Protokół Focus Stacking do fotografii owadów w wysokiej rozdzielczości

Summary

Celem jest zaoferowanie dostępnej, standaryzowanej metody stackowania ostrości do fotografii owadów, wykorzystując przystępny sprzęt do tworzenia ostrych, wysokorozdzielczych obrazów do taksonomii, badań bioróżnorodności, badań ekologicznych oraz działań społecznych.

Abstract

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości i rozszerzonej głębi ostrości okazów owadów poprzez fotograficzne stackowanie z użyciem modularnego systemu cyfrowego obrazowania. Metoda ta zapewnia ustandaryzowany przepływ pracy łączący montaż, kalibrację, akwizycję obrazów oraz obróbkę postprodukcji. Wykorzystując pełnoklatkowy aparat bezlusterkowy (61 MP) sprzężony z obiektywami mikroskopowymi i zsynchronizowanym oświetleniem stroboskopowym, protokół osiąga skale pikseli od 0,76 m do 0,19 m i generuje kompozyty wolne od artefaktów poprzez przyrosty ostrości poniżej mikrona (0,2 m). Procedura ta pozwala wykonać i przetworzyć około 20 końcowych obrazów tygodniowo w rutynowych warunkach laboratoryjnych. W porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami stackingowymi, ten niskokosztowy hybrydowy system (< 30% kosztów systemów komercyjnych) maksymalizuje dostępność, jednocześnie utrzymując jakość obrazu o ograniczonym dyfrakcyjnym poziomie. Reprezentatywne zastosowania obejmują produkcję kolorowych tablic identyfikacyjnych do taksonomii, cyfryzację bioróżnorodności oraz popularyzację. Ustandaryzowana struktura protokołu ułatwia powtarzalność w laboratoriach i stacjach terenowych, wspierając szeroko zakrojone kampanie obrazowania owadów zarówno w środowiskach ograniczonych zasobów, jak i instytucjonalnych.

Introduction

Owady stanowią najbardziej zróżnicowaną grupę organizmów na Ziemi i odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu ekosystemu:¹. Jednak globalne oceny wskazują na alarmujący spadek ich liczebności i różnorodności na świecie ^2,3. Dokładne obrazowanie morfologii owadów jest niezbędne dla taksonomii, monitoringu ekologicznego i ochrony, szczególnie w bogatych w bioróżnorodność regionach tropikalnych, gdzie wiele taksonów pozostaje nieopisanych⁴. Jednak konwencjonalna makrofotografia pozostaje ograniczona przez ograniczoną głębię ostrości, która uniemożliwia pojedynczemu zdjęciu obejmowanie w pełni ostrych, trójwymiarowych struktur, takich jak anteny czy skrzydła^.

Próby fotografowania owadów w celach naukowych sięgają ponad wieku wstecz, a wczesne opisy metodologiczne podkreślały trudności w uchwyceniu drobnych szczegółów morfologicznych⁶. Tradycyjna makrofotografia, choć szeroko stosowana, pozostaje ograniczona przez płytką głębię ostrości osiągalną przy dużym powiększeniu ^7,8. To ograniczenie utrudnia dokumentowanie trójwymiarowych struktur, takich jak czułki, nogi czy skrzydła, co skutkuje obrazami pozbawionymi rozdzielczości wymaganej do dokładnej identyfikacji lub analizy morfologicznej.

Postępy w fotografii cyfrowej i przetwarzaniu obrazów umożliwiły znaczący postęp. Focus stacking, polegający na łączeniu wielu zdjęć wykonanych w różnych płaszczyznach ogniskowych, aby uzyskać w pełni ostry kompozyt, okazał się szczególnie skutecznym podejściem⁹. Jego wartość dla entomologii poprzez porównanie komercyjnych urządzeń z tanimi rozwiązaniami półautomatycznymi podkreśla potencjał do wielkoskalowej cyfryzacji próbek typowych⁹. Kolejne badania dotyczyły wykorzystania kompaktowych, przystępnych cenowo kamer wyposażonych w funkcje focus stacking, pokazując, że podejście to można rozszerzyć poza dobrze finansowane instytucje, aby wspierać^szersze projekty digitalizacji.

Focus stacking — łączenie kolejnych obrazów wykonanych na różnych płaszczyznach ogniskowych, aby uzyskać jeden rozszerzony kompozyt ogniskowy — stało się praktycznym rozwiązaniem⁶. Wczesne badania porównawcze⁷wykazały, że nawet tanie systemy półautomatyczne mogą zbliżyć się do wydajności mikroskopów komercyjnych, ale wciąż brakuje ustandaryzowanego, powtarzalnego protokołu odpowiedniego dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. Alternatywne metody obrazowania 3D, takie jak DISC3D⁸ , zapewniają precyzyjne modele, ale wymagają specjalistycznego sprzętu i złożonego oprogramowania do rekonstrukcji, co ogranicza ich dostępność.

Przedstawiamy tutaj protokół zoptymalizowany pod kątem okazów owadów, który równoważy jakość obrazu, koszt i przenośność. System integruje szeroko dostępne komponenty optyczne i mechaniczne z rygorystyczną kalibracją kolorów i procesami postprocessingu. Jego przydatność obejmuje zarówno digitalizację muzealną, jak i półstałe stanowiska terenowe, umożliwiając badaczom tworzenie powtarzalnych obrazów bez konieczności korzystania z opatentowanego sprzętu czy kosztownych zautomatyzowanych mikroskopów. To
Badanie wypełnia lukę metodologiczną, oferując zweryfikowany, otwarty przepływ pracy
zgodnie z naciskiem na przejrzystość i powtarzalność.

Protocol

1. Konfiguracja sprzętu

1. Zaprojektuj modułowy system obrazowania, który integruje zaawansowane komponenty optyczne z przystępnym cenowo i powszechnie dostępnym sprzętem (Plik uzupełniający 1)
2. Połącz mechanikę precyzyjną, kontrolowane oświetlenie i zaawansowaną optykę, aby uzyskać wysokorozdzielcze stackowanie ostrości, zachowując jednocześnie elastyczność wobec różnych rozmiarów i morfologii owadów.
3. Użyj następujących podstawowych komponentów.
   1. Kamera
      1. Użyj wysokiej rozdzielczości aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości o dużym zakresie dynamicznym, aby uchwycić szczegółowe struktury morfologiczne.
      2. Zamontuj aparat na wysoce specjalistycznej szynie ostrości (Plik uzupełniający 1)
   2. Wygląd
      1. Używaj obiektywów mikroskopowych z korekcją nieskończoności i powiększeniami takimi jak 5X, 7.5X, 10X i 20X (Plik Uzupełniający 1), zamontowanych na systemie rurowym.
      2. Uzupełnij zestaw obiektywu o obiektyw ultra-makro dla większych okazów.
      3. Dołącz rurki soczewek o różnych poziomach powiększenia w razie potrzeby (Plik uzupełniający 1)
   3. Oświetlenie
      1. Zamontuj dwie lampy studyjne w tylnej pozycji pionowej, aby zapewnić spójne i mocne oświetlenie.
      2. Umieść dwie jednostki błyskowe o dużej prędkości z przodu pod kątem, aby umożliwić krótki czas trwania błysku i szybki czas recyklingu.
      3. Zamontuj światła na regulowanych podstawkach, aby uzyskać jednolite, wolne od cieni oświetlenie (Plik uzupełniający 1).
      4. Umieść dyfuzor przed obiektywem, aby zmiękczyć światło i zmniejszyć ostre cienie (Plik uzupełniający 1).
   4. System wsparcia
      1. Ustaw stół antydrgacyjny, aby zminimalizować drgania podczas rejestracji obrazu.
      2. Użyj podpórki statywu i czarnego, nierefleksyjnego tła, aby zmniejszyć drgania i odbicia.
      3. Dodaj specjalną szynę makro do stabilizacji aparatu w systemie stackingu (Plik uzupełniający 1).
      4. Użyj trójosiowego urządzenia do rotacyjnego pozycjonowania (Plik Uzupełniający 1), aby precyzyjnie ustawić i ustawić obiekt.
      5. Użyj precyzyjnego etapu korekty mikrometrycznej, aby wykonać drobne korekty makro w skali mm.
   5. System ustawiania ostrości
      1. Obsługa stojaka ostrości sterowana silnikiem krokowym za pomocą dedykowanej jednostki sterującej i kabla sieciowego.
      2. Dostosowuj przyrosty ruchu nawet do 0,2 μm, aby zapewnić precyzyjne próbkowanie głębi do stosowania ostrości.
      3. Użyj cylindrycznego czarnego tunelu do sterowania kierunkiem światła i redukcji odbić podczas fotografowania bardzo małych obiektów (Plik uzupełniający 1).
      4. Użyj spustu, aby precyzyjnie zsynchronizować strzały błysku z migawką aparatu (Plik uzupełniający 1).
   6. Informatyka i akcesoria
      1. Do przetwarzania obrazu używaj wydajnego laptopa z co najmniej 128 GB RAM.
      2. Użyj szybkiego czytnika kart pamięci, tabletu graficznego oraz precyzyjnej myszy, aby przyspieszyć postprocessing.
      3. Noszę dwie karty pamięci o dużej pojemności, aby zapewnić wystarczającą pamięć do operacji terenowych.
4. Złóż system z komponentów pochodzących od różnych producentów, aby stworzyć niestandardowy hybrydowy zestaw zoptymalizowany pod kątem obrazowania owadów.

2. Kalibracja kolorów

1. Ogranicz niedokładne światło i kolory, otaczając aparat ścianami pomalowanymi na czarno.
2. Używaj standaryzowanego oświetlenia dziennego przy 6500 K, aby naśladować światło dzienne i utrzymać stałe warunki obrazowania.
3. Wykonaj kalibrację kamery.
   1. Skalibruj aparat za pomocą standaryzowanej tabeli kolorów.
   2. Sfotografuj tabelę odniesień kolorów w tym samym świetle zbalansowanym światłem dziennym, które użyto dla okazów owadów.
   3. Wygeneruj niestandardowy profil kolorów za pomocą oprogramowania kalibrującego kolorystykę.
   4. Stosuj niestandardowy profil kolorów podczas postprocessingu, aby skorygować różnice w obiektywie i świetle.
4. Wykonaj kalibrację monitora.
   1. Skalibruj monitor za pomocą urządzenia do zarządzania kolorami.
   2. Skalibruj monitor montażowy za pomocą kolorymetru i oprogramowania do profilowania.
   3. Ustaw kalibrację monitora na gamma 2.2 i punkt biały D65, aby dopasować się do warunków obrazowania.
5. Utrzymuj ten podwójny proces kalibracji, aby zachować dokładność kolorów od momentu do końcowego wyniku.

3. Układanie na stos

1. Każdy próbek zamontuj na regulowanych podporach, aby zapewnić stabilne ustawienie.
2. Zrób zdjęcia za pomocą zmotoryzowanego stojaka na ustawienie ostrości.
3. Dostosowuj rozmiary kroków w zakresie od 0,2 do 2 μm zgodnie z rozmiarem próbki i wymaganą głębią ostrości.
4. Wykonaj od 50 do 2 000 zdjęć w zakresie ogniskowym dla każdego okazu.
5. Zsynchronizuj oświetlenie z ekspozycją kamery, aby zminimalizować rozmycie ruchu.
6. Przechowuj pliki obrazów raw na kartach pamięci i przenosi je bezpośrednio do komputera przetwarzającego po akwizycji.

4. Oprogramowanie

1. Przenieś pliki surowe do oprogramowania do zarządzania obrazem dla początkowej organizacji.
2. Wybierz wszystkie zdjęcia i zastosuj profil kolorów specyficzny dla aparatu, aby zachować dokładność kolorów.
3. Eksportuj obrazy jako pliki TIFF o wysokiej rozdzielczości.
4. Przetwarzaj pliki TIFF w oprogramowaniu do stackowania fokusów.
5. Testuj dostępne metody układania według złożoności próbki.
   1. Stosuj metodę uśredniania opartą na kontrastie przy pracy z prostymi, jednolitymi obiektami.
   2. Stosuj metodę oparty na mapie głębi, gdy potrzebujesz najlepszego balansu między ostrością a redukcją artefaktów (Plik uzupełniający 1).
   3. Stosuj metodę opartą na piramidzie, gdy chcesz uchwycić drobne detale i złożone krawędzie, monitorując artefakty halo.
6. Zastosuj hybrydowy przepływ pracy.
   1. Najpierw przetworz oryginalny stos obrazów metodą opartą na mapie głębi, aby uzyskać kompozyt pośredni o silnej ostrości i wierności kolorów.
   2. Zapisz pierwszy wynik pośredni.
   3. Przetworz oryginalny stos metodą piramidową, aby uzyskać drugi kompozyt podkreślający detale krawędzi.
   4. Zachowaj drugie wyjście pośrednie.
   5. Załaduj oba wyjścia pośrednie jako nowy stos w oprogramowaniu do stosowania fokusów.
   6. Ponownie zastosuj metodę mapy głębi, aby połączyć je w ostateczny kompozyt, który łączy zalety obu metod, minimalizując artefakty.
7. Udoskonal obraz ułożony na stos w oprogramowaniu do edycji obrazów.
   1. Usuń tło, poprawij artefakty i sprawdź kalibrację kolorów.
   2. Wprowadzaj subtelne regulacje kontrastu i jasności, aby poprawić widoczność morfologiczną.
   3. Rejestruj każdy etap postprocessingu, aby zapewnić powtarzalność.
   4. Użyj tabletu graficznego, aby poprawić precyzję podczas zaawansowanej edycji.
8. Korzystaj z poniższych narzędzi podczas zaawansowanej edycji.
   1. Użyj narzędzia do wyboru odręcznego, aby wybrać nieregularne obszary do celowych edycji.
   2. Użyj narzędzia do przyciemniania, aby selektywnie zmniejszyć prześwietlenie lub nierówne obszary.
   3. Użyj narzędzia nawigacyjnego, aby przesuwać i przesuwać obraz podczas szczegółowej edycji.
   4. Użyj pędzla leczniczego lub korekcyjnego, aby usunąć niedoskonałości, ślady kurzu i drobne niedoskonałości.
9. Stwórz w pełni ostry, publikacyjny obraz przy zachowaniu efektywności w warunkach ograniczonych zasobów.
   ( Umieść tutaj Plik Dodatkowy 1 )

5. Przygotowanie i przygotowanie

1. Montaż stacji roboczej obrazowania
   1. Umieść stół tłumiący drgania na stabilnej powierzchni.
   2. Umieść szynę mocującą kamerę na środku stołu.
   3. Przymocuj korpus aparatu cyfrowego do szyny za pomocą adaptera sztywnej płyty.
   4. Podłącz wybrany obiektyw mikroskopowy (5×–20×) lub soczewkę makro za pomocą odpowiedniego adaptera rurowego.
   5. Zamontuj dwa tylne i dwa przednie źródła światła wyposażone w dyfuzory, aby zapewnić jednolite oświetlenie.
   6. Zamontuj podpór obiektu (uchwyt sceny XYZ lub uchwyt obrotowy) bezpośrednio pod osią obiektywu.
      UWAGA: PUNKT PAUZY: Cała konfiguracja sprzętowa może pozostać złożona w nieskończoność, jeśli jest zakryta i chroni ją przed kurzem.
2. Weryfikacja wyrównania systemu
   1. Upewnij się, że oś optyczna jest prostopadła do płaszczyzny próbki.
   2. Dostosuj poziomy poziome i pionowe za pomocą mikrometrów sceny, aż odbicia będą symetryczne.
   3. Potwierdź, że oświetlenie jest jednorodne w całym polu; Reguluj dyfuzory w razie potrzeby.

6. Kalibracja kolorów

1. Ustawianie oświetlenia i otoczenia.
   1. Używaj światła rozproszonego przy ~6500 K (odpowiednik światła dziennego).
      1. Minimalizuj odbicia otoczenia, otaczając zestaw ciemnymi, matowymi powierzchniami.
   2. Kalibracja koloru
      1. Sfotografuj 24-plamową tabelę odniesień kolorów pod światłem obrazującym.
      2. Wygeneruj profil kamery za pomocą oprogramowania kalibracyjnego towarzyszącego.
      3. Stosuj ten profil do wszystkich kolejnych obrazów RAW podczas konwersji.
      4. Skalibruj monitor ekranu na γ = 2,2 oraz biały punkt D65, aby zapewnić spójne odwzorowanie kolorów w trakcie pracy.

7. Montaż i ustawianie próbek

1. Przygotowanie okazów.
   1. Mocuj wysuszone lub konserwowane w etanolu owady na miękkiej podstawie montażowej, takiej jak glina modelarska.
   2. Ukierunkuj okaz zgodnie z pożądanym widokiem (grzbietowym, bocznym, brzusznym lub czołowym).
   3. Umieść podpórę wyśrodkowaną pod osią optyczną.
2. Regulacja odstępów stosu ostrości
   1. Zdefiniuj początek i koniec zakresu ogniskowej za pomocą najbliższych i najdalszych ostrych płaszczyzn.
   2. Zaprogramuj ruchy przyrostowe od 0,2 μm do 2 μm, w zależności od powiększenia.
   3. Zsynchronizuj wyzwalacz przechwytu tak, aby oświetlenie działało jednocześnie przy każdej ekspozycji obrazu.
   4. Rejestruj sekwencje 50–2000 obrazów według rozmiaru i głębokości okazu.
      UWAGA: PUNKT PAUZY: Przechwytywanie może być bezpiecznie wstrzymane między sekwencjami.

8. Przetwarzanie obrazu

1. Konwertuj i organizuj obrazy RAW.
   1. Przenieś pliki na komputer lokalny natychmiast po pozyskaniu.
   2. Grupuj każdy stos w unikalny folder, używając numeracji inkrementalnej.
   3. Zastosuj profile korekcji obiektywu i kolorów, a następnie eksportuj obrazy jako 16-bitowe pliki TIFF.
   4. Układanie obrazów na stos
   5. Otwórz stos TIFF w oprogramowaniu do stosowania fokusów.
   6. Wybierz algorytm mapy głębi (odpowiednik "Metody B") dla pierwszego złożenia.
   7. Opcjonalnie można ponownie ułożyć stos za pomocą algorytmu wzmacniającego krawędzie ("Metoda C") i połączyć oba wyjścia, aby zmaksymalizować ostrość przy jednoczesnym ograniczeniu aureoli.
   8. Zapisz ostateczny kompozyt w formacie bezstratnym.
2. Postobróbka obrazów
   1. Otwórz kompozyt w programie do edycji obrazów.
   2. Usuń artefakty w tle i kurz za pomocą narzędzi selekcji i leczenia.
   3. Dostosowywanie ogólnej jasności i kontrastu, aby poprawić widoczność cech morfologicznych.
   4. Dokumentuj każdą zmianę, aby zapewnić śledzenie.
      Uwaga: PUNKT PAUZY: Etap czyszczenia można wznowić później bez utraty danych.

9. Zapewnienie jakości i przechowywanie

1. Sprawdź finalny obraz przy 100% powiększeniu, aby upewnić się, że nie pozostały żadne niewyrównanie układu ani przesunięcia kolorów.
2. Zapisz wszystkie parametry obrazowania (powiększenie, rozmiar kroku, ekspozycję, wersje oprogramowania) w arkuszu metadanych.
3. Przechowuj pliki surowe, pośrednie i końcowe na dyskach redundantnych; Prowadz cyfrowy dziennik.

Results

Walidacja jakości obrazu i rozdzielczości

System stosowania ostrości generował w pełni ostre, kontrastowe kompozyty przy powiększeniach od 5× do 20×. Obliczone skale pikseli mieściły się od 0,76 μm (5×)–0,19 μm (20×) w przestrzeni obiektowej, co potwierdza odpowiednie pobieranie próbek dla submikronowych szczegółów strukturalnych kutikuli i kończyn owada. Reprezentatywne stosy o długości 800–2000 klatek wykazywały spójną ostrość w płaszczyźnie bez artefaktów halo. Protokół utr...

Discussion

Optymalne działanie procedury stosowania ostrości zależy od (i) całkowitej izolacji układu od drgań, (ii) precyzyjnej kalibracji szyni ostrości w przyrostach poniżej mikrona oraz (iii) spójnej kalibracji kolorów. Każde odchylenie od tych parametrów znacząco zwiększa powstawanie halo i przesunięcia kolorów⁹. Połączenie stabilności mechanicznej i standaryzowanego oświetlenia stanowi najważniejszy czynnik determinujący jakość obrazu.

Rozwiązywanie problemów i możliwe modyf...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela wsparcia	Preferencjalnie 3 kapsuły	Stabilna baza dla całego zestawu	150
Tabela antywibracyjny	Zwyczaj	Minimalizuje drgania podczas przechwytywania obrazu	3,200
Cylindryczny tunel	Zwyczaj	Steruje kierunkiem światła	350
Redukuje odbicia u małych obiektów
Szafa skupiająca Novoflex CASTEL-MICRO (szyna makro)	Silnik krokowy– sterowany, jednostka sterująca, kabel sieciowy, zasilacz Euro AC	Precyzyjne ustawianie ostrości poniżej mikron (0,2 i mikro; m kroków);	3,000
automatyzuje ruch kamery
XYZ z rotacyjnym	Regulowany montaż	Staranne dopasowanie i pozycjonowanie tematów	500
Kamera	Sony Alpha 7R IV (61 MP pełnoklatkowy)	Rejestracja obrazu o wysokiej rozdzielczości	3,000
Oświetlenie	2& razy; Godox SK300II	Jednolite, wolne od cieni oświetlenie;	400
Oświetlenie	2& razy; Godox QT600II	Wysoka prędkość z krótkim czasem trwania błysku	1400
Stojaki błyskowe	3 regulowane podstawki	Elastyczne ustawianie świateł	100
Modyfikator światła	Dyfuzor	Zmiękcza światło i redukuje ostre cienie	50
Tło	“ dziura" Velvet	Eliminuje odbicia, zapewnia jednolite tło	200
Cele mikroskopowe	Mitutoyo Plan Apo Infinity poprawione: 5&razy;	Wysokiej jakości powiększenie dla mikrostruktur	1,000
Mitutoyo Plan Apo Infinity poprawione: 7,5&;	2,000
Mitutoyo Plan Apo Infinity poprawiony: 10&razy;	1,400
Mitutoyo Plan Apo Infinity poprawione: 20& razy;	5,000
System lampy soczewkowej	Bezpośrednie użycie obiektywów Mitutoyo M-Plan (2x, 5x, 7,5x, 10x, 20x)	Obiektywy mikroskopowe sprzężenia z kamerą	400
Adapter	Mocowanie Sony E do uniwersalnego bagnetu NOVOFLEX A	Mechaniczne połączenie aparatu kamery z systemem optycznym	300
Obiektyw makro	Venus Optics Laowa 100 mm f/2.8 2&; Ultra Macro APO (Sony E-mount)	Obrazowanie większych okazów przy dużym powiększeniu	550
Trigger	Spust błyskowy	Synchronizacja lampy błyskowej z migawką aparatu	50
Komputer	ASUS lub laptop Alienware ≥ 128 GB RAM, procesor o wysokiej wydajności	Przetwarzanie i przechowywanie obrazu	3,000
Nośniki pamięci	2& razy; SD 256 GB, szybki czytnik kart SD	Bezpieczne przechowywanie i transfer obrazów o dużej objętości	200
Akcesoria	Mysz gamingowa	Precyzja podczas edycji i nawigacji	50
Akcesoria	Wacom One (tablet graficzny)	Precyzyjna kontrola podczas czyszczenia i edycji obrazu	500
całkowity koszt			26 800