Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Podsumowanie

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Streszczenie

Wczesna embriogeneza wymaga przejścia matki do zygoty (MZT), które wymaga aktywacji genomu zygoty (ZGA). Podczas ZGA transkrybowane są setki do tysięcy genów, co jest niezbędne do różnych procesów wczesnego rozwoju zarodków, w tym utrzymania przeżywalności embrionalnej, określania losu komórek oraz tworzenia warstwy zarodkowej. Jednym z głównych wyzwań w badaniu ZGA było bezpośrednie zobrazowanie ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych embrionów. Tutaj opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków poprzez znakowanie metaboliczne powstających transkryptów za pomocą 5-etynylowoudrydyny (5-EU), następnie sprzężenie powstających RNA EU z fluoroforami za pomocą chemii kliknięcia oraz wizualizację ich w zarodkach całych za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykorzystując Xenopus laevis jako model. Metoda ta umożliwiła nam śledzenie jednokomórkowego ZGA w zarodkach z pełnym montażem oraz ujawnienie heterogenicznego początku ZGA w przestrzeni i czasie podczas wczesnej embriogenezy. Może być stosowany w innych systemach embrionalnych lub tkankach do badania transkrypcji genów i regulacji genomu na poziomie pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

W trakcie wczesnego rozwoju zarodek przechodzi przejście matczyno-zygotyczne (MZT), które stopniowo przenosi kontrolę rozwojową z czynników matczynych na geny zygotyczne. MZT wymaga aktywacji początkowo uśpionego genomu zygotycznego, procesu określanego jako aktywacja genomu zygoty (ZGA); geny wyrażane podczas ZGA są niezbędne do wczesnej specyfikacji losu komórkowego, gastrulacji oraz formowania osi ^1,2. Co istotne, ZGA jest zachowana we wszystkich metazoach, a czas wystąpienia ZGA jest ściśle kontrolowany, choć różni się w zależności od ^{gatunku 3,4}. Zaburzenia regulacji ZGA mogą prowadzić do poważnych konsekwencji, od wad rozwojowych po śmierć embrionalną, taką jak poronienie. Dlatego badanie mechanizmów ZGA jest nie tylko ważne dla zrozumienia podstaw regulacji genów, ale ma także istotne implikacje kliniczne.

Głównym wyzwaniem w badaniu ZGA było bezpośrednie zobrazowanie dużych ZGA we wczesnych embrionach oraz badanie jego mechanizmów na poziomie pojedynczych komórek. Pokonaliśmy to wyzwanie, opracowując metodę wykorzystującą znakowanie metaboliczne początkujących transkryptów podczas ZGA z użyciem 5-etynylowurydyny (5-EU), a następnie konjugację powstających RNA EU z fluoroforami za pomocą chemii kliknięcia oraz wizualizację w embrionach całościowych za pomocą mikroskopii konfokalnej, wykorzystując Xenopus laevis jako model. Duży zarodek Xenopusa (~1,2 mm średnicy) zawiera gradient wielkości komórek, a duża skala ZGA występuje w okolicach środkowego stadium blastuli (z początkiem około stadium 7 i szczytem około 9), co czyni go idealnym modelem do badania wzorców ZGA⁵. Dzięki zastosowaniu oznakowania 5-EU we wczesnych zarodkach Xenopus mogliśmy bezpośrednio wizualizować i ilościowo określić dużą skalę ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków z pełnym montażem, co doprowadziło do odkrycia nowego wzorca czasoprzestrzennego ZGA, regulowanego głównie przez rozmiar komórki ^5,6.

Tutaj opisujemy szczegóły tego podejścia, zaadaptowanego z wcześniejszych badań z optymalizacjami ^5,7, w tym utrwalanie zarodków po metabolicznym znakowaniu początkujących transkryptów 5-EU, sprzężenie powstających RNA EU fluoroforem za pomocą reakcji klikowej⁸ oraz barwienie immunobarwne pod kątem markerów podkomórkowych, a następnie oczyszczanie zarodków do obrazowania konfokalnego. Metoda ta może być stosowana w innych układach embrionalnych, w tym danio^{pręgowanych 9,10}, lub w sekwencjonowaniu do profilowania rodzącego się transkryptomu¹¹, wspierając jej ogólne i szerokie zastosowanie w różnych typach próbek i analiz. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda stanowi nowy, ważny sposób badania mechanizmów regulacji genomu w pojedynczych komórkach.

Protokół

Opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej.

1. Przygotowanie przed rozpoczęciem protokołu

UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu przygotuj następujące roztwory z użyciem wody wolnej od RNazy.

1. Przygotuj 1× soli trisbuforowanej (TBS), pH 7,6: 50 mM Tris-HCl i 150 mM NaCl. Ustawij pH do 7,6. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Wykorzystaj bufor w ciągu dwóch miesięcy.
2. Przygotuj 1× soli trisbuforowanej z Tween 20 (TBST), pH 7,6: dodaj Triton X-100 w końcowym stężeniu 0,1% (vol/vol) do 1× TBS (pH 7,6) przygotowanej w wodzie wolnej od RNazy. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Wykorzystaj bufor w ciągu miesiąca.
3. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA)/1× MEM: wymieszaj 1 fiolkę (10 mL) 16% PFA i 4 mL 10× MEM (1000 mM 3- (N-morfolino)propanosulfonowego kwasu [MOPS], pH 7,4, 20 mM EGTA i 10 mM MgSO₄). Dodaj wodę wolną od RNazy do 40 mL. Zaleć i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór wykorzystaj w ciągu 6 miesięcy.
4. Przygotuj 70%, 50% i 25% metanolu w 0,5× SSC: wymieszaj metanol i 0,5× SSC odpowiednio w proporcjach 3:1, 1:1 i 1:3. Użyj roztworu w ciągu sześciu miesięcy.
5. Przygotuj roztwór wybielający: Wymieszaj, aby uzyskać końcowe stężenie 2% (vol/vol)_H2O2,₅% formamidu (vol/vol) oraz 0,5× SSC w wodzie wolnej od RNazy. Przygotuj ten roztwór na świeżo tuż przed użyciem.
6. Przygotuj roztwór blokujący: Dodaj końcowe stężenie 10% (objętość/objętość) surowicy koziej oraz 0,2% (masa/objętość) BSA w 1× TBST. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Zużywaj roztwór w ciągu 6 miesięcy.
7. Przygotuj odczynnik oczyszczający BABB: Wymieszaj 1 część alkoholu benzylowego (BA) i 2 części benzoianu benzylowego (BB). Przechowuj w temperaturze pokojowej. Użyj roztworu w ciągu 6 miesięcy.

2. Naprawa zarodków mikro-zaszczepionych 5-EU

1. Aby mikro-wstrzyknąć 5-etynylo-urydynę (5-EU) do zarodków jednokomórkowych, należy stosować procedury opisane wcześniej¹¹. Pozwól zarodkom rozwinąć się do pożądanych etapów ZGA, np. etapu 9, gdy ZGA występuje aktywnie w większości komórek zarodka.
2. Aby utrwalić zarodki mikrozastrzyknięte 5-EU, najpierw dodaj około 1,8 mL 4% PFA/1× MEM do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 2 mL. Następnie użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść ~20 zarodków do szklanej fiolki. Zminimalizuj ilość podłoża do szklanej fiolki.
3. Napełnij szklaną fiolkę po wierzch dodatkowym 4% PFA/1× MEM. Zamknij fiolkę z nakrętką; Nie powinno się zostawiać żadnych pęcherzyków powietrza.
4. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodek z niską prędkością (np. 10 obr./min) przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Użyj pipety, aby ostrożnie usunąć utrwalacz. Napełnij szklaną fiolkę 100% metanolem. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 5 minut.
6. Ostrożnie usuń metanol i dodaj nowy metanol. Powtórz rotację i odwodnienie co najmniej dwa razy, aby zarodki były całkowicie odwodnione.
7. Przechowuj zarodki w metanolu w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. Pozwól zarodkom pozostać w metanolu przez co najmniej 2 dni, zanim przejdziesz do kolejnych kroków. Zarodki mogą być użyte w ciągu 2 miesięcy.

3. Sprzężenie powstających RNA z fluoroforem za pomocą reakcji klikowej

1. Aby nawodnić zarodki, najpierw usuń metanol ze szklanej fiolki, następnie dodaj 2 mL 75% metanolu w 0,5× SSC i zamknij fiolkę z kapslem. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 5 minut.
2. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki. Powtórz powyższy krok kolejno, używając 50% metanolu w 0,5× SSC, 25% metanolu w 0,5× SSC i 0,5× SSC. Aby całkowicie nawilżyć zarodki, powtórz ostatnie płukanie 0,5× SSC co najmniej dwa razy.
3. Dodaj 2 mL świeżo przygotowanego roztworu wybielacza (2%_{H2O2 i} 5% formamidu w stężeniu 0,5× SSC) do szklanej fiolki. Połóż szklaną fiolkę na kawałku folii aluminiowej, a następnie umieść ją pod światłem LED w takiej odległości, aby próbki nie przegrzały.
4. Wybielaj zarodki pod światłem, aż wszystkie pigmenty staną się białe, co zazwyczaj zajmuje 5–6 godzin. Należy zauważyć, że ze względu na rozkład_H2O2 na_O2, powstają małe pęcherzyki powietrza, które mogą sprawić, że zarodki unoszą się na wodzie. Sprawdzaj zarodki okresowo (np. co 30 minut) i delikatnie obracaj szklaną fiolkę, aby zarodki mogły się osadzić w roztworze wybielającego.
5. Ostrożnie usuń bufor wybielający. Dodaj 2 mL 0,5× SSC, aby szybko spłukać zarodki. Powtórz szybkie płukanie jeszcze raz, jeśli trzeba.
6. Dodaj 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 1 godzinę. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.
7. Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy. Należy zauważyć, że dokładne mycie zarodków jest kluczowe dla kolejnych kroków.
8. Dodaj 2 mL 1× łyżeczki do szklanej fiolki. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 5 minut. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.
9. Powtórz powyższy krok jeszcze raz.
10. Przygotuj mieszankę do reakcji klikowej w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, dodając następujące odczynniki, aby uzyskać końcowe stężenia 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM CuSO₄, 25 μM tetrametylorodaminy (TAMRA)-azydu oraz 100 mM kwasu askorbinowego. Dodaj kwas askorbinowy na końcu do reakcji. Pipetuj w górę i w dół, żeby dobrze wymieszać.
11. Dodaj mieszankę reakcji 200 μL do zarodków w szklanej fiolce. Upewnij się, że objętość mieszanki reakcji jest wystarczająca, aby zanurzyć wszystkie zarodki w fiolce. Inkubuj przez 12 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności.
12. Ostrożnie usuń mieszankę reakcji klikowej. Należy zauważyć, że na zarodkach można zaobserwować fluorescencję niespecyficzną. Szybko przepłucz zarodki dwa razy 1× TBST, a następnie myj je 1× TBST przez co najmniej 5 razy, zmieniając roztwór co godzinę, jak opisano powyżej.
13. Kontynuuj mycie zarodków, zmieniając 1× TBST co 2 godziny i zostawiaj je na noc w temperaturze 4 °C na rotatorze. Przestań myć, gdy niespecyficzna fluorescencja jest prawie widoczna. Należy pamiętać, że ponieważ pozostałości reakcji klikowej mogą być szkodliwe dla immunobarwienia w dalszej fazie, należy dokładnie przemyć zarodki przez 1–2 dni, zanim przejdziemy do kolejnych kroków.

4. Immunobarwienie zarodków markerami podkomórkowymi (opcjonalnie)

1. Aby zablokować zarodki, usuń 1× TBST z fiolki szklanej w ostatnim kroku płukania powyżej i dodaj 200 μL roztworu blokującego (10% surowicy koziej/0,2% BSA/1× TBST). Owiń szklaną fiolkę kawałkiem folii aluminiowej, aby chronić zarodki przed światłem. Umieść szklaną fiolkę na nutatorze i delikatnie potrząsaj zarodkami przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej (lub przez noc w 4 °C).
2. Rozcieńcz przeciwciało główne (np. przeciwciało przeciw H3) w proporcji 1:1 000 na 200 μL zawierającego 10% surowicy koziej/1× TBST. Dodaj rozcieńczone przeciwciało do szklanej fiolki i owiń ją kawałkiem folii aluminiowej. Inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 4 °C na nutatorze z niską prędkością.
3. Ostrożnie usuń przeciwciało ze szklanej fiolki. Szybko przepłucz zarodki dwa razy, dodając 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki i wyjmuj ją.
4. Dodaj 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki, a następnie owiń ją kawałkiem folii aluminiowej. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 1 godzinę. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.
5. Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy.
6. Rozcieńcz przeciwciało wtórne (np. przeciwciało Alex Fluor 488) w stosunku 1:1 000 w 200 μL zawierającym 10% surowicy koziej/1× TBST. Jeśli konieczne jest barwienie DNA, rozcieńcz barwnik DNA (np. TO-PRO-3) razem z przeciwciałem wtórnym.
7. Dodaj rozcieńczone przeciwciało do szklanej fiolki i owiń ją folią aluminiową. Inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 4 °C na nutatorze z niską prędkością.
8. Ostrożnie usuń przeciwciało ze szklanej fiolki. Szybko przepłucz zarodki dwa razy, dodając 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki i wyjmuj ją.
9. Dodaj 2 mL 1× TBST do szklanej fiolki, a następnie owiń ją kawałkiem folii aluminiowej. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i obracaj zarodki z niską prędkością przez 1 godzinę.
10. Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy.

5. Oczyszczanie zarodków przed obrazowaniem konfokalnym

1. Aby odwodnić zarodki, ostrożnie usuń bufor ze szklanej fiolki po ostatnim umyciu i dodaj 2 ml metanolu 100%. Owiń szklaną fiolkę folią aluminiową, umieść na rotatorze i pozwól zarodkom rotować z niską prędkością przez 5 minut. Po obrócie usuń płyn ze szklanej fiolki.
2. Powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy.
3. Aby całkowicie odwodnić zarodki, powtórz powyższy krok co najmniej 5 razy, używając 2 ml metanolu bezwodnego w 100% bezwodnej.
4. Ostrożnie usuń jak najwięcej metanolu ze szklanej fiolki.
5. Użyj szklanej pipety, aby powoli dodawać 500 μL odczynnika oczyszczającego BABB do fiolki. Zarodki unoszą się w BABB i czekają 10 minut, aż wszystkie zarodki osiedlą się na dnie szklanej fiolki. Należy zauważyć, że zarodki stają się niemal niewidoczne i ostrożnie usuwaj BABB, nie uszkadzając zarodków.
6. Powtórz powyższy krok co najmniej 2 razy lub aż nie będzie widocznych linii schlieren. Aby całkowicie oczyścić zarodki, trzymaj je w BABB przez 1–2 dni przed badaniem obrazowym.
7. Tworzysz komory obrazujące, odcinając mały kwadrat (np. ~5 mm × 5 mm) z taśmy VHB o grubości ~ 1,1-1,2 mm (podobnej wielkości zarodka) i rozmiarze ~10 mm × 10 mm, a następnie przyklej go do szkła osłonowego o średnicy 24 mm × 40 mm.
8. Ostrożnie przenieś oczyszczone zarodki do komory, a następnie przykryj je kolejnym szkłem pokrywkowym. Zarodki będą znajdować się wewnątrz kanapki okularów osłonowych, aby można było sfotografować obie strony.
9. Wykonaj obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym.

Wyniki

Zarodki Xenopus laevis na etapie 1-komórkowym były mikroiniekcjonowane 5-EU, a zarodki na etapie 9 były utrwalane, gdy w całym zarodku zachodziła duża skala ZGA. Zarodki były przetwarzane zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Powstające RNA w embrionach oznaczano TAMRA-azydem w reakcji klikowej, histon H3 za pomocą przeciwciała antyhistonowego H3, a DNA znakowano TO-PRO-3. Zarodki były obrazowane pod mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu 10×. Jak pokazano na Rysunku 1, powsta...

Dyskusja

ZGA stanowi jeden z najważniejszych przejściów w najwcześniejszych etapach rozwoju zarodka ^2,3. Tutaj opisaliśmy szczegółowe procedury przygotowania próbek do bezpośredniej wizualizacji ZGA w całych zarodkach Xenopus we wczesnym nasadzeniu, w tym fiksację zarodków mikro-EU, sprzężenie powstających RNA fluoroforem za pomocą reakcji klikowej, immunobarwienie markerów podkomórkowych po reakcji klikowej oraz oczyszczanie zarodków do obrazowania konfokalnego<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% paraformaldehydu (PFA)	EMS	15710-S	Do przygotowania roztworu utrwalacza
20& razy; SSC	Mediatech	MT46-020-CM	Do przygotowania roztworu wybielającego
Mieszacz 3D z nutacją	VWR	76595-802	Dla nutacji embrionów
Fiolki z gwintem 9 mm (2 mL)	VWR	46610-722	Do przetwarzania embrionów
Przeciwciało przeciw-histon H3	Abcam	ab1791	Do immunobarwienia
Kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A7506	Za wywołanie reakcji kliknięcia
Benzylalkohol	Sigma-Aldrich	305197	Do oczyszczania zarodków
Benzoesan benzylowy	ACROS Organics	105860010	Do oczyszczania zarodków
Albumina surowicy bydła (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Do tworzenia rozwiązania blokującego
Nakrętki na fiolki z gwintem 9 mm (2 mL)	VWR	46610-712	Do przetwarzania embrionów
Szkło osłonowe (24 mm i razy; 40 mm)	VWR	48393-060	Do produkcji komory obrazującej
CuSO4	Sigma-Aldrich	61230	Za wywołanie reakcji kliknięcia
Etylenebis (oksyetylenenitrilo)kwas tetraoctowy (EGTA)	Thermo Fisher Scientific	AC409915000	Do przygotowania roztworu utrwalacza
Fiji ImageJ	NIH		Do przetwarzania obrazów
Formamid	Thermo Fisher Scientific	AC181090010	Do przygotowania roztworu wybielającego
Szklane pipety Pasteur	VWR	14673-010	Za przeniesienie BABB
Przeciwciało przeciwkrólikowe przeciw kozom Alex Fluor 488 wtórne	Thermo Fisher Scientific	A27034	Do immunobarwienia
Serum koziego	Abcam	ab7481	Do tworzenia rozwiązania blokującego
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich	H1009	Do przygotowania roztworu wybielającego
Siarczan magnezu (MgSO4)	Thermo Fisher Scientific	M65-500	Do przygotowania roztworu utrwalacza
Metanol	Thermo Fisher Scientific	A4524	Do odwodnienia zarodków
Metanol, bezwodny	Sigma-Aldrich	322415	Do odwodnienia zarodków
MOPS	Thermo Fisher Scientific	AC172631000	Do przygotowania roztworu utrwalacza
Wielomodowy mieszacz nutacyjny	VWR	76595-812	Dla nutacji embrionów
Plastikowa pipeta transferowa	Thermo Fisher Scientific	13-711-9AM	Do transferu zarodków
Żyletka	Thermo Fisher Scientific	18-100-970	Do cięcia taśm
Woda wolna od RNaz	Thermo Fisher Scientific	BP561-1	Do tworzenia rozwiązań wolnych od Rnazy
Roto-Mini PLUS (rotator)	VWR	470313-912	Do roracji embrionów
Tetrametylorrodamina (TAMRA)-azyd	Abcam	ab146486	Za wywołanie reakcji kliknięcia
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Do barwienia DNA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	10789704001	Do robienia bufora do prania
Baza Trizma (Baza Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Do tworzenia bufora Tris
Taśmy VHB 3M GPH-110GF (45 mil.)	VWR	76524-608	Do produkcji komory obrazującej
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 700	Zeiss		Do obrazowania konfokalnego