Artykuł metodologiczny

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

DOI:

10.3791/70602

⸱

10 kwietnia 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cechą charakterystyczną wczesnej embriogenezy jest szybkie, wykładnicze zmniejszanie rozmiaru pojedynczych komórek, podczas gdy całkowita objętość zarodka pozostaje stała. Stosunek nukleocytoplazmatyczny (N:C) odgrywa kluczową rolę w regulacji aktywności komórkowej i molekularnej niezbędnej do wczesnej embriogenezy. Fizyczna manipulacja rozmiarem zarodka stanowi zatem ważny sposób badania tych mechanizmów rozwojowych. Duży rozmiar (~ 1,2 mm średnicy) oraz wysoka plastyczność rozwojowa wczesnych zarodków Xenopus laevis czynią je idealnym modelem do fizycznej sekcji i manipulacji w celu analizy mechanizmów regulacyjnych rozwoju. Tutaj opisujemy podejście do generowania mini embrionów o zmienionej objętości cytoplazmatycznej i stosunku N:C poprzez zwężenie jednokomórkowych zarodków Xenopus laevis za pomocą węzłów włosowych. Uzyskane mini embriony wykazano, że inicjują wczesną aktywację genomu zygoticznego (ZGA), bezpośrednio wywołaną przez zmniejszenie wielkości komórek i wzrost stosunku N:C. Te mini embriony, które można uogólnić na inne systemy embrionalne, stanowią zatem unikalne, potężne narzędzie do rozkładania mechanizmów wczesnego rozwoju zarodków zależnych od rozmiaru.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z najbardziej uderzających cech wczesnej embriogenezy jest wykładnicze zmniejszanie rozmiaru poszczególnych komórek w zarodku, który utrzymuje stałą objętość. Szybka synteza DNA i zmniejszenie rozmiaru komórek prowadzą do wzrostu stosunku nukleocytoplazmatycznego (stosunek N:C), który odgrywa ważną rolę w regulacji kilku kluczowych aktywności przejścia środkowego blastuli (MBT) w modelowych układach embrionalnych, w tym transkrypcji genów zygotycznych, wydłużenia cyklu komórkowego oraz ruchliwości komórek 1,2,3,4 . Manipulacje stosunkiem N:C poprzez zmianę ploidii DNA potwierdzają jego funkcjonalne znaczenie we wczesnej embriogenezie w kilku systemach modelowych 3,4,5,6.

Fizyczna manipulacja rozmiarem zarodka stanowi ważną technikę badania mechanizmów regulacyjnych we wczesnym rozwoju embrionalnym7. Usuwanie cytoplazmatyczne przez aspirację, które zmienia stosunek N:C we wczesnych zarodkach myszy, indukuje przedwczesne zagęszczenie8. Co więcej, zmniejszenie wielkości zarodka danio pręgowanego przez cięcie ujawniło nowy mechanizm gradientowy skalowania somitu9. Ponadto zmniejszenie objętości cytoplazmatycznej w embrionach Xenopus ujawniło zależną od stosunku N:C dynamikę cyklu komórkowego10. Co ważne, poprzez generowanie mini embrionów Xenopus poprzez redukcję rozmiaru komórek i oznaczanie początkujących transkryptów 5-etynylo-urydyną (5-EU) w pojedynczych komórkach, wykazaliśmy, że zmniejszenie rozmiaru komórek indukuje aktywację genomu zygoticznego (ZGA) w sposób zależny od dawki11. Wyniki te potwierdzają kluczową rolę wielkości komórek we wczesnej embriogenezie.

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę generowania mini embrionów Xenopus laevis poprzez fizyczną manipulację za pomocą węzłów do włosów (Rysunek 1)10,11. Podejście to opiera się na podstawowym zastosowaniu Newporta i Kirschnera (1982) zwężania pętli włosowej na wczesnych zarodkach Xenopus 1, dostarczając jasny i wiarygodny protokół generowania mini embrionów jako narzędzi eksperymentalnych. Dodatkowo ta metoda jest stosowalna w innych systemach embrionalnych7, co ułatwia odkrywanie nowych mechanizmów wczesnej embriogenezy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotowywanie rozwiązań
    1. Przygotuj 20× MMR przez mieszanie 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl2 i 40 mM CaCl2. Ustaw pH do 7,8 z NaOH. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj roztwór medium gradientu gęstości 3% (masa/vol), mieszając 1,5 g medium gradientu gęstości z 50 mL 0,5× MMR. Delikatnie mieszaj magnetycznym batykiem, aż polimer się rozpuści. Utrzymuj temperaturę 4 °C do użycia.
    3. Przygotuj żel agarozowy o pojemności 1% w 60-mm szalce Petriego, mieszając 0,5 g agarozy z 50 mL 0,1× MMR. Podgrzej w mikrofalówce, aby rozpuścić agarozę, a następnie dodaj 5 ml agarozy, aby pokryć dno 60-mm miski Petriego cienką warstwą.
  2. Przygotowanie węzłów do zaciśnięć zarodków
    1. Weź kilka cienkich włosów i przetnij je na kawałki ~5 cm.
    2. Użyj pęsety, aby włożyć jeden koniec włosów do końcówki P10 o głębokości około ~1 cm.
    3. Nałóż wosk na łyżkę i podgrzej ją, żeby stopić wosk. Szybko zanurz końcówkę P10 z włosami w wosku i pozwól wyschnąć przez 1 minutę. Upewnij się, że włosy są utrwalone na końcu końcówki P10.
    4. Użyj pęsety, aby ostrożnie zrobić supeł z włosów nad głową. Dostosuj rozmiar pętli na ~1,5 mm. Przytnij zwis, jeśli trzeba. Odłóż węzeł na bok na przyszłość.
    5. Powtarzaj powyższe kroki, aby w razie potrzeby zrobić więcej węzłów do włosów.

2. Tworzenie mini embrionów Xenopusa

  1. Aby uzyskać zarodki Xenopusa , należy stosować standardowy protokół przeprowadzania zapłodnienia in vitro (IVF) (na przykład zob. Sive i in., 2007)12. Zarodek powinien mieć 0,1× MMR i być gotowy do użycia.
  2. Aby zobrazować ZGA w pojedynczych komórkach wczesnych embrionów i zbadać ich mechanizmy regulacyjne, mikrowstrzyknij zarodkom w stadium 1 komórki 5-etynylo-urydynę (5-EU), aby metabolicznie oznaczać początkujące transkrypty11,13, zanim przejdziesz do następujących procedur.
  3. Gdy zarodki są w stanie ~1 godziny po zapłodnieniu (hpf), użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść ~20 zarodków do 60-mm szalki Petriego (pokrytej żelem 1% agarozowym) zawierającej ~15 mL 3% pożywki gradientowej gęstości/0,5× MMR.
  4. Użyj pęsety w jednej ręce, aby obrócić zarodek pod stereomikroskopem o ~45–60 stopni, aby uzyskać dostęp do bieguna roślinnego (bladej półkuli). Trzymaj przechylony zarodek pęsetą, a w drugiej ręce użyj igły 30G, aby ostrożnie przekłuć wędkę roślinną. Uwolnij trochę cytoplazmy, delikatnie naciskając zarodek.
  5. Ostrożnie zakryj węzeł do włosów zamontowany w końcówce P10 na zarodku, tak aby zwierzęcy słup (ciemna półkula) znajdował się wewnątrz węzła. Dostosuj pozycję węzła zgodnie z pożądanym rozmiarem mini zarodka.
  6. Trzymaj pipetę P10 jedną ręką, a pęsetą drugą pociągaj oba końce węzła w przeciwnych kierunkach. Węzeł włosowy zaciska się wokół zarodka, pomiędzy biegunem zwierzęcia (nienaruszonym) a biegunem roślinnym (uwalnianym cytoplazmą). Odetnij węzeł w miejscu, gdzie przyczepia się do końcówki P10.
  7. Powtórz kroki 2.4–2.6 powyżej, aby uzyskać pożądaną liczbę mini embrionów.
  8. Pozwól, by zarodki pozostały w średniej gęstości gradientu 3% / 0,5× MMR przez ~1–2 godziny. Następnie usuń podłoże pipetą P1000 bez zakłócania zarodków i uzupełnij 15 mL 0,1× MMR.
  9. Pozwól zarodkom rozwinąć się w pożądane stadia, a następnie użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć supełki z mini zarodków.
  10. Zbieraj zarodki do pożądanej analizy, na przykład wizualizując ZGA w pojedynczych komórkach11,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki Xenopus laevis w stadium jednokomórkowym były zwężone przez węzły włosowe, jak opisano powyżej. Kontrolne i mini zarodki w ~Stadium 9 (8,5 hpf przy 23 °C) zostały zobrazowane pod stereomikroskopem. Jak pokazano na Rysunku 2, objętość niektórych mini zarodków jest ~1/3 objętości zarodków kontrolnych. Ten wynik sugeruje, że wczesne zarodki Xenopusa mogą być manipulowane w celu generowania mini embrionów, co stanowi unikalny model do badania wpływu wielkości komórek na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę generowania mini-embrionów u Xenopus poprzez fizyczne zwężenie zarodków w stadium 1 komórki za pomocą splotów włosowych. To podejście dostarcza bezpośrednich dowodów na to, że zmniejszenie rozmiaru komórek indukuje ZGA w zarodkumodelowym 11.

Kilka aspektów tego protokołu jest kluczowych dla skutecznego generowania mini-embrionów. Aby zrobić supełki do włosów, ważne jest używanie cienkich, trwałych włosów, najlepiej tych dla niemowląt. Im ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za zapewnienie szkoleń. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 30-GBD Medical305128Do przebijania embrionów
Jednorazowe szalki Petriego 60 mmVWR25384-092Do inkubujących się zarodków
Stereomikroskopy ACCU-SCOPE 3075 ZoomVWR470351-130Do wizualizacji zarodków
AgaroseSigma-AldrichA-9414Do powlekania szalek Petriego
Pinceta Dumont, styl 5Nauki o mikroskopii elektronowej72701-DDo dopracowywania i przechowywania embrionów
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Do inkubujących się zarodków
TipOne Pipette Tip, 10 & micro; LUSA Scientific1111-3700Do mocowania węzłów do włosów
Blok woskowy,Carolina Biological Supply Co.974228Do mocowania węzłów do włosów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja wielko ci zarodkastosunek j drowo cytoplazmatycznywczesna embriogenezaaktywacja genomufizyczne zw enieobj to cytoplazmyzap odnienie in vitrostereomikroskopiaregulacja wielko ci kom rek

Powiązane artykuły