Zintegrowana stymulacja elektryczna ucha i lek słoneczny Dingtong łagodzi pierwotną dysfunkcję miesiączki z zastojem qi i stagnacją krwi u szczurów

Podsumowanie

Transkutaneiczna stymulacja elektryczna ucha połączona z dziecięciem Sunshi Dingtong łagodziła patologiczne uszkodzenie macicy oraz zmiany związane z zapaleniem w modelu szczurów z pierwotną dysfunkcją miesiczkową z zastojem qi i stagnacją krwi, co prowadzi do zmian w ekspresji mRNA PPAR-γ2 i COX-2.

Streszczenie

Pierwotna dysmenorrea z wzorcem stagnacji qi i stagnacji krwi wiąże się z zapaleniem macicy i bólem, a obecne terapie farmakologiczne mogą powodować działania niepożądane. Badanie to oceniło połączone efekty terapeutyczne transkutanej elektrostymulacji punktu usznego (TEAP) i dekokcji Sunshi Dingtong (SDD) na szczurach z modelem pierwotnej dysmenorrei z wzorcem stagnacji qi i stagnacji krwi. Trzydzieści sześć szczurek Sprague–Dawley zostało losowo przypisanych do grup: kontrolnej, modelowej, SDD, TEAP, TEAP plus SDD oraz ibuprofenu. Model wywołano stosując wrażliwienie benzoinianem estradiolu, połączone stymulacje stresowe chlorowodorem adrenaliny i podawanie oksytocyn. Szczurki otrzymywały fizjologiczny roztwór chlorku sodu, SDD, ibuprofen lub TEAP na określonych punktach usznych przez siedem dni. Morfologię macicy badano metodą barwienia hematoksyliną i eozyną. Poziomy IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α oraz PGE2 w macicy mierzono metodą ELISA, a ekspresję mRNA PPAR-γ2 i COX-2 w macicy określano za pomocą qPCR. Szczurki modelowe wykazywały zdegenerację nabłonka macicy, infiltrację neutrofilów, zwiększoną ekspresję IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α oraz COX-2 mRNA oraz zmniejszoną ekspresję PGE2 i PPAR-γ2 mRNA. TEAP lub SDD samodzielnie częściowo odwracały te zmiany patologiczne i molekularne, podczas gdy połączona terapia TEAP plus SDD wywoływała bardziej wyraźne poprawy, z efektami porównywalnymi z tymi obserwowanymi w grupie ibuprofenu. Te wyniki sugerują, że TEAP w połączeniu z SDD łagodzi patologiczne uszkodzenie macicy oraz zmiany związane z zapaleniem w pierwotnej dysmenorrei z wzorcem stagnacji qi i stagnacji krwi (QSBSPD) u szczurów, a efekty te są związane z regulacją ekspresji mRNA PPAR-γ2 i COX-2.

Wprowadzenie

Główna dysmenorrea (GD), nazywana również funkcjonalnym bólem miesiączki, charakteryzuje się występowaniem dysmenorrhoi bez występowania jakiejkolwiek rozpoznawalnej patologii organicznej w narządach rozrodczych¹. Kobiety z ciężką dysmenorrhoią często nie są w stanie wykonywać codziennych czynności, co znacząco odbija się na ich jakości życia i wymaga farmakologicznego wsparcia w celu łagodzenia objawów². Istniejąca literatura wskazuje, że jest ona związana z różnymi czynnikami, w tym prostaglandynami (PG), estrogenem, progesteronem, wazopresyną, oksytocyna (OT), układem odpornościowym, efektami neuroendokrynnymi i zmianami poziomów wapnia jako mikroskładnika³. Jednocześnie, czynniki zapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interleukina-6 (IL-6), mogą indukować syntezę lub sekrecję PG. Proces ten prowadzi do nadmiarowego skurczu mięśni macicy, co następnie powoduje ból niedokrwienny i GD⁴. Obecnie leczenie GD w współczesnej medycynie jest głównie sklasyfikowane na leczenie ogólne, farmakologiczne i zabieg chirurgiczny. Wśród opcji farmakologicznych często stosuje się niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak ibuprofen. Niemniej jednak, stosowanie NLPZ wiąże się ze znaczącymi działaniami ubocznymi ze strony układu pokarmowego, a długotrwałego lub intensywnego stosowania może prowadzić do powikłań, takich jak wrzody trawienne i krwawienia z górnego odcinka przewodu pokarmowego⁵. Dlatego identyfikacja i opracowywanie bezpieczniejszych i bardziej skutecznych strategii leczenia GD jest konieczne i niezbędne.

Rosnące dowody sugerują, że główna dysmenorrea jest często związana z nadmiarem wzorca w tradycyjnej medycynie chińskiej, wśród których stagnacja qi i stagnacja krwi są często obserwowane klinicznie⁶. W tym wzorcu, upośledzona ruchliwość qi i krążenie krwi uważane są za przyczyny stagnacji w macicy, nadmiernego skurczu macicy i bólu. Strategie terapeutyczne, które regulują qi, aktywizują krążenie krwi, ogrzewają kanały i łagodzą ból, są zatem powszechnie stosowane w tej chorobie. Terapia punktów aurkulowych jest ważną niefarmakologiczną interwencją w tradycyjnej medycynie chińskiej. Jest prosta w zastosowaniu i była używana do łagodzenia bólu poprzez modulacje neuroendokrynnych i endogennych szlaków przeciwbólowych⁷. Odwar z Sunshi Dingtong (SDD), który jest formułą opracowaną na podstawie doświadczeń klinicznych przez Dział Ginekologii Szpitala Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Fuzhou, był stosowany w leczeniu dysmenorrhoi charakteryzującej się stagnacją qi i stagnacją krwi. Formuła ta opiera się na zasadach terapeutycznych polegających na regulacji qi i krwi, promowaniu krążenia krwi, ogrzewaniu kanałów i łagodzeniu bólu miesiączkowego. SDD zawiera Shixiao San, składający się z Pollen typhae (Puhuang) i Faeces Trogopterori (Wulingzhi), wraz z Rhizoma Cyperi (Xiangfu), Myrrh (Moyao), Ramulus cinnamomi (Guizhi), Radix et Rhizoma Clematidis Chinensis (Weilingxian), Herba Salivae Chinensis (Shijianchuan), Rhizoma Corydalis Yanhusuo (Yanhusuo), Radix Angelicae Sinensis (Danggui), Herba Artemisiae Anomalae (Liujinu) i Fructus foeniculi (Xiaohuixiang). Jednakże, skuteczność eksperymentalna SDD, szczególnie w połączeniu z przewlekłym elektrostymulacją punktów aurkulowych, nie była systematycznie oceniana w kontrolowanym modelu zwierzęcym nadmiernej stagnacji qi i stagnacji krwi w pierwotnej dysmenorrhoi.

Peroksysomowe proliferatory receptorów (PPAR), należące do rodziny receptorów hormonów jądrowych, są receptorami aktywowanymi ligandem, niezbędnymi do regulacji wielu procesów metabolicznych wewnątrzkomórkowych. Istnieją trzy odrębne podtypy PPAR, znane jako PPAR-α, PPAR-β/δ i PPAR-γ⁸. Ostatnie odkrycia wskazują, że PPAR-γ2 jest ekspresowany w różnorodnych tkankach i wykazuje istotną korelację z procesami zapalnymi⁹. Zgodnie z raportem, PPAR-γ hamuje ekspresję IL-6, cyklooksygenazy-2 (COX-2), endotelinianu-1, syntazy tlenu azotowego, metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej-9, gelatinazy i cząstek adhezji poprzez inaktywację czynnika jądrowego κB, białka aktywowanego i szlaków sygnałowych przekaźników i aktywatorów transkrypcji, tym samym hamując reakcję zapalną¹⁰. Ponadto Huang i wsp.¹¹ wskazują, że COX-2 i PPAR-γ2 mogą służyć jako kluczowe cele zaangażowane w patofizjologię zaburzeń stagnacji qi i stagnacji krwi (QSBS).

Dlatego niniejsze badanie zbadało efekty terapeutyczne przewlekłej elektrostymulacji punktów aurkulowych (TEAP), SDD i ich połączonego zastosowania w modelu szczurzym nadmiernej stagnacji qi i stagnacji krwi w pierwotnej dysmenorrhoi. Integrując histopatologię macicy, profilowanie mediatorów zapalnych, pomiar prostaglandyn oraz analizę mRNA związaną z PPAR-γ2/COX-2, niniejsze badanie miało na celu ocenić, czy połączona terapia wewnętrzna i zewnętrzna oparta na medycynie chińskiej mogłaby zap

Protokół

Oświadczenie etyczne

Wszystkie procedury związane z eksperymentami na zwierzętach zostały przeglądnięte i zatwierdzone przez Komitet Etykę Laboratorium Zwierząt Biotechnologii Fujian Ambry (numer zgody: IACUC FJABR2024031202). Przeprowadź wszystkie eksperymenty na zwierzętach zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w instytucji.

Przygotowanie SDD i ibuprofenu

SDD składa się z Shixiao San (9 g), Xiangfu (9 g), Moyao (6 g), Guizhi (9 g), Weilingxian (12 g), Shijianchuan (20 g), Yanhusuo (12 g), Danggui (9 g), Liujinu (15 g) i Xiaohuixiang (5 g). Shixiao San składa się z Puhuang (4,5 g) i Wulingzhi (4,5 g). Wszystkie składniki ziołowe zostały użyte jako skoncentrowane granulki i są wymienione w Tabeli Materiałów. Przygotuj SDD poprzez rozpuszczenie 106 g skoncentrowanych granulek w 200 ml wrzącej wody, aby uzyskać ostateczną koncentrację 0,53 g/ml ekwiwalenta surowca leczniczego. Dokładnie wymieszaj, aż granulki całkowicie się rozpuszczą, pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej i podawaj go doustnie przez zgłębianie żołądkowe w dawce 2,5 ml/kg na jedno podanie. Przygotuj zawiesinę ibuprofenu zgodnie z wymaganą stężeniem do podawaniu doustnego przez zgłębianie żołądkowe. Podawaj ibuprofen w dawce 0,02 g/kg jako leczenie kontrolne.

Zwierzęta i podział na grupy

Użyj 36 zdrowych dorosłych szczurów Sprague-Dawley płci żeńskiej bez specyficznych patogenów, w wieku 2–3 miesięcy i ważących 200 ± 20 g, bez historii ciąży lub rozmnażania. Utrzymuj szczury w cyklu 12 h/12 h światło/ciemność przy 22 ± 2 °C i wilgotności względnej 50–70%, z wolnym dostępem do standardowej karmy i wody pitnej. Po 1 tygodniu aklimatyzacji losowo przypisz szczury do sześciu grup (n = 6 na grupę): blank, model, SDD, TEAP, SDD + TEAP i grupy ibuprofenu.

Przygotowanie i podawanie modelu QSBSPD

W tym eksperymencie zastosowano szeroko akceptowany model dysmenorei indukowanej OT. W skrócie, cykle estrusowe szczurów oceniono poprzez mazie z pochwy. Szczury były kwalifikujące się do uczestnictwa w badaniu, jeśli ich cykl estrusowy wynosił 4–5 dni.

Z wyjątkiem grupy blank, szczurom z grup eksperymentalnych podawano codzienne wstrzyknięcia podskórne benzoesanu estradiolu i chlorowodorku epinefryny przez 10 dni. Po wstrzyknięciu chlorowodorku epinefryny w dawce 0,9 mg/kg codziennie, szczury były narażone na różne połączone stymulacje (A: Stymulacja akustyczna: szczury były narażone na stymulację akustyczną (90 dB, 1 kHz) przez 5 min/raz, 3–4 razy dziennie, z 2-godzinnym przerwami między każdym razem. B: Stymulacja świetlna: szczury były narażone na stymulację świetlną przez 5 min/raz, 3–4 razy dziennie, z 2-godzinnym przerwami między każdym razem. C: Stymulacja elektryczna: szczury były poddawane stymulacji elektrycznej (dwufazowane impulsy kwadratowe) na 30–35 V, z prądem zmiennym stosowanym przez 0,3 s co 2 s. Stymulacja była stosowana przez 5 min co 2 h, 2–4 razy dziennie. D: Ograniczenie: szczury były umieszczane w klatce ograniczającej zbudowane z drutu kolczastego, mierzącej około 25 cm długości i 5 cm średnicy. Po wejściu do klatki, końce były ściśnięte, aby uniemożliwić szczurom ruch przez 2 h, raz dziennie). Ponadto, w dniach 1 i 10, szczurami wstrzykiwano podskórnie 5,0 mg/kg/dzień benzoesanu estradiolu, a w dniach 2–9, otrzymywały 2,5 mg/kg/dzień.

Począwszy od 5. dnia wstrzyknięcia benzoesanu estradiolu, szczury otrzymywały doustne podawanie różnych leków przez 7 dni, dwa razy dziennie o godzinie 10:00 i 16:00, z wyjątkiem grupy ibuprofenu, która otrzymywała je raz dziennie o godzinie 10:00. W grupach blank, model i TEAP, szczurom podawano 2,5 ml/kg fizjologicznego roztworu soli. W grupach SDD i TEAP+SDD, szczury otrzymywały 2,5 ml/kg SDD (przygotowane jako 106 g surowca rozpuszczonego w 200 ml wody, 0,53 g/ml); ta dawka została przeliczona z dorosłej klinicznej dawki dziennej 106 g na podstawie równoważności powierzchni ciała, co dało dawkę równoważną dla szczurów. W grupie ibuprofenu szczury otrzymywały 0,02 g/kg zawiesiny ibuprofenu. W grupach TEAP i TEAP+SDD, szczury były poddawane stymulacji TEAP począwszy od 5. dnia po wstrzyknięciu benzoesanu estradiolu. Elektrody przymocuj do dwustronnych punktów Jiaogan, Shenmen, Neishengzhiqi i Neifenmi, zgodnie z wcześniej zgłoszonym standardem lokalizacji punktów akupunkturowych u szczurów¹². Punkty te znajdują się w dwustronnej części małżowiny usznej, unerwione przez nerw błędny. Elektrody były podł

Wyniki

Screening cyklus estrus u szczurów

Wyniki barwienia Wright-Giemsa wykazały, że mazy z przednaczy wykazywały przeważnie komórki nabłonkowe z jądrem, z niewielką ilością keratynocytów. Jądra tych komórek nabłonkowych wyglądały na słabo zabarwione, powiększone i wykazywały oznaki rozpadu. W czasie estrus mazy były charakteryzowane przewagą dużych, obumierających keratynizowanych komórek nabłonkowych. W postestrus, była znaczna obecność keratynizowanych komórek nabłonkowych wraz z...

Dyskusja

PD to ból w dolnej części brzucha, który objawia się przed i podczas miesiączki bez żadnych rozpoznawalnych uszkodzeń organicznych w rejonie genitalnym lub miednicy¹. Według badań, około 45–90% kobiet na świecie doświadcza dysmenorei, a 10–25% cierpi na ciężką dysmenorę¹³. Dlatego konieczne jest zidentyfikowanie bezpieczniejszych i bardziej skutecznych interwencji w PD oraz dalsze wyjaśnienie ich mechanizmów leżących u ich podstawy.

Obecnie uznan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.9% roztwór chlorku sodu	Heilongjiang Qiqin Animal Health Products Co., Ltd.	240314A03	Płukanie tkanek i przygotowanie próbek
1× bufor zależny od fosforanów (PBS)	Biosharp	BL601A	Płukanie tkanek, homogenizacja ELISA i procedury barwienia
System stymulacji akustycznej i świetlnej	Wykonane na zamówienie w obiekcie zwierzęcym	Wykonane na zamówienie	Połączona stymulacja stresowa podczas budowy modelu QSBSPD
Płytki mikroskopowe z klejem	Jiangsu Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	80312-3161	Przygotowanie preparatów parafinowych i mazów pochwowych
Automatyczny skaner slajdów cyfrowych	Guangzhou Guangying Cell Technology Co., Ltd.	GCell-60	Cyfrowe obrazy sekcji barwionych HE
Automatyczny odwadniacz tkanek	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-TS	Odwadnianie tkanek przed wbudowaniem parafiny
Mikroskop biologiczny	Nikon	E200MV	Obserwacja mazów pochwowych i barwionych sekcji tkanek
Balon z gazem CO2 i komora eutanazji	Fuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine Animal Center	Instytucjonalny system CO2	Eutanazja zwierząt
Chłodnica do stacji osadzania	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL	Osadzenie parafiny
Kryogenny młynek	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	TISS-24	Homogenizacja tkanek
Danggui (Radix Angelicae Sinensis)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A1070343	Składnik SDD; skondensowane granulki
Woda traktowana DEPC	Meilunbio	MA0018	Reagent qRT-PCR
Elektroniczny instrument do leczenia akupunkturą	Suzhou Medical Appliance Factory Co., Ltd.	SDZ-II	Stymulacja TEAP i stymulacja elektryczna
Elektroniczna waga analityczna	Sartorius Balance Beijing Co., Ltd.	BS 224S	Waga próbek i reagentów
Eozyna	Epredia	7111	Barwienie HE
Wodorotlenek epinefryny	TargetMol	119091	Budowa modelu QSBSPD
Estradiol benzoesian	Sigma-Aldrich	E8515	Budowa modelu QSBSPD
Etanol	Xilong Scientific Co., Ltd.	240403A1	Przetwórstwo i odwadnianie tkanek
Guizhi (Ramulus Cinnamomi)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A2060533	Składnik SDD; skondensowane granulki
Hematoksylina	Epredia	7211	Barwienie HE
Suspensja ibuprofenu	Shanghai Johnson & Johnson Pharmaceutical Co., Ltd.	H20000359	Dodatni lek kontrolny; 20 mg/mL
Liujinu (Herba Artemisiae Anomalae)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A210A413	Składnik SDD; skondensowane granulki
Mini mikrocentryfuga o niskiej prędkości	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.	WTL-4K	Przygotowanie próbki
Mikro-chłodzona mikrocentryfuga	Beckman Coulter	Microfuge 22R	Ekstrakcja RNA i przygotowanie homogenatu tkankowego
Mikropłytkowy czytnik	Guangdong Danli Technology Co., Ltd.	K3	Pomiar absorpcji ELISA przy 450 nm
Nakrywki mikroskopowe	Jiangsu Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.	80340-1630	Przygotowanie slajdu mikroskopowego
Inkubator do form	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	W0704	Inkubacja podczas procedur barwienia lub badań
Moyao (Myrrh)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	1107853	Składnik SDD; skondensowane granulki
Neutralny balsam	Meilunbio	MB9899	Montowanie barwionych sekcji tkanek
NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix	Novoprotein	E047-01A	Transkrypcja odwrotna
NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus	Novoprotein	E096-01B	Amplifikowanie qRT-PCR
Iniekcja oksytocyna	Anhui Fengyuan Pharmaceutical Co., Ltd.	220906-4	Indukcja modelu QSBSPD
Woks parafinowy	Hualing	20220918	Osadzenie parafiny
System PCR	Bio-Rad	PTC-100	Procedury związane z PCR
Puhuang (Pollen Typhae)	Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd.	A2092143	Składnik SDD; skondensowane granulki; składnik Shixiao San
Prymery qRT-PCR dla PPAR-γ2, COX-2 i GAPDH	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	Synteza na zamówienie	Prymery qRT-PCR
Zestaw ELISA dla IL-1β szczura	Meimian Biotechnology	MM-0047R2	Zestaw ELISA
Zestaw ELISA dla IL-6 szczura	Meimian Biotechnology	MM-0190R2	Zestaw ELISA
Zestaw ELISA dla PGE2 szczura	Meimian Biotechnology	MM-0068R2	Zestaw ELISA
Zestaw ELISA dla PGF2α szczura	Meimian Biotechnology	MM-0230R2	Zestaw ELISA
Klatka do ograniczania ruchu szczura	Wykonane na zamówienie w obiekcie zwierzęcym	Wykonane na zamówienie	Stres ograniczający podczas budowy modelu QSBSPD
Zestaw ELISA dla TNF-α szczura	Meimian Biotechnology	MM-0180R2	Zestaw ELISA
System PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	7300	Analiza qRT-PCR
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	Ekstrak