niezależnie wyodrębniło cechy obrazowe z końcowych raportów radiologicznych. Rozbieżności rozstrzygano na drodze konsensusu, stosując te same zdefiniowane kryteria. W przypadku dostępności zarówno tomografii komputerowej (CT), jak i rezonansu magnetycznego (MRI), zastosowano modalność z najbardziej kompletną charakterystyką wielofazową. Jeśli obie modalności były kompletne, wykorzystano tę, która została udokumentowana jako podstawa końcowej decyzji klinicznej.

Stopień wg klasyfikacji BCLC przypisano po ostatecznym potwierdzeniu stanu HCC. Wczesne stadium HCC zdefiniowano jako stopień BCLC 0–A. HCC AFP-ujemne zdefiniowano jako AFP <20 ng/mL podczas pobrania krwi przed obrazowaniem. Etykiety te zostały użyte do oceny wydajności w podgrupach, a nie do trenowania modelu lub określenia kwalifikowalności uczestników.

Pobieranie próbek i przetwarzanie osocza

Krew żylną obwodową pobierano rano, po co najmniej 8 h postu nocnego, przed potwierdzeniem rozpoznania w badaniu CT/MRI z kontrastem oraz przed rozpoczęciem terapii przeciwnowotworowej. Łącznie pobrano 10 mL krwi żylnej do probówek z antykoagulantem K₂-EDTA. Bezpośrednio po pobraniu probówki odwracano 8–10 razy, a następnie transportowano do laboratorium w temperaturze 4 °C. Odstęp czasowy od nakłucia żyły do wirowania utrzymywano w granicach 2 h i odnotowywano w dzienniku próbek.

Plazmę oddzielono poprzez wirowanie przy 1,600 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C przy użyciu wirówki chłodzącej. Nadkład plazmy przeniesiono do 1,5 mL probówek mikrowirówkowych wolnych od nukleaz i podzielono na porcje 0,5–1,0 mL. Alikwoty przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analiz. Przed pomiarem biomarkerów jedną alikwotę odmrożono raz w temperaturze pokojowej, 20–25 °C, przez 20–30 min, wymieszano delikatnie poprzez odwracanie i przebadano w ciągu 2 h od całkowitego rozmrożenia. Próbki z widocznymi skrzepami, umiarkowaną lub silną hemolizą bądź wyraźną lipemią odrzucono zgodnie z zdefiniowanymi kryteriami akceptacji laboratoryjnej. W przypadku prospektywnej kohorty walidacyjnej, jeśli było to klinicznie możliwe, przed potwierdzeniem obrazowym wykonano powtórne pobranie krwi.

Pomiar AFP i PIVKA-II

Poziomy AFP i PIVKA-II zmierzono za pomocą immunochemicznych testów elektrochemiluminescencyjnych na automatycznym analizatorze immunoologicznym. Wartości AFP zapisano w ng/mL, a PIVKA-II w mAU/mL. Wyniki wyeksportowano bezpośrednio z laboratoryjnego systemu informatycznego.

Każda seria analityczna zawierała kalibratory specyficzne dla danego testu oraz co najmniej dwa poziomy wewnętrznej kontroli jakości. Warunkiem zaakceptowania serii było uzyskanie wszystkich wyników kontroli jakości w predefined laboratory control range (predefiniowanym zakresie kontrolnym laboratorium). Cele precyzji analitycznej wynosiły: współczynnik zmienności wewnątrz serii ≤10% oraz współczynnik zmienności między seriami ≤15% zarówno dla AFP, jak i PIVKA-II. W przypadku niepowodzenia kontroli jakości lub wykrycia dryfu serii, seria była odrzucana, analizator był ponownie kalibrowany, a seria powtarzana, o ile pozostała wystarczająca objętość próbki. W przypadku uzyskania niewiarygodnego lub wykraczającego poza zakres pojedynczego wyniku próbki, w miarę możliwości przeprowadzano dwa pomiary powtórne z tej samej rozmrożonej aliquoty, a następnie wykorzystywano średnią z dwóch zaakceptowanych wartości powtórnych. Jeśli powtórne badanie nie przyniosło rezultatu lub objętość próbki była niewystarczająca, wynik oznaczano jako nieważny i traktowano zgodnie z zasadą postępowania z brakującymi danymi.

Rutynowe wyodrębnianie zmiennych klinicznych

Rutynowe zmienne kliniczne pobrano z tej samej wizyty klinicznej, podczas której wykonano pobranie krwi na oznaczenie AFP/PIVKA-II przed badaniem obrazowym. Zmienne kandydackie obejmowały wiek, płeć, aminotransferazę alaninową, aminotransferazę asparaginianową, albuminy, bilirubinę całkowitą, międzynarodowy wskaźnik zakrzepowatości (INR), czas protrombinowy oraz liczbę płytek krwi. W przypadku dostępności wielu wartości w oknie przed badaniem obrazowym, wybrano wartość najbliższą czasowi pobrania próbek AFP/PIVKA-II. Jednostki zostały ustandaryzowane przed analizą. Wiek zapisano w latach; płeć zakodowano jako kobieta = 0 i mężczyzna = 1; liczbę płytek krwi zapisano jako ×10⁹/L; albuminy zapisano jako g/L; bilirubinę całkowitą zapisano jako μmol/L; AFP zapisano jako ng/mL; a PIVKA-II zapisano jako mAU/mL.

Po ekstrakcji przeprowadzono kontrolę zakresów, jednostek oraz weryfikację wartości nieprawdopodobnych. Oznaczone wartości sprawdzono w odniesieniu do rekordów źródłowych. Wartość była wykluczana tylko wtedy, gdy rekord źródłowy potwierdzał problem z jakością próbki, błąd konwersji jednostek lub odchylenie w przetwarzaniu. Zweryfikowane wartości ekstremalne zostały zachowane. Słownik zmiennych definiował strukturę zbioru danych, nazwy zmiennych, jednostki, reguły kodowania, reguły transformacji oraz kody wartości brakujących.

Definicja predyktorów i wybór zmiennych

Kandydaci na predyktory zostali określeni przed opracowaniem modelu. Głównymi biomarkerami były AFP oraz PIVKA-II. Rutynowymi kandydatami klinicznymi były: wiek, płeć, aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, albuminy, bilirubina całkowita, INR lub czas protrombinowy oraz liczba płytek krwi. Wartości AFP i PIVKA-II poddano transformacji logarytmicznej w naturalnej podstawie. Wartości poniżej granicy raportowania analizy zostały zastąpione połową dolnej granicy raportowania przed przeprowadzeniem transformacji.

Porównania jednowymiarowe między uczestnikami z HCC i bez HCC w kohorcie treningowej przeprowadzono za pomocą testów t dla próbek niezależnych w przypadku zmiennych o rozkładzie zbliżonym do normalnego, testów U Manna-Whitneya dla skośnych zmiennych ciągłych oraz testów χ2 lub dokładnych testów Fishera dla zmiennych kategorycznych. Zmienne z P < 0,10 w przesiewie jednowymiarowym zostały zakwalifikowane do modelowania wielowymiarowego. Multikolinearność oceniano za pomocą czynnika inflacji wariancji (VIF), przyjmując, że VIF > 5 świadczy o niepokojącej kolinearności. W przypadku silnej kolinearności dwóch zmiennych, zachowano tę, która charakteryzowała się bardziej przejrzystą interpretacją kliniczną i lepszym przyrostowymi wynikiem modelu.

Końcowy wieloczynnikowy model regresji logistycznej opracowano wyłącznie w kohorcie treningowej. Do modelu wymuszono wprowadzenie ln(AFP) oraz ln(PIVKA-II). Dodatkowe predyktory wybrano metodą eliminacji wstecznej w oparciu o kryterium informacyjne Akaike. Po selekcji wstecznej w modelu pozostały zmienne: ln(AFP), ln(PIVKA-II), wiek, płeć, albuminy, INR oraz liczba płytek krwi.

Opracowanie modelu i obliczanie wyniku ryzyka

Model diagnostyczny dopasowano za pomocą wieloczynnikowej regresji logistycznej, przyjmując status HCC jako binarny wynik. Przewidywane prawdopodobieństwo wystąpienia HCC obliczono z predyktora liniowego η przy użyciu następującego równania:

p(HCC)=1/[1+exp(-η)]

η = -4.862+0.247×ln(AFP)+0.712×ln(PIVKA-II)+0.018×age+0.331×sex-0.062×albumin+0.554×INR-0.004×plateletcount

Poziom AFP mierzono w ng/mL, PIVKA-II w mAU/mL, wiek w latach, płeć zakodowano jako kobieta = 0 i mężczyzna = 1, albuminy mierzono w g/L, INR był bezwymiarowy, a liczbę płytek krwi mierzono jako ×109/L. W przypadku AFP i PIVKA-II zastosowano logarytmy naturalne. Na podstawie tych samych dopasowanych współczynników opracowano nomogram. Do analizy charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), analizy kalibracji, analizy krzywej decyzyjnej oraz walidacji wykorzystano prawdopodobieństwo przewidywane, a nie skalę punktową nomogramu.

Definicje punktów odcięcia i obsługa progów

Progi PIVKA-II zostały określone zgodnie z celem analitycznym. Ustanowiony kliniczny punkt odcięcia dla PIVKA-II wynosił 40,0 mAU/mL. Punkt odcięcia Youdena dla PIVKA-II w kohorcie treningowej wynosił 45,0 mAU/mL. Punkt odcięcia o stałej swoistości wyznaczono poprzez wybór progu najbliższego 90% swoistości w kohorcie treningowej; w przypadku PIVKA-II wyniosło on 38,0 mAU/mL. Pozorny próg wynoszący 37,5 mAU/mL, uzyskany wyłącznie w procesie walidacji, potraktowano jako eksploracyjny i nie stosowano go jako głównego punktu odcięcia w walidacji.

W przypadku modelu łączonego podstawowy punkt odcięcia binarny został wyznaczony dla kohorty treningowej przy użyciu indeksu Youdena i zastosowany bez zmian do kohorty walidacyjnej. W celu zdefiniowania podgrupy AFP-ujemnej oraz do porównania z rutynową praktyką kliniczną wykorzystano ustalony kliniczny punkt odcięcia AFP wynoszący 20.0 ng/mL. Zoptymalizowane punkty odcięcia AFP zastosowane w analizie ROC zostały oznaczone oddzielnie od progu klinicznego. Punkty odcięcia raportowano zatem w zależności od celu analitycznego, zamiast traktować je jako progi zamienne.

Wydajność, kalibracja i walidacja modelu

Dyskryminację oceniano za pomocą krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) oraz powierzchni pod krzywą (AUC). Wartości AUC przedstawiono wraz z 95% przedziałami ufności. Do porównania wartości AUC zastosowano test DeLonga. Wydajność klasyfikacji raportowano jako czułość, swoistość, dodatnią wartość prognostyczną, ujemną wartość prognostyczną oraz dokładność przy określonych wcześniej punktach odcięcia.

Kalibrację oceniono za pomocą punktu przecięcia kalibracji, nachylenia kalibracji, wyniku Briera oraz testu dobroci dopasowania Hosmera-Lemeshow. Wykresy kalibracyjne pozwoliły porównać przewidywane i obserwowane prawdopodobieństwa HCC w poszczególnych grupach ryzyka. Walidacja wewnętrzna została przeprowadzona z użyciem 1 000 próbek bootstrapowych w kohorcie treningowej w celu oszacowania skorygowanego o optymizm AUC oraz skorygionego o optymizm nachylenia kalibracji. Kohorty walidacyjnej użyto wyłącznie do zewnętrznej oceny wydajności. W kohorcie walidacyjnej nie przeprowadzono aktualizacji współczynników, ponownego dopasowania modelu, ponownej optymalizacji progu ani rekalibracji opartej na podgrupach.

Użyteczność kliniczną oceniono za pomocą analizy krzywej decyzyjnej dla prawdopodobieństw progowych od 0,05 do 0,50. Porównano korzyść netto dla samego AFP, samego PIVKA-II, modelu zmiennych klinicznych oraz modelu połączonego.

Obsługa brakujących danych i analiza wrażliwości

W analizie podstawowej zastosowano modelowanie przypadków kompletnych dla uczestników, u których zachowano wszystkie zmienne w modelu końcowym. Wartości brakujące podsumowano dla każdego kandydata na predyktor. Jeśli odsetek braków przekroczył 5% dla któregokolwiek z zachowanych predyktorów, przeprowadzono wielokrotną imputację za pomocą równań łańcuchowych jako analizę czułości, wykorzystując w modelu imputacyjnym wynik, wszystkie zachowane predyktory oraz wskaźnik kohorty. Zmienne z odsetkiem braków przekraczającym 20% nie kwalifikowały się do modelowania wielowymiarowego. Współczynniki modelu, AUC, nachylenie kalibracji oraz wskaźniki klasyfikacji z analizy po imputacji porównano z wynikami dla przypadków kompletnych.

Oprogramowanie i reprodukowalne raportowanie

Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu programu R w wersji 4.3.2 oraz RStudio w wersji 2023.12.1. Regresję logistyczną wykonano za pomocą podstawowego pakietu stats. Analizę ROC oraz porównania DeLonga przeprowadzono przy użyciu pROC w wersji 1.18.5. Analizę kalibracji wykonano za pomocą rms w wersji 6.7-1 oraz ResourceSelection w wersji 0.3-6. Walidacja metodą bootstrapu wykorzystała 1 000 prób resamplingu z ustalonym ziarnem losowym 70558. Analizę krzywej decyzyjnej przeprowadzono przy użyciu rmda w wersji 1.6. W razie potrzeby imputację wielokrotną wykonano za pomocą mice w wersji 3.16.0. Skrypt analityczny odtworzył przepływ uczestników, współczynniki modelu, krzywe ROC, miary kalibracji, walidację bootstrapową, analizę krzywej decyzyjnej, analizy oparte na punktach odcięcia oraz tabele statystyczne.

Wyniki

Charakterystyka wyjściowa

Analiza końcowa objęła 389 uczestników. Grupa treningowa składała się z 205 uczestników, w tym 12 przypadków HCC potwierdzonych obrazowo oraz 93 kontroli nie-HCC. Grupa walidacyjna obejmowała 184 uczestników, w tym 58 przypadków HCC potwierdzonych obrazowo oraz 126 kontroli nie-HCC. Charakterystyka wyjściowa została podsumowana w Tabeli 1.

W kohorcie treningowej 93 kontrole bez HCC obejmowały 30 zdrowych ko...

Dyskusja

W niniejszym badaniu oceniono zintegrowaną strategię diagnostyczną HCC z wykorzystaniem PIVKA-II, AFP oraz rutynowych zmiennych klinicznych, zwracając szczególną uwagę na wczesne stadia choroby oraz przypadki AFP-ujemne¹⁴. W kohortach treningowej i walidacyjnej model łączony okazał się skuteczniejszy niż testowanie pojedynczych markerów. W kohorcie treningowej model łączony osiągnął wartość AUC wynoszącą 0,93, w porównaniu do 0,78 dla AFP i 0,85 dla PIVKA-II. W niezależnej kohorcie walidacyjnej mo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka do mikrocentryfugi 1,5 mL wolna od nukleaz	Eppendorf	30123328	Aliquotowanie i przechowywanie osocza
Kalibrator AFP	Roche Diagnostics	AFP CalSet II, 09227261190	Kalibracja AFP
Materiał do kontroli jakości AFP	Roche Diagnostics	PreciControl Tumor Marker, 11776452160	Kontrola jakości AFP
Materiał do kontroli jakości AFP	Roche Diagnostics	PreciControl Universal, 11731416160	Kontrola jakości AFP
Zestaw odczynników AFP	Roche Diagnostics	Elecsys AFP, 09015124190	Pomiar AFP
Zautomatyzowany analizator do elektrochemiluminescencyjnych testów immunoanalitycznych	Roche Diagnostics	cobas e 801	Pomiar AFP i PIVKA-II
Pakiet do kalibracji	R package	rms 6.7–1	Analiza kalibracyjna
Pakiet do analizy krzywych decyzyjnych	R package	rmda 1.6	Analiza krzywych decyzyjnych
Pakiet do testu Hosmera–Lemeshow	R package	ResourceSelection 0.3–6	Test Hosmera–Lemeshow
Probówka do pobierania krwi z K2-EDTA, 10 mL	BD	367525	Pobieranie krwi z żyły obwodowej
Pakiet do wielokrotnej imputacji	R package	mice 3.16.0	Wielokrotna imputacja
Zestaw odczynników PIVKA-II	Roche Diagnostics	Elecsys PIVKA-II, 08333629190/08333629500	Pomiar PIVKA-II
Wirówka chłodząca	Eppendorf	Centrifuge 5425 R	Separacja osocza
Pakiet do analizy ROC	R package	pROC 1.18.5	Analiza ROC i test DeLonga
Oprogramowanie statystyczne	R Foundation	R 4.3.2	Analiza statystyczna
Interfejs oprogramowania statystycznego	Posit Software	RStudio 2023.12.1	Analiza statystyczna