System oparty na toksynach do selekcji ujemnej do usuwania genów bez markera i mutageneza z użyciem transpozonu Tn5 o wysokiej gęstości w Pectobacterium brasiliense

Bin Xie; Minghua Xie; Utpal Handique; Yulu Zhang; Doron Teper; Lei Li; Jian Wu; Xiaofeng Zhou

doi:10.3791/70567

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

System oparty na toksynach do selekcji ujemnej do usuwania genów bez markera i mutageneza z użyciem transpozonu Tn5 o wysokiej gęstości w Pectobacterium brasiliense

251 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70567

⸱

9 czerwca 2026

Bin Xie^*¹^,² , Minghua Xie^*² , Utpal Handique² , Yulu Zhang³ , Doron Teper⁴ , Lei Li⁵ , Jian Wu² , Xiaofeng Zhou¹

¹State Key Laboratory of Biocontrol, School of Agriculture and Biotechnology, Sun Yat-sen University, ²Potato Engineering ' Technology Research Center, Inner Mongolia University, ³Urumqi Experimental School, ⁴Department of Plant Pathology and Weed Research, Agricultural Research Organization-Volcani Institute, ⁵Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Vegetables and Flowers

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tu protokół do generowania nieoznakowanych delecji genów i konstruowania genomowych bibliotek mutantów z wstawieniami Tn5 u Pectobacterium brasiliense, fitopatogenu odpowiedzialnego za czarną nodze ziemniaka i miękkie gnicie. Podejście to umożliwia efektywną analizę genetyczną wsteczną i ułatwia charakterystykę funkcjonalną genów związanych z wirulencją w tym organizmie.

Streszczenie

Pectobacterium brasiliense to bakteryjny patogen o wysokiej zdolności chorobotwórczej, odpowiedzialny za miękki zgnilizny bulw ziemniaka, czarną nogę i zgniliznę lotnych łodyg. Wyjaśnienie jego mechanizmów patogennych jest niezbędne dla kontroli chorób; jednakże narzędzia genetyczne dla tego organizmu pozostają ograniczone. Opracowano system przeciwwyborczy oparty na toksynie, aby umożliwić bezmarkerowe usuwanie genów i mutageneza transpozonową Tn5 o wysokiej gęstości. Toksyna vmi480 pochodząca z plazmidu pLP12 została użyta jako marker przeciwwyborczy do konstrukcji wektora samobójczego pKV2. Przy użyciu tego systemu, gen recA w szczepie P. brasiliense SM został pomyślnie usunięty. Powstały mutant recA posłużył jako szczep macierzysty do konstrukcji biblioteki wstawień Tn5 obejmującej ponad 12 000 mutantów poprzez koniugację z pomocniczym szczepem RHO3 przenoszącym pKV2-LLtnp. W tej pochodnej plazmidzie toksyna vmi480 została zastąpiona hiperaktywną transpozytą Tn5 pod kontrolą promotora lac skierowanego na zewnątrz, aby zmniejszyć efekty polarne. Wysoko-przepustowe testy inokulum bulw umożliwiły identyfikację mutantów o obniżonej zdolności chorobotwórczej, w tym wstawień w układzie sekrecji typu II, kluczowy determinant wirulencji, który pośredniczy w sekrecji enzymów rozkładających ściany komórkowe roślin. Ta platforma wspiera genomikę funkcjonalną i ułatwia badanie mechanizmów wirulencji tego ekonomicznie ważnego patogenu.

Wprowadzenie

P. brasiliense to jeden z najbardziej agresywnych gatunków w obrębie rodzaju Pectobacterium i jest przyczyną miękkiego gnicia ziemniaka, czarnej nogi i zgnilizny powietrznych łodyg¹. Te choroby prowadzą do oszacowanych 30% strat plonu ziemniaka, uprawy klasyfikowanej jako trzecie co do ważności źródło żywności na świecie i kluczowy element chińskiego systemu produkcji rolniczej². Pomimo swojego ekonomicznego wpływu, mechanizmy molekularne rządzące patogennością P. brasiliense pozostają niedostatecznie zrozumiane, głównie z powodu braku wydajnych i powtarzalnych narzędzi manipulacji genetycznej ....