Artykuł metodologiczny

System in vitro do stosowania siły rozciągającej na komórki macierzyste szkieletu za pomocą cyklicznego systemu naprężeń komórkowych

47 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70570

⸱

12 czerwca 2026

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki macierzyste tkanki łącznej oponowo-szkieletowej myszy (SSC) zostały wyizolowane metodą FACS i hodowane in vitro. Ustanowiono kontrolowalny system eksperymentalny, aby zastosować cykliczne napięcie mechaniczne do SSC, co skutkowało zmniejszeniem ekspresji genów związanych z starzeniem komórek, szczególnie p16 i p21.

Streszczenie

Kość jest głównym narządem mechanoczułym, który ciągle reaguje na sygnały fizyczne w organizmie. Chociaż stymulacja mechaniczna odgrywa ważną rolę w rozwoju szkieletu, homeostazie i naprawie uszkodzeń, konkretne reakcje komórek macierzystych szkieletu (SSC) na stres mechaniczny pozostają niedokładnie poznane. Aby odpowiedzieć na to pytanie, stworzyliśmy in vitro model, aby odizolować mysie komórki periostealne SSC i zastosować stymulację mechaniczną. Mysie komórki periostealne zostały najpierw uzyskane przez enzymatyczne trawienie, a SSC zostały następnie izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS) na podstawie ustalonych markerów powierzchniowych. Po przyczepieniu do kultury, SSC były poddawane rozciągawczej stymulacji mechanicznej za pomocą cyklicznego systemu naprężeniowego komórek. Ten system umożliwia powtarzalne stosowanie siły rozciągającej na hodowane komórki i zapewnia platformę do analizy reakcji SSC na impulsy mechaniczne. Stosując to podejście, odkryliśmy, że ekspresja genów związanych z starzeniem komórkowym p16 i p21 była znacznie zmniejszona w SSC po stymulacji mechanicznej. Te wyniki sugerują, że stymulacja rozciągająca może wpływać na zmiany związane ze starzeniem w SSC w warunkach in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół zapewnia przydatną i odpowiednią platformę do badania zachowania SSC w warunkach stymulacji mechanicznej oraz do badania, jak impulsy mechaniczne wpływają na funkcjonowanie SSC.

Wprowadzenie

Jako największy i najważniejszy narząd wspierający w ludzkim ciele, układ kostny nie tylko zapewnia miejsca do przyczepienia i ochronę innych narządów, ale służy również jako fundament dla funkcji motorycznych. Dlatego układ kostny jest ciągle narażony na różne bodźce mechaniczne z zarówno środowiska wewnętrznego, jak i zewnętrznego. Sygnały stymulacji mechanicznej są równie ważne dla rozwoju kości i utrzymania ich funkcji. Już w 1893 roku zasugerowano, że istnieje pewna pozytywna korelacja między gęstością kości a siłą mechaniczną, którą kości przenoszą, co jest znane jako prawo Wolffa1. W ostatnich latach niektóre badania wykazały znaczenie obciążeń mechanicznych na układ kostny dla normalnego rozwoju kości2,3,4,5. Reakcja układu kostnego na bodźce mechaniczne częściowo zależy od komponentów komórkowych w kości6. Osteocyty stanowią 85% do 90% komponentów komórkowych w układzie kostnym. Ze względu na ich szerokie rozmieszczenie i unikalną morfologię komórek dendrytycznych, osteocyty są obecnie najdokładniej badanym typem komórek szkieletu pod względem reakcji mechanicznych7,8. Oprócz powszechnie znanej zdolności osteocytów do reagowania na bodźce mechaniczne, nieodzowną rolę pełnią również komórki prekursorowe szkieletu. Stwierdzono, że reakcja prekursorów pochewki kostnej na sygnały mechaniczne reguluje ich transformację losu, wpływając tym samym na naprawę uszkodzeń tkankowych9.

Komórki macierzyste układu kostnego (SSC) to rodzaj komórek macierzystych o specyficznej dla tkanki zdolności do samoregeneracji, które mogą różnicować się w dojrzałe typy komórek kostnych niezbędne do wzrostu, utrzymania i naprawy kości. W 2015 roku zidentyfikowano geny markerów powierzchniowych dla mysich komórek SSC10. Następnie wiele badań wykazało również, że SSC odgrywają bardzo ważną rolę w różnych aspektach takich jak rozwój kości, utrzymanie homeostazy i naprawa urazów kostnych11,12. Ze względu na charakterystykę układu kostnego reagującego na bodźce mechaniczne, możemy uznać sygnały sił mechanicznych za niezbędny czynnik regulujący funkcję komórek macierzystych szkieletu. Aby badać zmiany zachowań SSC pod wpływem stymulacji mechanicznej, musimy stworzyć odpowiedni system eksperymentalny do stosowania sił mechanicznych in vitro.

Główne metody stymulacji mechanicznej in vitro dla komórek obejmują stres ścinający płynu, stres ściskający, siłę rozciągającą, ciśnienie hydrostatyczne, sztywność matrycy i topologię matrycy6,13. Na podstawie genów markerów powierzchniowych mysich SSC, uzyskano mysie periostealne SSC poprzez sortowanie cytometrią przepływową, ponieważ SSC zaangażowane w gojenie złamań pochodzą głównie z pochewki kostnej14. Następnie odpowiednia siła rozciągająca została zastosowana do periostealnych SSC poprzez cykliczny system naprężeń komórkowych. Po stymulacji siłą rozciągającą można uzyskać próbki komórek, a następnie przeprowadzić analizy multi-omics, w tym sekwencjonowanie transkryptomu, proteomu i ATAC-seq. Dlatego ustanowienie tego protokołu zapewnia solidną podstawę do badania reakcji SSC na stymulację mechaniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Doświadczenia na myszach w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania ich w Badaniach Instytutu Biochemii i Biologii Komórki w Szanghaju, Chińskiej Akademii Nauk (SIBCB-S350-2312-41).

1. Izolowanie komórek osteogennych u myszy

  1. Umieść myszy w wieku 4-6 tygodni w pudełku do eutanazji CO₂ i wystawiaj je na działanie CO₂ przez 3 min, aż zatrzyma się oddychanie.
  2. Dezynfekuj powierzchnię ciała myszy 75% alkoholem. Użyj nożyczek okulistycznych, aby oddzielić tylne kończyny. Następnie za pomocą spiczastych kleszczy i nożyczek okulistycznych usuń mięśnie szkieletowe z tylnych kończyn, upewniając się, że regiony stawów kości udowej i piszczelowej pozostają nienaruszone.
  3. Zapisz izolowanych kości w schłodzonym buforze PBS, a następnie pokryj oba końce kości niskotopliwą agarose (5-10% w buforze TAE).
  4. Traw kości udowe i piszczelowe w minimalnym środowisku podstawowym alfa (α-MEM) zawierającym 1 mg/mL kolagenazy, 2 mg/mL dispazy II i 0,1 mg/mL DNazę I w 37°C i 0,3 x g przez 30 min dwa razy. Zebrane komórki trawne umieść w środowisku hodowli (α-MEM + 10% surowica płodowa bydła (FBS)).
  5. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko komórkowe 40 μm, a następnie wyśrodkuj przez 5 min przy 500 x g, aby usunąć nadstan.
  6. Resuspenduj osad komórek w buforze lizy krwinek czerwonych przez 2 min i zakończ reakcję buforem do cytometrii przepływowej (PBS + 2% FBS).
  7. Wyśrodkuj komórki przy 500 x g przez 5 min i wyrzuć nadstan. Resuspenduj komórki w buforze do cytometrii przepływowej w stężeniu 1 x 107 komórek/mL w celu sortowania komórek.

2. Sortowanie komórek z aktywacją fluorescencji

  1. Zbarw komórkową zawiesinę następującymi przeciwciałami: PerCP/Cy5.5-koniugowane przeciwciała przeciwko CD45 myszy, PerCP/Cy5.5-koniugowane przeciwciała przeciwko CD31 myszy, PerCP/Cy5.5-koniugowane przeciwciała przeciwko Ter119 myszy, FITC-koniugowane przeciwciała przeciwko 6C3/Ly-51 myszy, przeciwciała Brilliant Violet 605 koniugowane przeciwko CD90.2 myszy, przeciwciała PE/Cy7 koniugowane przeciwko CD105 myszy, przeciwciała APC koniugowane przeciwko CD200 myszy.
  2. Rozcieńcz wyżej wymienione przeciwciała w proporcji 1:500 i inkubaj je na lodzie przez 30 min, chroniąc przed światłem.
  3. Spłucz komórki buforem do cytometrii przepływowej i przeprowadź sortowanie komórek za pomocą sortera komórek z aktywacją fluorescencji, aby uzyskać CD45- CD31- Ter119- CD90.2- 6C3- CD105- CD200+ SSCs. Zebrane SSCs zebraj w środowisku hodowli. Przeanalizuj zebrane dane za pomocą oprogramowania FlowJo v10.8.1.
  4. Rozwijaj posortowanych SSCs w naczyniach hodowlanych z środowiskiem rozwojowym w inkubatorze komórkowym z 5% CO2. Przed stymulacją mechaniczną można wykonać jedno przetoczenie.
    UWAGA: Z każdej pary 6-tygodniowych myszy można uzyskać około 1 x 105 osteogennych SSCs.

3. Stymulowanie mechaniczne SSCs

  1. Rozcieńcz kolagen typu I z ogona szczura w wysterylizowanym 0,02 M kwasie octowym do końcowej koncentracji 0,15 mg/mL. Ten roztwór można ponownie wykorzystać 3 razy i należy przechowywać w 4 °C.
  2. Dodaj 1,5 ml rozcieńczonego kolagenu typu I z ogona szczura do każdej komórki 6-dołkowego płytki hodowlanej z elastycznym dnem. Po pokryciu płytek przez 1 h w temperaturze pokojowej, aspiruj nadmiar kolagenu i wypłucz płytki raz PBS na dalsze użycie.
  3. UWAGA: Do natychmiastowego użycia płytkę należy przepłukać PBS, aby usunąć wszelkie resztki kwasu. Przed przechowywaniem w 4 °C płytkę należy całkowicie osuszyć, usuwając pokrywkę.
  4. Traw hodowane mysie osteogenne SSCs, wyśrodkuj przy 500 x g przez 5 min, resuspenduj osad komórek w środowisku hodowli, aby osiągnąć gęstość komórek 1 x 105 komórek/mL, dodaj 2 mL zawiesiny komórek do każdej komórki 6-dołkowego płytki hodowlanej z elastycznym dnem i umieść w inkubatorze komórkowym.
  5. 24 godziny po posadzeniu komórek, umieść płytkę hodowlaną z elastycznym dnem w podstawie rozciąganej i pozostaw inną płytkę hodowlaną z elastycznym dnem jako grupę kontrolną bez stymulacji siłą mechaniczną.
  6. Ustaw parametry w oprogramowaniu FX-6000 Wersja 1.0 w następujący sposób: Siła rozciągania 8%, częs

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zastosowaniu tego protokołu, udało się zastosować siłę ściągającą do kostno-okostnych komórek macierzystych myszy. Po pierwsze, komórki SSC zostały uzyskane z okostnej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki cytometrii przepływowej wykazały, że proporcja komórek SSC w okostnej stanowiła prawie 30% Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2- 6C3- (Rysunek 1), co było znacznie wyższe niż w szpiku kostnym. Biorąc p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich latach ciągle odkrywa się geny markerów komórek macierzystych tkanki kostnej z różnych części kości11,12,17. Jednak badania nad bezpośrednim regulowaniem funkcji KSK nadal wymagają pogłębienia, szczególnie w kwestii regulacji mechanicznej stymulacji sił. Jak dotąd badania nad mechanicznymi efektami regulacyjnymi komórek macierzystych tkanki kostnej/przedkomórek opierają się głównie na konstrukcji modeli mysich z noka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych rywalizacji interesów.

Podziękowania

Dziękujemy centrum za cytometrię przepływową oraz centrum dla zwierząt Instytutu Biochemii i Biologii Komórki w Szanghaju, Chińskiej Akademii Nauk. Praca była wspierana przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (32471190, 82502903) oraz Program dla Zagranicznych Ekspertów Prowincji Hajnan (506068033010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-MEMCorning10-022-CVIzolacja komórek oponowo-kostnych
APC anti-mouse CD200BioLegend123809Sortowanie SSC
BioFlex 6-Well Culture Plate FlexcellBF-3001AHodowla komórek
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317Sortowanie SSC
CollagenaseSigmaC0130Izolacja komórek oponowo-kostnych
Dispase IISigmaD4693Izolacja komórek oponowo-kostnych
DNase ISigmaDN25Izolacja komórek oponowo-kostnych
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701Sortowanie SSC
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305Sortowanie SSC
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 Naprężenie komórki
Flow Cytometry SorterBDBD FACSAria FusionSortowanie SSC
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513Hodowla komórek
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409Sortowanie SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522Sortowanie SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132Sortowanie SSC
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228Sortowanie SSC
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236Hodowla komórek
real-time PCR systemThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 red blood cell lysis buffer Beyotime C3702Izolacja komórek oponowo-kostnych
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022WesterBlot
 RIPA Lysis Buffer ISangon BiotechNO. C500005WesterBlot
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling Technology9102WesterBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370WesterBlot

Bibliografia

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

stymulacja mechanicznamodel in vitrokom rki okostnowesortowanie kom reksortowanie aktywowane fluorescencjstarzenie kom rkowemarkery powierzchniowe

Powiązane artykuły