Artykuł metodologiczny

System oparty na toksynach do selekcji ujemnej do usuwania genów bez markera i mutageneza z użyciem transpozonu Tn5 o wysokiej gęstości w Pectobacterium brasiliense

DOI:

10.3791/70567

⸱

9 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biocontrol, School of Agriculture and Biotechnology, Sun Yat-sen University, 2Potato Engineering ' Technology Research Center, Inner Mongolia University, 3Urumqi Experimental School, 4Department of Plant Pathology and Weed Research, Agricultural Research Organization-Volcani Institute, 5Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Vegetables and Flowers

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tu protokół do generowania nieoznakowanych delecji genów i konstruowania genomowych bibliotek mutantów z wstawieniami Tn5 u Pectobacterium brasiliense, fitopatogenu odpowiedzialnego za czarną nodze ziemniaka i miękkie gnicie. Podejście to umożliwia efektywną analizę genetyczną wsteczną i ułatwia charakterystykę funkcjonalną genów związanych z wirulencją w tym organizmie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pectobacterium brasiliense to bakteryjny patogen o wysokiej zdolności chorobotwórczej, odpowiedzialny za miękki zgnilizny bulw ziemniaka, czarną nogę i zgniliznę lotnych łodyg. Wyjaśnienie jego mechanizmów patogennych jest niezbędne dla kontroli chorób; jednakże narzędzia genetyczne dla tego organizmu pozostają ograniczone. Opracowano system przeciwwyborczy oparty na toksynie, aby umożliwić bezmarkerowe usuwanie genów i mutageneza transpozonową Tn5 o wysokiej gęstości. Toksyna vmi480 pochodząca z plazmidu pLP12 została użyta jako marker przeciwwyborczy do konstrukcji wektora samobójczego pKV2. Przy użyciu tego systemu, gen recA w szczepie P. brasiliense SM został pomyślnie usunięty. Powstały mutant recA posłużył jako szczep macierzysty do konstrukcji biblioteki wstawień Tn5 obejmującej ponad 12 000 mutantów poprzez koniugację z pomocniczym szczepem RHO3 przenoszącym pKV2-LLtnp. W tej pochodnej plazmidzie toksyna vmi480 została zastąpiona hiperaktywną transpozytą Tn5 pod kontrolą promotora lac skierowanego na zewnątrz, aby zmniejszyć efekty polarne. Wysoko-przepustowe testy inokulum bulw umożliwiły identyfikację mutantów o obniżonej zdolności chorobotwórczej, w tym wstawień w układzie sekrecji typu II, kluczowy determinant wirulencji, który pośredniczy w sekrecji enzymów rozkładających ściany komórkowe roślin. Ta platforma wspiera genomikę funkcjonalną i ułatwia badanie mechanizmów wirulencji tego ekonomicznie ważnego patogenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. brasiliense to jeden z najbardziej agresywnych gatunków w obrębie rodzaju Pectobacterium i jest przyczyną miękkiego gnicia ziemniaka, czarnej nogi i zgnilizny powietrznych łodyg1. Te choroby prowadzą do oszacowanych 30% strat plonu ziemniaka, uprawy klasyfikowanej jako trzecie co do ważności źródło żywności na świecie i kluczowy element chińskiego systemu produkcji rolniczej2. Pomimo swojego ekonomicznego wpływu, mechanizmy molekularne rządzące patogennością P. brasiliense pozostają niedostatecznie zrozumiane, głównie z powodu braku wydajnych i powtarzalnych narzędzi manipulacji genetycznej dla tego gatunku3,4,5.

Funkcjonalne badania genomowe wielu fitopatogennych bakterii opierają się na solidnych systemach wymiany alleli i mutageneza transpozonową; jednakże, porównywalne narzędzia genetyczne dla P. brasiliense pozostają ograniczone lub nieefektywne. W szczególności, skuteczne markery do wyboru wstecznego zgodne z tym gatunkiem są rzadkie. Podczas gdy gen sacB jest szeroko stosowany jako marker do wyboru wstecznego dla delecji genu w różnych bakteriach, P. brasiliense może wykazywać wysoką tolerancję do 50% sacharozy podczas procesu selekcji5. Ta tolerancja prawdopodobnie odzwierciedla brak wrażliwości na toksyny, być może z powodu enzymatycznej konwersji sacharozy na polimery cukru. Co więcej, wysokie stężenia sacharozy mogą wywoływać szkodliwy szok osmotyczny6. Dodatkowo, wydajne metody mutagenezy na dużą skalę, takie jak budowa biblioteki wstawień transpozonu Tn5, nie zostały jeszcze dobrze ustalone dla tego organizmu.

Aby zaadresować te ograniczenia techniczne, opracowano system wyboru wstecznego oparty na toksynie i ustalono solidny przepływ pracy do badania mutagenezy Tn5 dla P. brasiliense. W porównaniu do tradycyjnych metod opartych na sacharozie, toksyna-bazowane podejście oferuje wyraźne zalety, w tym zwiększoną rygorystyczność selekcji, poprawioną specyficzność w identyfikacji zdarzeń podwójnego krzyżowania i eliminację mylącego stresu osmotycznego. Podobne systemy oparte na toksynie-antytoksynie vmi480 zostały pomyślnie zaimplementowane w celu pokonania barier selekcyjnych w gatunkach Vibrio7. Ustalone metody są bardzo przydatne do przepływowego funkcjonalnego charakteryzowania nieznanych genów i zapewniają wszechstronną platformę, która może być dostosowana do innych pokrewnych miękkich gnijących Pectobacteriaceae.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie mutanta delecji recA bez markera w P. brasiliense

  1. Wyodrębnij genomowe DNA z P. brasiliense SM i plazmidu pKV2 (pLP12 pochodzącego z modyfikacją markera selekcji antybiotyków i wielomoleczulowego miejsca klonowania) z szczepu dawcy E. coli za pomocą standardowych procedur przygotowania DNA.
  2. Zweryfikuj jakość i stężenie wyodrębnionego genomowego DNA i DNA plazmidowego za pomocą elektroforezy na żelu agarozy i spektrofotometrii NanoDrop.
  3. Linearyzuj plazmid pKV2 przez podwójne trawienie EcoRI i NheI w 37 °C przez 5 h. Zweryfikuj pełne trawienie za pomocą elektroforezy na żelu agarozy i oczyść linearyzowany plazmid.
  4. Zidentyfikuj ok. 800 bp regionów znajdujących się powyżej i poniżej genu recA za pomocą oprogramowania do analizy genomu i zaprojektuj odpowiednie pary primerów LBF/LBR i RBF/RBR (Zobacz Tabela materiałów dla wszystkich primerów użytych w tym badaniu).
  5. Wzmacniaj oba homologiczne ramiona w standardowych warunkach cyklu PCR i oczyszczaj produkty PCR. Typowy 50 μL PCR daje 2,5 μg produktu.
    UWAGA: Wartości Tm i zawartość GC primerów można dostosować poprzez modyfikację granic homologicznych regionów.
  6. Skonstruuj rekombinowany plazmid samobójczy pKV2-recA używając zestawu do asambli DNA poprzez ligację oczyszczonych homologicznych ramion z linearyzowanym grzbietem plazmidowym.
  7. Przekształć mieszaninę asambli do chemicznie kompetentnych komórek E. coli S17-1 λpir przez szok cieplny, odzyskaj komórki w pożywce LB i zasiej na agarze LB zawierającej kanamycinę (LB + kan).
  8. UWAGA: Stosowane końcowe stężenia to 50 mg/mL kanamyciny, 0,2% (w/v) glukozy, 0,3% (w/v) arabinozy i 0,3 mM 2,6-diaminopimelinowej kwasu (DAP).
  9. Waliduj pozytywne klony przez trawienie restrykcyjne lub PCR z kolonii. (Zobacz Tabela materiałów dla wszystkich receptur pożywek użytych w tym badaniu).
  10. Wydobądź potwierdzony plazmid pKV2-recA i przekształć go do E. coli WM3064 używając transformacji przez szok cieplny (oczekiwana częstotliwość transformacji > 106 cfu/µg).
  11. Wybierz transformanty na agarze LB zawierającym kanamycinę i diaminopimelinowy kwas (DAP).
  12. Przeprowadź koniugację dwurodzicielską poprzez zmieszanie kultur przechowywanych przez noc szczepu dawcy (WM3064 pKV2-recA) i odbiorczego P. brasiliense SM w proporcji 1:1 (v/v), co zazwyczaj daje 104 do 106 transkonjugantów na mililitr komórek dawcy i odbiorcy.
  13. Przepłucz zmieszany kulturę raz sterylną wodą, nanieś mieszaninę na agar LB uzupełniony kanamyciną i DAP i inkubauj w 28 °C przez 48-72 h.
    UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się transkonjugantów, stosunek dawca do odbiorcy można zwiększyć do 2:1 (v/v) aby poprawić efektywność koniugacji. Jeśli zaobserwuje się wysokie tło wzrostu, można usunąć resztki DAP poprzez dwa przepłukiwania zmieszanyej kultury sterylną wodą.
  14. Odzyskaj mieszaninę koniugacyjną i zasiej na agarze LB zawierającym kanamycinę i glukozę (bez DAP) do kontrselekcji.
  15. Zbierz 6-8 kolonii i przeprowadź ich replica-plate na agarze LB + kan i LB + kan + arabinoza.
  16. Wybierz kolonie, które rosną na LB + kan, ale nie rosną na LB + kan + arabinoza; są to kandydaci na pierwsze skrzyżowanie.
  17. Zaszczep potwierdzone szczepy pierwszego skrzyżowania do pożywki LB i inkubauj przez noc. Zasiej kultury na agarze LB zawierającym L-arabinozę aby wywołać drugą rekombinację homologiczną.
  18. Zbierz kilka kolonii i przeprowadź ich replica-plate na LB + arabinoza i LB + kan. Wybierz kolonie, które rosną na LB + arabinoza, ale nie na LB + kan; są to domniemane mutanty delecji recA.
    UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się żadnych kolonii po drugim skrzyżowaniu, należy ocenić potencjalną esencjalność docelowego genu dla wzrostu bakterii. Alternatywnie, regiony homologiczne powyżej i poniżej mogą być wydłużone do 1200 bp aby zwiększyć efektywność rekombinacji homologicznej.
  19. Potwierdź mutanty recA za pomocą PCR z kolonii używając pary primerów checkF/checkR zaprojektowanych do wzmacniania regionów promotora i terminatora genu recA aby zweryfikować usunięcie in-frame docelowego genu. Sekwencjonuj produkt PCR aby potwierdzić precyzyjne usunięcie in-frame recA.
  20. Sukces usunięcia jest wskazany przez zmniejszenie wielkości produktu PCR, która powinna odpowiadać długości fragmentu dzikiego typu minus określona długość usuniętego segmentu genu.

2. Budowa pKV2-LLtnp do mutagenezy Tn5 w P. brasiliense

  1. Wzmacnij kasetę transpozycji Tnp

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przezwyciężyć niestabilność spowodowana mutacją sucB w P. brasiliense, toksynę vmi480 z plazmidu pLP12 zastosowano jako marker do przeciwdziałania selekcji, a zmodyfikowany wektor samobójczy pKV2 (Rysunek 1A) skonstruowano poprzez zastąpienie kasety odporności na antybiotyki i dostosowanie konfiguracji miejsca klonowania. Aby wygenerować mutanta z delecją recA bez markera, ~800 bp lewe i prawe homologiczne ramiona genu recA sklonowano do pKV2, po czym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia manipulacji genetycznej opracowana w tym badaniu zapewnia opcję funkcjonalnej genomiki w P. brasiliense, głównym patogenie miękkiego gnicia ziemniaka9,10. Poprzez zintegrowanie systemu kontraselekcji opartego na toksyny w szkielet plasmidowy typu suicide, wygenerowano mutanta bez markera ΔrecA. To podejście oferuje znaczne zalety w porównaniu z tradycyjnymi systemami opartymi na sacB; podczas gdy sacB często daje wyso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło było wspierane przez Narodowe Fundacje Nauk Przyrodniczych Chin (32472504 i 32561143029 dla X.Z. oraz 32201914 dla J.W.), Fundację Badań Podstawowych i Stosowane Zasady Badań Guangdong (2024A1515012708 dla X.Z.), Fundację Nauk Przyrodniczych Wewnętrznej Mongolii (2024QN03044 dla U.H.) oraz Program Talentów Rzeki Perłowej (2021QN02N151 dla X.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacterial genomic DNA extraction kitExtract bacterial genomic DNATiangenDP302-02
Diaminopimelic acid0.3 mM in 1 L mediumMacklinD836611-5g
DNA assembly kitDNA assemblyVazymeC116-02
DNA purification kitDNA purificationTiangenDP214-02
Kanamycin50 mg/mLAladdinK103025-25g
Glucose0.2% (w/v)AladdinG116305-250mg
Tryptone10% in 1 L mediumOXOIDLP0042B
Yeast Extract5% in 1 L mediumOXOIDLP0021B
NaCl10% in 1 L mediumBiofroxx1249KG001
Agar15% in 1 L mediumBiofroxx8211GR500
L-arabinose0.3% (w/v)AladdinA106196-25g
Plasmid Miniprep kitExtract plasmidTiangenDP103-02
EcoRIRestriction endonucleaseYugong BiotechEG15536
NheIRestriction endonucleaseYugong BiotechEG15552
HindIIIRestriction endonucleaseYugong BiotechEG15539
T4 DNA ligaseLinear DNA self-circularizationYugong BiotechEG15205
CentrifugeRWDM1324R
PCR Thermal CyclerBIO-GENERGET3XG
Digital cameraSONYILCE-7M4
Electrophoresis systemLYDYY-6C
Water bathJOANLABWB100-1F
Gel documentation systemThermo Fisher ScientificiBright CL750
AutoclaveYamatoSQ510C
Shaking incubatorZHICHUZQZY-AR8
Constant temperature incubatorZQDHP-9272
NanoDropThermo Fisher ScientificLite Plus
UV-Vis spectrophotometerHITACHIU-3900
ElectroporatorBIO-RADMicroPulser
Strains and plasmids
P. brasiliense SMPotato pathogenic bacteriaLaboratory strain collection
E. coli S17-1 λpirE. coli competent cellsWEIDIDL2010S
E. coli WM3064E. coli competent cellsBIO SCI BIOC1039
E. coli RHO3E. coli competent cellsLaboratory strain collection
pKV2The modified suicide plasmid Constructed in this study
pLP12suicide plasmidLaboratory strain collection
pMCS2-LLtnpProvide the fragment carrying Tn5Laboratory strain collection
pKV2-LLtnpThe modified plasmid carrying the Tn5 fragment.Constructed in this study
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)Customized
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)Customized
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)Customized
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)Customized
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)Customized
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)Customized
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)Customized
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)Customized
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)Customized
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)Customized
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)Customized

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martínez-Prada, M. D. M., Curtin, S. J., Gutiérrez-González, J. J. Potato improvement through genetic engineering. GM Crops Food. 12 (1), 479-496 (2021).
  2. Wang, N., Reidsma, P., Pronk, A. A., de Wit, A. J. W., van Ittersum, M. K. Can potato add to China’s food self-sufficiency? The scope for increasing potato production in China. Eur J Agron. 101, 20-29 (2018).
  3. Sun, Y., et al. Comparative genomic and transcriptome analyses of two Pectobacterium brasiliense strains revealed distinct virulence determinants and phenotypic features. Front Microbiol. 15, (2024).
  4. Liu, Y., Filiatrault, M. J. Complete genome sequence of the necrotrophic plant-pathogenic bacterium Pectobacterium brasiliense 1692. Microbiol Resour Announc. 9 (12), e00037-20(2020).
  5. Moleleki, L. N., Pretorius, R. G., Tanui, C. K., Mosina, G., Theron, J. A quorum sensing-defective mutant of Pectobacterium carotovorum ssp. brasiliense 1692 is attenuated in virulence and unable to occlude xylem tissue of susceptible potato plant stems. Mol Plant Pathol. 18 (1), 32-44 (2017).
  6. Polyudova, T., Eroshenko, D., Korobov, V. The effect of sucrose-induced osmotic stress on the sensitivity of Escherichia coli to bacteriocins. Can J Microbiol. 65 (12), 895-903 (2019).
  7. Luo, P., He, X., Liu, Q., Hu, C. Developing universal genetic tools for rapid and efficient deletion mutation in Vibrio species based on suicide T-vectors carrying a novel counterselectable marker, vmi480. PLoS One. 10 (12), e0144465(2015).
  8. Lv, W., et al. Essential gene dynamics across distinct growth conditions in Xanthomonas citri. Hortic Res. 12 (9), uhaf160(2025).
  9. Toth, I. K., Bell, K. S., Holeva, M. C., Birch, P. R. J. Soft rot erwiniae: from genes to genomes. Mol Plant Pathol. 4 (1), 17-30 (2003).
  10. Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (6), 614(2012).
  11. Pineau, C., et al. Structure-function analysis of pectate lyase Pel3 reveals essential facets of protein recognition by the bacterial type II secretion system. J Biol Chem. 296, 100305(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wektor samob jczydelecja genu RecAbiblioteka insercji transpozon wsekrecja typu IImechanizmy wirulencjigenomika funkcjonalna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły