Badanie mechanizmu działania Guben Pingchuan Granule w leczeniu astmy oskrzelowej

Podsumowanie

Ten protokół bada mechanizm działania granulek Guben Pingchuan w astmie oskrzelowej z wykorzystaniem farmakologii sieciowej, dokowania molekularnego i in vivo weryfikacji.

Streszczenie

To badanie bada mechanizm działania granulek Guben Pingchuan w leczeniu astmy oskrzelowej z wykorzystaniem farmakologii sieciowej, dokowania molekularnego i walidacji eksperymentalnej. Aktywne składniki i odpowiadające im cele zidentyfikowano za pomocą baz danych TCMSP, HERB i SymMap. Cele związane z astmą oskrzelową zebrano z GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank i PharmGKB. Zidentyfikowano nakładające się cele oraz skonstruowano sieci interakcji składnik–cel i białko–białko (PPI). Przeprowadzono analizy wzbogacania Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) z korektą fałszywych odkryć (FDR). Dokowanie molekularne przeprowadzono w celu oceny powinowactwa wiązania, po czym nastąpiła walidacja in vivo. Zidentyfikowano łącznie 121 aktywnych składników i 234 cele związane z lekami, co dało 155 nakładających się celów. Do kluczowych celów należały TP53, AKT1, TNF i IL6. Analiza KEGG wykazała znaczące wzbogacenie szlaku PI3K–Akt, który został wybrany do walidacji eksperymentalnej. Dokowanie molekularne wykazało silne powinowactwo wiązania między kluczowymi składnikami i AKT1. U szczurów z astmą indukowaną owalbuminą, granulki Guben Pingchuan zmniejszyły poziom IL-4 i IL-10 w surowicy, zwiększyły ekspresję FoxP3 w tkance płucnej oraz uregulowane poziomy PI3K i AKT mRNA. Te wyniki wskazują, że granulki Guben Pingchuan łagodzą astmę oskrzelową poprzez modulacje szlaku sygnałowego PI3K–Akt, regulując cytokiny zapalne i zwiększając funkcję komórek T regulatorowych.

Wprowadzenie

Astma oskrzelowa jest niejednorodną przewlekłą chorobą układu oddechowego charakteryzującą się zapaleniem dróg oddechowych, nadreaktywnością dróg oddechowych, nadmiernym wydzielaniem śluzu i przebudową dróg oddechowych¹. Jego patogeneza obejmuje złożone interakcje między aktywacją komórek układu odpornościowego, mediatorami zapalnymi i wieloma szlakami sygnałowymi. Klinicznie, astma objawia się nawracającym świstaniem, dusznością, uciskiem w klatce piersiowej i kaszlem. Zapalenie dróg oddechowych jest centralnym mechanizmem leżącym u podstaw wystąpienia i rozwoju choroby, charakteryzującym się zwiększoną sekrecją prozapalnych cytokin, takich jak IL-6, IL-4, IL-17 i TNF-α, infiltracją komórek zapalnych, w tym eozynofilów i neutrofili, oraz zmianami strukturalnymi, takimi jak proliferacja mięśni gładkich dróg oddechowych, pogrubienie błony podstawnej i nadmierny wzrost gruczołów śluzowych^2˒3. Procesy patologiczne te prowadzą ostatecznie do niedrożności dróg oddechowych i upośledzenia przepływu powietrza.

Patofizjologia astmy jest regulowana przez wiele współdziałających ze sobą szlaków sygnałowych, a nie przez pojedynczy mechanizm. Szlak sygnałowy PI3K–Akt odgrywa kluczową rolę w modulowaniu równowagi odpornościowej, szczególnie osi Treg/Th17, regulując ekspresję FoxP3. Ten szlak również współdziała z szlakami sygnałowymi IL-17 i TNF w celu wzmocnienia reakcji zapalnych i przebudowy dróg oddechowych, co przyczynia się do zróżnicowania choroby i oporności na leczenie^3,4. Dane epidemiologiczne wskazują na ciągły wzrost światowej częstości występowania astmy, z ponad 358 milionami osób dotkniętych chorobą na całym świecie i około 45,7 milionami dorosłych pacjentów w Chinach^5,6. Obecne strategie leczenia opierają się głównie na stosowaniu wdechowych β₂-agonistów i glikokortykosteroidów; jednakże, terapie te są skierowane na ograniczone mechanizmy patologiczne i mogą prowadzić do działań niepożądanych oraz oporności na glikokortykosteroidy u niektórych pacjentów. Dysregulacja szlaków takich jak PI3K–Akt została związana ze zmniejszoną reaktywnością terapeutyczną, co podkreśla potrzebę wielocelowych podejść terapeutycznych^7,4.

Tradycyjna chińska medycyna (TCM) klasyfikuje astmę jako “Syndrom Xiao”, który jest związany z niedoborami w funkcji płuc, śledziony i nerek, w połączeniu z czynnikami chorobotwórczymi zewnętrznym. Preparaty TCM są szeroko stosowane w leczeniu astmy ze względu na ich wieloskładnikowe i wielocelowe cechy^8,9. W odróżnieniu od leków jednocząsteczkowych, związki TCM wywierają działanie terapeutyczne poprzez koordynowanie regulacji wielu ścieżek biologicznych, co zgadza się ze złożoną patofizjologią astmy¹⁰. Farmakologia sieciowa zapewnia podejście na poziomie systemowym do analizy interakcji między składnikami leku, celami i szlakami chorobowymi, umożliwiając identyfikację kluczowych składników bioaktywnych i mechanizmów molekularnych¹¹. Dokowanie molekularne uzupełnia to podejście poprzez ocenę pokrewności wiązania między małymi cząsteczkami a białkami docelowymi.

Guben Pingchuan granule to tradycyjny chiński preparat składający się z ośmiu składników ziołowych, w tym Ephedra sinica (Ephedra Herb), Psoralea corylifolia owoc, Prunus armeniaca nasiona (morela), Pseudostellaria heterophylla korzeń, Perilla frutescens owoc, Eriobotrya japonica liść (liść łopianu), Lilium brownii cebula i Epimedium brevicornum. Ten preparat jest tradycyjnie stosowany w celu wzmocnienia energii życiowej, rozluźnienia flegmy i łagodzenia świstu. Poprzednie badania kliniczne wykazały jego skuteczność terapeutyczną w astmie oskrzelowej, z wyższymi wskaźnikami odpowiedzi w porównaniu z konwencjonalnymi metodami leczenia¹².

Aby wyjaśnić podstawowy mechanizm działania, zastosowano zintegrowane podejście łączące farmakologię sieciową, dokowanie molekularne i in vivo walidację eksperymentalną. Farmakologia sieciowa jest wykorzystywana do identyfikacji aktywnych składników i potencjalnych celów związanych z astma oskrzelowa. Dokowanie molekularne jest stosowane do oceny interakcji między kluczowymi związkami a białkami docelowymi. Następnie przeprowadza się walidację eksperymentalną na modelu zwierzęcym w celu oceny efektów regulacyjnych na kluczowe szlaki sygnałowe, szczególnie na szlak PI3K–Akt. Podejście to ma na celu dostarczenie wglądu w mechanizmy wielocelowych efektów terapeutycznych Guben Pingchuan

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Animalnej Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (Numer zgody: 21000042023058) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Narzędzia badawcze użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Bazy danych i oprogramowanie

1. Dostęp do następujących baz danych i oprogramowania: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt i Cytoscape (wersja 3.9.1).

2. Uzyskanie celów składników

1. Pobierz składniki chemiczne z Ephedra Herb, nasion moreli, korzenia Pseudostellaria, owoców Perilla, liści śliwki, gatunków Lilium i Epimedium z bazy TCMSP¹³. Pobierz związki z Psoralea z baz HERB i SymMap.
2. Filtrowanie aktywnych związków przy użyciu biodostępności doustnej (OB ≥ 30%) i podobieństwa do leku (DL ≥ 0.18)^14,15.
3. Przewidywanie genów docelowych za pomocą TCMSP. Standardyzacja wszystkich docelowych za pomocą bazy UniProt poprzez wybranie Homo sapiens. Usuń duplikaty i nieważne cele, w tym wpisy nieludzkie, nieanotowane białka i przestarzałe identyfikatory.

3. Uzyskanie celów astmy oskrzelowej

1. Wyszukaj GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank i PharmGKB używając słowa kluczowego “astma oskrzelowa.” Ustaw wynik GeneCards na >4. Połącz wszystkie pobrane cele i usuń duplikaty.

4. Identyfikacja celów przecięcia

1. Zaimportuj cele leku i choroby do narzędzia online do analizy Venn. Zidentyfikuj nakładające się cele i zapisz całkowitą liczbę do dalszej analizy.

5. Budowa sieci składnik-cel

1. Zaimportuj cele przecięcia do Cytoscape 3.9.1. Zbuduj sieć składnik-cel. Dostosuj rozmiar węzłów i kolor w oparciu o wartości stopnia.

6. Budowa sieci oddziaływania białko-białko (PPI)

1. Przekaż cele przecięcia do bazy STRING. Wybierz Homo sapiens i ustaw wynik pewności na ≥0.900. Eksportuj sieć i zaimportuj ją do Cytoscape.
2. Oblicz parametry topologiczne (centralność stopnia, centralność międzycentrum i centralność bliskości). Zidentyfikuj główne cele używając progów mediany i stopnia >20.

7. Analiza wzbogacenia GO i KEGG

1. Przekaż nakładające się cele do bazy DAVID lub przeanalizuj za pomocą pakietu R clusterProfiler.
2. Przeprowadź analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) dla kategorii procesów biologicznych, składników komórkowych i funkcji molekularnych.
3. Przeprowadź analizę wzbogacenia ścieżek KEGG. Zastosuj korektę false discovery rate (FDR) i ustaw próg istotności na FDR < 0.05.
4. Zwizualizuj najbardziej wzbogacone terminy za pomocą wykresów prętowych lub wykresów bąbelkowych.

8. Dokowanie molekularne

1. Pobierz 2D struktury związków rdzeniowych z PubChem. Generuj struktury 3D za pomocą ChemOffice i zapisz jako pliki mol2.
2. Pobierz struktury białek z bazy RCSB PDB. Usuń cząsteczki wody i ligandy za pomocą PyMOL.
3. Przeprowadź dokowanie molekularne za pomocą AutoDock Vina. Zdefiniuj parametry pola siatki i uruchom symulacje dokowania.
4. Zapisz energię wiązania (kcal/mol) i kluczowe reszty interakcyjne. Wizualizuj wyniki dokowania za pomocą platform modelowania molekularnego, wizualizacji i symulacji.

9. Walidacja eksperymentalna

1. Zwierzęta
   1. Uzyskaj 48 samców szczurów Sprague–Dawley (9 tygodni, 220–240 g). Przetrzymuj zwierzęta w temperaturze 20–25 °C z wilgotnością 55%–60% w standardowych warunkach.
2. Leki i odczynniki
   1. Przygotuj granulki Guben Pingchuan składające się z Ephedra Herb, Psoralea, nasion moreli, korzenia Pseudostellaria, owoców Perilla, liści śliwki, Lilium i Epimedium.
   2. Przygotuj deksametazon, owalbuminę (OVA), wodorotlenek glinu, zestawy ELISA, zestawy do ekstrakcji RNA i przeciwciała, jak wymienione w Tabeli Materiałów.
3. Instrumenty
   1. Przygotuj standardowe wyposażenie laboratoryjne, w tym czytnik płytek, system elektroforetyczny, mikroton parowy i system obrazowania.
4. Grupowanie zwierząt i leczenie
   1. Losowo przypisz szczury do sześciu grup (n = 8): grupa kontrolna, grupa modelowa, grupa deksametazonu (0,3 mg/kg), grupa niskiej dawki leku chińskiego, grupa średniej dawki leku chińskiego i grupa wysokiej dawki leku chińskiego.
   2. W dniach 1, 7 i 14 podawaj 1 mL dootrzewnowej iniekcji 10% OVA + 10% Al(OH

Wyniki

Wykrywanie aktywnych składników
Po filtrowaniu aktywności docelowej z bazy TCMSP zidentyfikowano łącznie 121 aktywnych składników. Obejmowały one 23 składniki z Ephedra Herb, 7 z Psoralea, 19 z pestek moreli, 8 z Pseudostellaria korzenia, 16 z owoców Perilla, 18 z liści śliwek, 7 z Lilium oraz 23 z Epimedium. (Tabela 2). Zidentyfikowano szesnaście wspólnych składników, w tym luteolinę, kwercetynę, β-sitosterol, kaempferol, stigmasterol i...

Dyskusja

Astma oskrzelowa jest częstą chorobą w zakresie układu oddechowego¹⁶. Jest to zaburzenie przepływu powietrza powodowane przez alergeny i nadwrażliwość dróg oddechowych¹⁷. Ma wysoką częstość występowania w skali klinicznej, ma skłonność do nawrotów i jest trudne do wyleczenia, znacząco wpływając na zdrowie i jakość życia pacjentów. Według Globalnej Inicjatywy ds. Astmy (GINA) z 2025 roku terapia inhalowana glikokortykoidami jest skuteczna w leczeniu astmy^18...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Wykrywanie wyrażania mRNA genów docelowych
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Adiuwant immunologiczny wzmacniający odpowiedź immunologiczną na antygen
BCA protein Concentration Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 sztuk w pudełku	Ilościowe określenie białka do standaryzacji ładowania próbek
Chemiluminescence imaging system	Tanon	5200Multi	Zdjęcia pasm WB, zbieranie i analiza obrazów żeli i blotów
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Odniesienie masy cząsteczkowej białka do eksperymentów elektroforetycznych
Enhanced RNA Extraction Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 sztuk w pudełku	Ekstrakcja i oczyszczanie całkowitego RNA z tkanek i komórek
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Ilościowe wykrywanie cytokin i zawartości białka w próbkach
FOXP3 primary antibody	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/sztuka	Celowe wiązanie białka FOXP3 do immunoanalizy
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 zestawów	Szybkie przygotowanie żelu separacyjnego i żelu stosującego do elektroforezy
masson Staining Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 tabletek	Specyficznie barwienie włókien kolagenowych tkanek i obserwacja zwłóknienia
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Klasyczny alergen do tworzenia zwierzęcych modeli alergii
primary Antibody Dilution solution	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Rozcieńczanie przeciwciała pierwotnego, utrzymanie aktywności i zmniejszenie niespecyficznego wiązania
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	Ilościowe wykrywanie czynnika przeciwzapalnego IL-10 szczura
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	Ilościowe wykrywanie czynnika zapalnego IL-4 Th2 szczura
Reverse Transcription Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Odwrotna transkrypcja RNA na cDNA dla dalszej analizy genów
Saturated Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 butelka	Specyficzne barwienie i wykrywanie kropel lipidowych w tkankach
Shangyang Anti-Rabbit Secondary Antibody	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Wiązanie przeciwciała pierwotnego przeciw królikowi do reakcji kolorowej WB
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / butelka	Bufor do mycia membrany i rozcieńczania przeciwciał w Western blot
Transfer Electrophoresis System	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Używany do elektroforezy białek i transferu membrany Western blot
Ultra-low temperature refrigerator	Zhongke Meiling	MDF-382	Niskotemperaturowe krioprezerwacja reagentów, próbek białek i tkanek
Vertical electrophoresis tank	BIO-RAD	JY-ZY5	Pionowe elektroforetyczne separacja próbek białek i kwasów nukleinowych