Znormalizowany protokół wywoływania starzenia się przedwczesnego wywołanego stresem w pierwotnych ludzkich melanocytach z użyciem hydronadtlenku tert-butylu

Podsumowanie

Zstandaryzowany protokół indukowania przedwczesnego starzenia się w HNM z użyciem tBHP, zstandaryzowane protokoły do analizy kluczowych markerów starzenia się, w tym zatrzymania wzrostu, aktywności SA-β-galaktozydazy i czynników SASP.

Streszczenie

Czynniki stresujące środowiskowe, w tym promieniowanie UV, zanieczyszczenie powietrza lub dym tytoniowy, powodują zewnętrzne starzenie się skóry. Ekspozycja na te czynniki starzenia zewnętrznego sprzyja akumulacji senescencyjnych komórek, co przyczynia się do powstawania zmarszczek i zaburzeń barwienia. Melanocyty, które zapewniają pierwotną ochronę przed UV, wykazują zmniejszoną aktywność wraz z wiekiem. Senescencyjne melanocyty gromadzą się w starszej skórze i przyczyniają się do jej starzenia się; Jednakże, jest niewiele modeli do badania senescencji melanocytów, a niniejsza praca ma na celu opracowanie modelu możliwego do powtórzenia dla dalszych badań. W niniejszym badaniu przedstawiamy model senescencji ludzkich neonatalnych melanocytów (HNM) za pomocą tert-butylohydroperoksysdu (tBHP), dobrze scharakteryzowanego induktora stresu oksydacyjnego. tBHP zakłóca homeostazę redoks poprzez wyczerpanie obrony antyoksydacyjnej komórek i promowanie nadprodukcji rodników, co skutkuje uszkodzeniem DNA i białek. Charakteryzujemy fenotyp senescencji melanocytów leczonych tBHP poprzez analizę ustalonych markerów senescencji, w tym ograniczonego potencjału wzrostu, zmian morfologicznych i aktywności SA-β-Galaktozydazy. Ten model zapewnia cenną narzędzie do badania senescencji przedwczesnej indukowanej stresem w melanocytach, oferując wgląd w ich rolę w zewnętrznym starzeniu się skóry i zaburzeniach barwienia.

Wprowadzenie

Starzenie się skóry składa się z dwóch różnych czynników: starzenie się intrinsyczne i ekstrinsyczne^1,2. Starzenie się intrinsyczne jest spowodowane naturalnymi procesami chronologicznymi i czynnikami genetycznymi, podczas gdy starzenie się ekstrinsyczne wynika z kumulacji stresu środowiskowego, głównie promieniowania ultrafioletowego, ale także zanieczyszczenia powietrza, dymu tytoniowego i czynników chemicznych, które przyspieszają proces starzenia się poza normalnymi wskaźnikami chronologicznymi^3,4. Ekspozycja na czynniki środowiskowe wywołuje stres oksydacyjny, który przekracza obronę komórkową przeciwutleniaczy, powodując uszkodzenie DNA, utlenianie białek i peroksydacje lipidów. Te zmiany molekularne wywołują trwałe reakcje na uszkodzenie DNA i dysfunkcję komórkową, co ostatecznie prowadzi do przedwczesnego starzenia się^5,6. Ten stres-indukowany proces starzenia się przyczynia się do klinicznych objawów starzenia się skóry, w tym zmarszczek, nierównomiernej pigmentacji, zmniejszonej elastyczności i upośledzonej funkcji barierowej⁷.

Melanocyty znajdują się w warstwie podstawnej naskórka i pełnią funkcję głównej obrony skóry przed uszkodzeniami wywołanymi promieniowaniem UV poprzez syntezę melaniny i jej przenoszenie do otaczających keratynocytów. Paradoksalnie, ta rola ochronna sprawia, że są one szczególnie podatne na stres oksydacyjny i przedwczesne starzenie się podczas starzenia się ekstrinsycznego^8,9. Sam proces melanogenezy wytwarza znaczne ilości reaktywnych form tlenu jako produkty uboczne reakcji katalitycznych tyrozynazy, tworząc wrodzone obciążenie oksydacyjne, które jest dodatkowo wzmacniane przez czynniki środowiskowe, takie jak promieniowanie UV i zanieczyszczenie^10,11. W rezultacie przewlekły stres środowiskowy może powodować uszkodzenia oksydacyjne, dysfunkcję mitochondriów i ostatecznie starzenie się komórek¹². Pomimo ich znaczenia, pozostają kluczowe pytania dotyczące ścieżek molekularnych rządzących starzeniem się melanocytów i jak stres oksydacyjny inicjuje ten proces. Co więcej, wpływ starzejących się melanocytów na otaczające mikrośrodowisko skóry jako czynnik napędzający zmiany związane z wiekiem, szczególnie poprzez uwalnianie czynników SASP, pozostaje niedostatecznie zrozumiany^13,14.

Mimo że melanocyty są szczególnie podatne na stres oksydacyjny–indukowaną senescencję, modele eksperymentalne do badania tego procesu są nadal ograniczone^15,16. Większość badań nad starzeniem się opiera się nadal na modelach starzenia się indukowanego replikacją lub stresem w fibroblastach, ale te podejścia nie uwzględniają odrębnej biologii melanocytów ani ich potencjału wpływu na starzenie się skóry poprzez komunikację z sąsiednimi komórkami i ich własnym profilem SASP¹⁷. Ta luka podkreśla potrzebę modeli senescencji specyficznych dla melanocytów, które dokładniej odzwierciedlają ich fizjologiczne reakcje na stresory środowiskowe^18,19 oraz ich wkład w starzenie się ludzkiej skóry.

Mimo dostępności podejść do starzenia się indukowanego stresem, ich wdrożenie w pierwotnych ludzkich melanocytach jest nadal technicznie trudne i często wiąże się z znaczną zmiennością. Melanocyty są szczególnie wrażliwe na stres oksydacyjny, co powoduje wąskie okno eksperymentalne między skuteczną indukcją starzenia się a nadmierną cytotoksycznością. Ponadto różnice zależne od dawcy w preparatach komórek pierwotnych dodatkowo przyczyniają się do niekonsekwentnych wyników w badaniach. Te wyzwania są często niedostatecznie zgłaszane, a protokoły często nie są wystarczająco standaryzowane, co ogranicza ich powtarzalność. Obecny protokół radzi sobie z tą luką, dostarczając zoptymalizowanego i powtarzalnego schematu leczenia, zdefiniowanego harmonogramu dawkowania i standaryzowanych wyników do niezawodnej indukcji i oceny starzenia się w pierwotnych ludzkich melanocytach.

Tert-butylohydroperoksyd (tBHP) jest dobrze scharakteryzowanym induktorem stresu oksydacyjnego, który promuje starzenie się poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i wyczerpywanie obrony przeciwutleniającej komórek. Jest szeroko stosowany do indukowania starzenia się w fibroblastach skóry, gdzie wywołuje charakterystyczne markery starzenia się, zachowując jednocześnie żywotność komórek^20,21. Ponieważ tBHP wytwarza trwały stres oksydacyjny poprzez zdefiniowane ścieżki biochemiczne, oferuje powtarzalny i dostępny system do badania starzenia się indukowanego stresem oksydacyjnym oraz do badania mechanizmów molekularnych łączących uszkodzenia oksydacyjne z procesami starzenia się^22,23. W przeciwieństwie do modeli opartych na UV, tBHP jest szczególnie

Protokół

Protokół ten został zoptymalizowany na potrzeby badań nad pierwotnymi ludzkimi melanocytami noworodkowym (HNM) w celu zbadania mechanizmów przedwczesnego starzenia indukowanego stresem przez tBHP (Rysunek 1). Melanocyty pochodzą z noworodkowego obrzezania kaukaskiej skóry (lekka pigmentacja fototypu) i są uzyskiwane z komercyjnego źródła. Zgodnie z dokumentacją dostawcy, tkanki ludzkie są pobierane od darczyńców, którzy są w pełni poinformowani i wyrazili zgodę, zgodnie z obowiązującymi ramami etycznymi i prawnymi, w tym Deklaracją Helsińską i stosownymi przepisami dotyczącymi ochrony danych. Komórki były dostarczane w formie anonimowej. Żadna dodatkowa zgoda etyczna nie była wymagana do ich zastosowania w tym badaniu. Wszystkie eksperymenty były przeprowadzane przy użyciu tej samej linii melanocytów, aby zapewnić spójność. Należy pamiętać, że przy użyciu różnych pierwotnych linii komórkowych, warunki hodowli, a także stężenia i procedury obsługi, mogą wymagać dalszej korekty.

1. Przygotowania

UWAGA: Aby rozpocząć leczenie tBHP, melanocyty należy rozmrozić co najmniej na trzy dni przed rozpoczęciem, aby zapewnić wystarczającą regenerację i stopień konfluencji. Faza leczenia trwa 4 dni, przy czym dzień wysiewu jest dzień 0. Szczegóły wszystkich materiałów użytych w tym badaniu są podane w Tabeli Materiałów.

1. Aby przygotować medium hodowlane, połącz melanocytowe medium podstawowe z odpowiednimi czynnikami wzrostu. Przed dodaniem zawartości do medium zapalić pokrywkę każdej fiolki, aby zminimalizować skażenie. Dodaj 1% (v/v) PenStrep do przygotowanego medium i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Przed wysiewem przygotuj roztwór inhibitora trypsyny, rozcieńczając inhibitor trypsyny sojowej w DPBS. Przefiltruj roztwór przez membranę 0,22 μm, porcjuj i przechowuj w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu można go stosować przez maksymalnie 10 dni.

2. Rozmrażanie komórek (Dzień -3)

OSTROŻNIE: Wszystkie materiały stykające się z ludzkimi komórkami należy uważać za biologicznie zanieczyszczone i używać zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego instytucjonalnego. Aby ocenić starzenie, stosujemy uzupełniające testy oceniające zatrzymanie wzrostu, aktywność SA-β-gal i dodatkowe markery molekularne. Przedstawiamy tu protokoły tych testów i oczekiwane wyniki podczas pracy z tymi wskaźnikami starzenia.

1. Zapompnij 20 mL buforu fosforanowego Dulbecco (klasa kultury komórkowej) do 50 mL stożkowego pojemnika w temperaturze pokojowej. Utrzymuj fiolkę zawierającą komórki na lodzie do momentu rozmrożenia.
2. Zapal pokrywkę przed otwarciem fiolki zawierającej komórki, odkręć i zapal ponownie boki, aby zapobiec potencjalnemu skażeniu.
3. Przenieś 500 μL DPBS do fiolki zawierającej komórki. Delikatnie rozmroź komórki pipetując w górę i w dół, a następnie przenieś całą zawartość do pojemnika.
4. Wiruj przez 5 min w temperaturze pokojowej przy 100 x g. Powstały pellet powinien mieć kolor beżowy do brązowego (lub ciemniejszy, w zależności od etniczności dawcy).
5. Przygotuj kolbę T75 z 14 mL melanocytowego medium.
6. Zapal szklaną pipetkę Pasteur (zapalać za każdym razem, gdy obsługuje się melanocyty), ostrożnie zasysaj DPBS i zawieś pellet w 1 mL medium.
7. Przenieś do wcześniej przygotowanej kolby.
8. Inkubatoruj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i obserwuj codziennie pod mikroskopem. Zmieniaj medium co najmniej co 48 godzin.
   ​UWAGA: Każda krioprzechowalnicza fiolka zawiera około 1 x 10⁶ pierwotnych ludzkich melanocytów. Wszystkie eksperymenty były przeprowadzane przy użyciu komórek w przesiąku 9.

3. Wysiew komórek (Dzień 0)

1. Upewnij się, że stopień konfluencji komórek wynosi 80–90% w dniu wysiewu.
2. Zasysaj medium z kolby i przemyj dwukrotnie DPBS.
3. Odłącz komórki dodając 2 mL roztworu trypsyny-EDTA i inkubacją przez 5 min w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
4. Delikatnie stuknij kolbę i obserwuj pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowite oderwanie komórek (jeśli konieczne, inkubować dłużej).
5. Zatrzymaj reakcję dodając 1,5-krotną objętość inhibitora trypsyny.
6. Przenieś zawiesinę komórek do 15 mL stożkowego pojemnika i rozcieńcz DPBS do końcowej objętości 10 mL.
7. Wiruj zawiesinę komórek przez 5 min przy 100 x g.
8. Zasysaj nadstan i zawieś ponownie w pożądanej objętości w medium.
9. Dla płytek leczonych tBHP wysiej 6 x 10⁵ komórek na 10 cm potrawkę. Dla płytek kontrolnych wysiew 4 x 10⁵ komórek na płytkę.
   UWAGA: Dla płytek lecz

Wyniki

Opracowanie tBHP indukuje zahamowanie wzrostu w ludzkich neonatalnych melanocytach.
Traktowanie tBHP hamuje proliferację melanocytów w porównaniu z nieleczonymi kontrolami (n = 3) (Rysunek 2A). Do 9. dnia leczone komórki osiągają jedynie 1,4 cPDL, podczas gdy kontrole osiągają 3,1 cPDL. Rozbieżność ta zwiększa się z czasem; w 15. dniu leczone melanocyty zbliżają się do plateau na poziomie 1,9 cPDL, podczas gdy kontrole nadal namnażają się do niemal 5,1 cPDL. Trwałe ogr...

Dyskusja

Ten protokół ustanawia standaryzowany podchod do indukowania przedwczesnego starzenia wywołanego stresem (SIPS) w ludzkich neonatalnych melanocytach za pomocą tBHP, oferując solidny model do badania starzenia się specyficznie dla tego typu komórek. Konsekwentne zmiany w proliferacji, morfologii, aktywności SA-β-gal, markerach uszkodzenia DNA oraz składnikach SASP wspierają indukowany fenotyp. Koncentrując się na melanocytach, komórkach, które pozostają niedostatecznie zbadane w badaniach nad starzeniem, mimo ich kluczowy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.22 µm membrane filter	Merck	SLGVR33RS
1 M citric acid	Merck	K91567844	przygotować w aq. dest.
1 M MgCl2	Merck	A649033	przygotować w aq. dest.
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	przygotować w aq. dest.
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	przygotować w aq. dest.
37% formaldehyde	Sigma	252549
4% paraformaldehyde	CarlRoth	0335.3
5 M Sodium Chloride	Sigma	S3014	przygotować w aq. dest.
50% glutaraldehyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (bovine serum albumin)	Sigma	A7030
Chemiluminescent substrate	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Coverslips for cell culture/microscopy	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal Medium	CellSystems	LM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit	CellSystems	LS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Human neonatal melanocytes	CellSystems	FC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)	Abcam	AB16048	Rozcieńczenie 1:1000 w 5% BSA
Mounting medium containing DAPI	Abcam	AB104139
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P4333
Polyacrylamide gradient gels	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Potassium ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium ferrocyanide	Sigma	P-9387
pRB antibody (rabbit)	CellSignalling	93085	Rozcieńczenie 1:1000 w 5% BSA
Protease inhibitor cocktail	self prepared	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer	self prepared	N/A	zawierający: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT buffer	Qiagen	1015762	Included in RNeasy Mini Kit
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)	Sigma	70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)	Sigma	S4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)	Sigma	T9284
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-mercaptoethanol	CarlRoth	4227.3
γH2AX antibody (rabbit)	CellSignalling	2577S	Rozcieńczenie 1:200