Artykuł metodologiczny

Znakowanie metaboliczne nowo powstającego transkryptomu w wczesnej embriogenezie Xenopus

DOI:

10.3791/70591

⸱

27 marca 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy szczegółowe metody metabolicznego oznaczania i oczyszczania początkujących transkryptów do analizy transkryptomu u wczesnych zarodków Xenopus z wykorzystaniem 5-etynylo-urydyny (5-EU).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesna embriogeneza wymaga nowej transkrypcji genów zygotycznych z początkowo uśpionego genomu zygoty po zapłodnieniu. Głównym wyzwaniem było dokładne wykrycie nowych transkrypcji i określenie czasu ich ekspresji podczas aktywacji genomu zygoty (ZGA). Przedstawiamy tutaj szczegółowe procedury znakowania metabolicznego początkujących transkryptów za pomocą 5-etynylo-udrydyny (5-EU) we wczesnych zarodkach Xenopus laevis . Po zapłodnieniu 5-EU jest mikrowstrzykiwane do zarodków w stadium 1 komórki, aby metabolicznie oznaczać nowo transkrybowane RNA podczas ZGA. Powstające RNA EU są następnie oczyszczane po biotinylacji za pomocą reakcji chemicznych pośredniczonych w klikach, a powstający transkryptom jest określany za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Co ważne, metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością, co pozwala na charakteryzację słabo aktywowanych genów. W ten sposób takie podejście stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki transkrypcji genów podczas wczesnego rozwoju i może być uogólnione na inne systemy embrionalne lub tkanki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zapłodnieniu zarodek jest pod kontrolą czynników matczynych zdeponowanych w jaje, podczas gdy genom zygoty jest przez pewien czas transkrypcjonalnie nieobecny; Jest aktywowany do transkrypcji setek do tysięcy genów niezbędnych do dalszego rozwoju, w tym specyfikacji przeznaczenia komórek oraz tworzenia warstwy zarodkowej 1,2,3,4,5,6. To zjawisko aktywacji genomu zygoty (ZGA) podczas przejścia matki do zygoty (MZT) jest silnie zachowane we wszystkich gatunkach metazoa, choć czas wystąpienia ZGA różni się w zależności odgatunku 1,2,3,4,5,6. Zrozumienie, jak ZGA jest regulowane, jest ważne nie tylko dla naszego zrozumienia podstawowych zasad wczesnego rozwoju, ale także daje potencjał do opracowywania nowych strategii diagnozowania i leczenia zaburzeń rozwojowych oraz poprawy zdrowia reprodukcyjnego.

Głównym wyzwaniem w badaniu ZGA było dokładne wykrywanie nowych transkrypcji i określenie ich czasu powstania podczas aktywacji genomu zygoty (ZGA). Ze względu na dominację transkrypcji matki we wczesnych embrionach7, wysokie poziomy tych transkrypcji mogą maskować wykrywanie nowych transkrypcji podczas ZGA, szczególnie dla tych słabo aktywowanych genów, przy użyciu konwencjonalnego masowego RNA-seq. Aby pokonać to wyzwanie, opracowaliśmy metodę pomiaru początkującego transkryptomu poprzez metaboliczne znakowanie transkryptów za pomocą 5-etynylo-urydyny (5-EU), a następnie biotinylację powstających RNA EU za pomocą chemii klikowej i oczyszczanie ich do sekwencjonowania (EU-RNA-seq)8,9,10. W porównaniu z innymi początkującymi metodami profilowania transkryptów, takimi jak te wykorzystujące 4-tiourydynę (4sU)11,12, oznakowanie 5-EU jest wysoce specyficzne za pomocą klikowej chemii, może być stosowane zarówno do obrazowania, jak i sekwencjonowania, i nie wymaga konwersji chemicznej. Co więcej, początkujący EU-RNA-seq jest bardzo czuły i wykrywa setki genów, których aktywacji nie może wykryć konwencjonalny RNA-seq8. To podejście pozwoliło nam również precyzyjnie określić początek aktywacji genu zygotycznego oraz profilować wyraźne wzorce czasowo-przestrzenne ZGA podczas wczesnej embriogenezy8.

Opisujemy tutaj szczegółowe procedury przygotowania próbek do EU-RNA-seq w celu profilowania rodzącego się transkryptomu, wykorzystując wczesne zarodki Xenopus laevis jako model. Protokół ten jest adaptacją wcześniejszej metody10,13 z drobnymi optymalizacjami procedur, w tym mikroiniekcją 5-EU do zarodków w stadium 1-komórkowym, biotinylacją powstających RNA EU-RNA za pomocą reakcji klikowej oraz ich oczyszczaniem do sekwencjonowania (Rysunek 1). Aby zapewnić powtarzalność, w zależności od stadia wczesnych zarodków o różnej liczebności początkujących transkryptów, należy użyć 1–10 μg całkowitego RNA jako wejścia, choć nadal można użyć mniejszej ilości. Protokół ten można stosować w innych układach embrionalnych, takich jak Drosophila14 i daniodano 15, oraz w innych tkankach13. Metoda ta jest potężnym narzędziem dla naszego zrozumienia transkrypcji genów i mechanizmów regulacyjnych w różnych procesach biologicznych, w tym ujawniania nowych zasad wczesnej embriogenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace ze zwierzętami opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej. Bezpieczeństwo laboratoryjne i utylizacja odpadów powinny być zgodne z przepisami instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie odczynników i buforów

  1. 20x MMR (Marc's Modified Ringer) roztwór: Wymieszaj 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 oraz 40 mM CaCl2. Ustaw pH do 7,8 z NaOH. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  2. 3% Ficoll (w/v)/0,5x MMR: Powoli dodaj 1,5 g Ficoll 400 do 50 mL 0,5x MMR, delikatnie mieszając magnetycznym batonem, aż Ficoll całkowicie się rozpuści. Autoklawuj i utrzymuj w temperaturze 4 °C do użycia.
  3. Roztwór 5-etynyloworydyny (5-EU): Aby przygotować 50 mM roztworu bulwarowego, należy dodać 372,8 μL buforu (należy zauważyć, że do fiolki 5 mg można użyć dowolnego buforu kompatybilnego z mikroiniekcją, np. 1x łyżeczki litrowej, pH 7,6). Dobrze wymieszaj i zrób 2 μL aliquoty. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Mikroiniekcja 5-EU do zarodków jednokomórkowych

  1. Aby uzyskać zarodki Xenopus , należy stosować standardowe protokoły przeprowadzania zapłodnienia in vitro (IVF) (np. zob. Sive i in., 2007)16. Zarodek powinien mieć 0,1x MMR, gotowy do użycia.
  2. Dodaj 1 mL 3% Ficoll/0,5x MMR do komory mikrowtryskowej wykonanej ze standardowego szkła szkła (25 mm x 75 mm). Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść 20 (lub więcej, jeśli trzeba) zarodków do środka komory mikroiniekcji.
  3. Użyj cienkiej pęsety, aby ostrożnie wyciąć bardzo cienki koniec szklanej igły i przybij ją pionowo (z końcówką skierowaną w dół) do modelingowej gliny na ścianie stołu. Użyj pipety P2 z końcówką mikroładowaczowej, aby dodać 0,5 μL 50 mM 5-EU z góry szklanej igły.
  4. Złóż igłę na mikromanipulatorze. Użyj pipety P10, aby dodać 10 μL oleju halowęglowego na mikrometr sceniczny i poddać go stereomikroskopowi.
  5. Aby skalibrować objętość wtrysku, najpierw użyj stopy, aby docisnąć podkładkę na podłodze połączoną z mikrowtryskiwaczem i wstrzyknąć kroplę do oleju halowęglowodorowego na mikrometrze. W zależności od wielkości kropli dostosuj ciśnienie i czas wstrzykiwania w mikrowtryskiwacz, aby określić objętość wtrysku na poziomie 10 nL, czyli 0,27 mm średnicy na mikrometrze.
  6. Użyj pęsety w jednej ręce, aby utrzymać zarodek, drugiej ręki mikromanipulatora, a w stadium 1-komórkowym wstrzyknij 10 nL 50 mM EU do zarodków. Końcowe stężenie 5-EU w zarodku wynosi ~0,5 mM.
  7. Po mikrowstrzyknięciu użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść zarodki z komory do iniekcji do nowej szklanej misy zawierającej 3% Ficoll/0,5x MMR. Przechowywać wstrzyknięte zarodki w Ficoll przez ~1 godzinę.
  8. Ostrożnie usuń roztwór Ficoll i zamień medium na 0,1x MMR. Zachowaj zarodki w 0,1x MMR do dalszego użycia. Stale monitoruj rozwój zarodków i usuwaj ewentualne nieprawidłowe zarodki, jeśli to konieczne.
  9. Gdy zarodki osiągną pożądane stadium rozwoju, użyj pipety plastycznej do przeniesienia 10 zarodków do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć resztki z rurki, a następnie zarodki zamrozić w ciekłym azocie.
    Uwaga: Aby zapewnić stężenie i powtarzalność, pobieraj tylko zarodki prawidłowe na podstawie ich wyglądu w porównaniu do grupy kontrolnej. Usuń i wyklucz wszelkie nieprawidłowe zarodki z dalszej analizy. W razie potrzeby należy również pobrać tę samą liczbę zarodków bez mikrozastrzyków jak negatywne kontrole.
  10. Przechowuj zarodki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

3. Całkowita ekstrakcja RNA i pomiar stężenia

UWAGA: Użyj zestawu do całkowitej ekstrakcji RNA opartego na membranie krzemionkowej do izolacji całkowitych RNA z wczesnych zarodków oraz zestawu do ilościfikacji RNA opartego na fluorescencji o wysokiej czułości w celu określenia stężeń RNA. Stosuj się do instrukcji zawartych w zestawie, a poniższe kroki są nieco zmodyfikowane względem instrukcji. Wszystkie roztwory i odczynniki używane w kolejnych etapach powinny być wolne od RNaz.

  1. Próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C umrodziś na lodzie.
  2. Do każdej probówki należy dodać 700 μL buforu RLT z zestawu do ekstrakcji RNA. Używaj pipety P1000, aby pipetować w górę i w dół przez co najmniej 15 razy lub aż wszystkie zarodki się rozpuszczą.
  3. Trzymaj próbki na lodzie przez 20 minut. Delikatnie wymieszaj ponownie, pipetując w górę i w dół przez co najmniej 10 razy, aby całkowicie ujednolicić zarodki.
  4. Do zhomogenizowanych zarodków należy dodać 700 μL 70% etanolu. Pipetować w górę i w dół, aby dobrze wymieszać, i przelać 700 μL mieszanki do kolumny spinowej.
  5. Wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Zrezygnuj z przepływu. Powtarzaj wirówkę, aż reszta mieszanki będzie gotowa.
  6. Dodaj 350 μL buforu RW1 i wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Usuń przepływ.
  7. Ostrożnie dodaj 80 μL DNazy I do środka błony w kolumnie. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Dodaj 350 μL buforu RW1 i wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Usuń przepływ.
  9. Dodaj 500 μL buforowego RPE i wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Usuń przepływ. Powtórz pranie jeszcze raz.
  10. Susz kolumnę, ponownie wirując w 10 000 x g przez 2 minuty.
  11. Przełóż kolumnę do nowej rurki wolnej od RNazy. Ostrożnie dodaj 35 μL wolnego od RNaz H2O do środka błony w kolumnie.
  12. Wiruj kolumnę w 10 000 x g przez 1 minutę. Zbierz eluowane RNA i trzymaj na lodzie.
  13. Aby zmierzyć stężenie RNA, najpierw przygotuj roztwór roboczy za pomocą zestawu do ilościowania RNA, rozcieńczając odczynnik RNA (barwnik) w kształcie 1:200 w buforze RNA. Oblicz całkowitą objętość roztworu roboczego w zależności od liczby standardów i przygotuj 200 μL dla każdego standardu lub próbki.
  14. Ustaw pasek 0,2 mL z 8 rurkami. Aby rozcieńczyć każdy standard, dodaj 10 μL do 190 μL roztworu roboczego. Aby rozcieńczyć każdą próbkę, dodaj 1 μL do 199 μL roztworu roboczego. Dobrze wymieszaj.
  15. Włóż pasek z 8 rurek do fluorometru. Wybierz test RNA, skalibruj według standardów i odczytaj stężenia próbek.

4. Początkująca biotynylacja i oczyszczanie EU-RNA

UWAGA: Do biotynylizacji i ściągnięcia powstających RNA EU-RNA używany jest zestaw do przechwytywania RNA powstającego na podstawie chemii klikowej. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, a kolejne kroki są nieco modyfikowane. RNA z zarodków nieiniekowanych, a także RNA EU bez biotinylacji, mogą służyć jako kontrola tła dla specyficzności pulldown.

  1. Biotinylacja i oczyszczanie RNA
    1. Dla każdej próbki wymieszaj następujące składniki w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, aby uzyskać reakcję klikową 50 μL: całkowite RNA (1–10 μg), 1x bufor EU, 2 mM CuSO4, 0,25 mM biotynowy azyd, 10 mM dodatek 1 oraz 12 mM dodatek 2.
    2. Inkubuj mieszankę reakcji w temperaturze pokojowej przez 30 minut na nutatorze.
    3. W każdej powyższej reakcji dodaj 1 μL glikogenu, 50 μL 7,5 M octaniego amonu oraz 700 μL schłodzonego 100% etanolu. Pipetuj pipetami 5 razy, żeby dobrze je wymieszać.
    4. Włóż tubkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowuj na noc.
    5. Wiruj probówkę w 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając granulki.
    6. Dodaj 700 μL etanolu 75% i delikatnie wymieszaj, aby ponownie zawiesić pellet. Wiruj probówkę w 13 000 x g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając granulki. Powtórz pranie jeszcze raz.
    7. Susz pellet na powietrzu przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesij pellet w 10 μL wolnym od RNaz H2O.
  2. Oczyszczanie EU-RNA
    1. Aby zebrać powstające EU-RNA, na każdą próbkę należy podać 5 μL magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną w nowej mikrowirówce o pojemności 1,5 mL.
    2. Dodaj 9 μL buforu płukania 2. Dobrze wymieszaj i umieść lampę na magnetycznym stojaku. Zostaw to na 2 minuty. Usuń supernatant. Powtarzaj pranie jeszcze dwa razy. Ponownie zawiesz kulki w 5 μL Wash Buffer 2.
    3. Przygotuj następującą mieszankę główną w nowej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL (15 μL na każdą próbkę): 12,5 μL buforu wiążącego RNA (składnik G), 0,2 μL rozcieńczonej RNazy OUT oraz 2,3 μL wolnej od RNazy H2O. Dodaj 15 μL mieszanki do każdej probówki zawierającej próbkę RNA.
    4. Inkubuj przez 5 minut na bloku grzewczym w temperaturze 69 °C. Umieść probówkę na lodzie.
    5. Do każdej probówki zawierającej próbkę RNA należy dodać 5 μL powyższych wcześniej wypranych kulek. Inkubuj przez 30 minut na nutatorze w temperaturze pokojowej.
    6. Dodaj 50 μL buforu płukania 1. Dobrze wymieszaj i umieść lampę na magnetycznym stojaku. Zostaw to na 2 minuty. Usuń supernatant. Powtórz pranie jeszcze 4 razy.
      Uwaga: Supernatant po pierwszym płukaniu, który prawdopodobnie zawiera tylko transkrypty matczyne, może być pobrany do pomiaru transkryptomu matki.
    7. Dodaj 50 μL buforu płukania 2. Dobrze wymieszaj i umieść lampę na magnetycznym stojaku. Zostaw to na 2 minuty. Usuń supernatant. Powtórz pranie jeszcze 4 razy.
    8. Ponownie zawiesz kulki w 5 μL Wash Buffer 2. Koraliki, które zawierają powstające EU-RNA, są gotowe do bezpośredniej syntezy cDNA i przygotowania biblioteki.
      Uwaga: Przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki wzbogacenie początkujących transkrypcji można ocenić, mierząc ekspresję znanych pojedynczych genów za pomocą reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji polimerazy (RT-PCR).

5. Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki RNA

  1. Używaj komercyjnie dostępnych zestawów do przygotowania bibliotek cDNA i postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi w zestawie. Użyj NEBNext Library Quant Kit for Illumina, aby ilościowo określić biblioteki i zgrupować je.
  2. Zgrupuj biblioteki zgodnie z instrukcjami powszechnie używanych zestawów sekwencjonowania nowej generacji. Rozcieńcz biblioteki do ~1,8 pM przed załadowaniem ich do sekwencera stacjonarnego, aby osiągnąć optymalną gęstość klastrów ~200k/mm2 podczas sekwencjonowania. Sekwencjonowanie bibliotek za pomocą powszechnie używanego sekwencjonowania nowej generacji. Zastosowano sekwencjonowanie parowe 75 bp dla ~20 milionów odczytów na próbkę.
  3. Ilościowo określić odczyty transkryptomiczne, dopasowując sekwencje do genomu Xenopus laevis build 9.2 przy użyciu salmon17 oraz przeprowadzić różnicową analizę ekspresji genów za pomocą DESeq218. Aby zwizualizować piki w przeglądarce genomu, przypisz sekwencje do genomu za pomocą STAR19 i wyświetl je w Integrative Genomics Viewer (IGV)19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki Xenopus laevis (cztery biologiczne repliki) w etapach od 5 do 9 godzin po zapłodnieniu (hpf) w temperaturze 22 °C, obejmujące stadia od stadium 5 (z niewielką ZGA) do 9. stadium (z wysokim ZGA), były przetwarzane zgodnie z protokołem powyżej8. Całkowite RNA, oczyszczone powstające RNA EU oraz RNA przepływowe zostały użyte do przygotowania bibliotek i zostały sekwencjonowane. Jak pokazano na Rysunku 2, porównując powstający transkryptom przy 6–9 hpf z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy tutaj szczegółowy protokół znakowania metabolicznego nowo powstającego transkryptomu we wczesnej embriogenezie, w tym mikrowstrzyknięcie 5-EU do zarodków jednokomórkowych, ekstrakcję całkowitych RNA i pomiar ich stężeń oraz biotinylację i oczyszczanie powstających RNA EU do przygotowania i sekwencjonowania biblioteki (EU-RNA-Seq) (Rysunek 1). Dzięki wysokiej czułości i specyficzności podejścia w porównaniu z całkowitym RNA-seq, protokół ten pozwolił nam nie tylko dokładnie ok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za zapewnienie szkoleń. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro; Mikroinjektor PUPMŚwiatowe Precyzyjne InstrumentyUPUMPDo mikrowstrzykowania (mikrowstrzykiwania pod ciśnieniem)
5-ehtynylurydynaThermo Fisher ScientificE10345Do mikroiniekcji (oznakowanie początkujących traqnscriptów)
Stereomikroskopy ACCU-SCOPE 3075 ZoomVWR470351-130Do mikrozastrzyków (wizualizacji embrionów)
Octan amonuSigma-AldrichA2706Do wytrącenia RNA
Kwas askorbinowySigma-AldrichA7506Za reakcję kliknięcia
Naczynia włosowate ze szkła borokrzemowegoŚwiatowe Precyzyjne InstrumentyTW100-4Do mikroiniekcji (robienie szklanych igieł)
WirówkaEppendorf5425RDla wirówki
Zestaw do przechwytywania RNA z Click-iTThermo Fisher ScientificC10365Do biotinylacji i oczyszczania powstającego RNA
CuSO4Sigma-Aldrich61230Za reakcję kliknięcia
DNaza IRoche Diagnostics4716728001Do ekstrakcji RNA
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Do mikrozastrzyków (inkubujących zarodków)
Szklanki do szalki Petriego (60 mm)VWR75845-542Do zapłodnienia
GlikogenThermo Fisher ScientificAM9510Do wytrącenia RNA
Olej halowęglowodowy 27Sigma-AldrichH8773Do mikroiniekcji (kalibracja objętości wtrysku)
L-cysteinaSigma-Aldrich168149Do dejellizacji embrionów
Końcówki mikroładowaczyNaukowy kalibrEPE-5242956003Do mikroiniekcji (załadowanie 5-EU do szklanej igły)
NEBNext Library Quant Kit dla IlluminaNEBE7630Dla kwantyfikacji bibliotecznej
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Do sekwencjonowania
Fluorometr Qubi FlexThermo Fisher ScientificQ33327Do pomiaru stężenia RNA
Zestaw do wiązania kubitowego RNA HSThermo Fisher ScientificQ32852Do pomiaru stężenia RNA
RNeasy Mini KitQiagen74104Do ekstrakcji RNA
Mikrometr etapowyWard's Science470175-914Do mikroiniekcji (kalibracja objętości wtrysku)
Uniwersalny RNA-seq z NuQuantNuGEN0364Do przygotowania do biblioteki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).
  2. Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  3. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), (2019).
  4. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  5. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  6. Tadros, W., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts. Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).
  7. Schier, A. F. The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas. Science. 316 (5823), 406-407 (2007).
  8. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  9. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  10. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  11. Heyn, P., et al. The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species. Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).
  12. Bhat, P., et al. Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis. Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).
  13. Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts. STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).
  14. Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns. Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).
  15. Chan, S. H., et al. Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. , (2007).
  17. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  18. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  19. Dobin, A., et al. Ultrafast universal rna-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  21. Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity. Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).
  22. Battich, N., et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies. Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Embriogeneza Xenopusaktywacja genomu zygotycznegoznakowanie 5 etynylurydyntechnika mikroiniekcjichemia klikoczyszczanie RNAsekwencjonowanie nast pnej generacjidynamika ekspresji gen w

Powiązane artykuły