Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cechą charakterystyczną wczesnej embriogenezy jest szybkie, wykładnicze zmniejszanie rozmiaru pojedynczych komórek, podczas gdy całkowita objętość zarodka pozostaje stała. Stosunek nukleocytoplazmatyczny (N:C) odgrywa kluczową rolę w regulacji aktywności komórkowej i molekularnej niezbędnej do wczesnej embriogenezy. Fizyczna manipulacja rozmiarem zarodka stanowi zatem ważny sposób badania tych mechanizmów rozwojowych. Duży rozmiar (~ 1,2 mm średnicy) oraz wysoka plastyczność rozwojowa wczesnych zarodków Xenopus laevis czynią je idealnym modelem do fizycznej sekcji i manipulacji w celu analizy mechanizmów regulacyjnych rozwoju. Tutaj opisujemy podejście do generowania mini embrionów o zmienionej objętości cytoplazmatycznej i stosunku N:C poprzez zwężenie jednokomórkowych zarodków Xenopus laevis za pomocą węzłów włosowych. Uzyskane mini embriony wykazano, że inicjują wczesną aktywację genomu zygoticznego (ZGA), bezpośrednio wywołaną przez zmniejszenie wielkości komórek i wzrost stosunku N:C. Te mini embriony, które można uogólnić na inne systemy embrionalne, stanowią zatem unikalne, potężne narzędzie do rozkładania mechanizmów wczesnego rozwoju zarodków zależnych od rozmiaru.
Wprowadzenie
Jedną z najbardziej uderzających cech wczesnej embriogenezy jest wykładnicze zmniejszanie rozmiaru poszczególnych komórek w zarodku, który utrzymuje stałą objętość. Szybka synteza DNA i zmniejszenie rozmiaru komórek prowadzą do wzrostu stosunku nukleocytoplazmatycznego (stosunek N:C), który odgrywa ważną rolę w regulacji kilku kluczowych aktywności przejścia środkowego blastuli (MBT) w modelowych układach embrionalnych, w tym transkrypcji genów zygotycznych, wydłużenia cyklu komórkowego oraz ruchliwości komórek 1,2,3,4 . Manipulacje stosunki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej.
1. Przygotowanie materiałów
- Przygotowywanie rozwiązań
- Przygotuj 20× MMR przez mieszanie 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl2 i 40 mM CaCl2. Ustaw pH do 7,8 z NaOH. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj roztwór medium gradientu gęstości 3% (masa/vol), mieszając 1,5 g medium gradientu gęstości z 50 mL 0,5× MMR. Delikatnie mieszaj magnetycznym batykiem, aż polimer się rozpuści. Utrzym....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zarodki Xenopus laevis w stadium jednokomórkowym były zwężone przez węzły włosowe, jak opisano powyżej. Kontrolne i mini zarodki w ~Stadium 9 (8,5 hpf przy 23 °C) zostały zobrazowane pod stereomikroskopem. Jak pokazano na Rysunku 2, objętość niektórych mini zarodków jest ~1/3 objętości zarodków kontrolnych. Ten wynik sugeruje, że wczesne zarodki Xenopusa mogą być manipulowane w celu generowania mini embrionów, co stanowi unikalny model do badania wpływu wielkości komórek na.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisujemy metodę generowania mini-embrionów u Xenopus poprzez fizyczne zwężenie zarodków w stadium 1 komórki za pomocą splotów włosowych. To podejście dostarcza bezpośrednich dowodów na to, że zmniejszenie rozmiaru komórek indukuje ZGA w zarodkumodelowym 11.
Kilka aspektów tego protokołu jest kluczowych dla skutecznego generowania mini-embrionów. Aby zrobić supełki do włosów, ważne jest używanie cienkich, trwałych włosów, najlepiej tych dla niemowląt. Im .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za zapewnienie szkoleń. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła 30-G | BD Medical | 305128 | Do przebijania embrionów |
| Jednorazowe szalki Petriego 60 mm | VWR | 25384-092 | Do inkubujących się zarodków |
| Stereomikroskopy ACCU-SCOPE 3075 Zoom | VWR | 470351-130 | Do wizualizacji zarodków |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9414 | Do powlekania szalek Petriego |
| Pinceta Dumont, styl 5 | Nauki o mikroskopii elektronowej | 72701-D | Do dopracowywania i przechowywania embrionów |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | GE17-0300-10 | Do inkubujących się zarodków |
| TipOne Pipette Tip, 10 & micro; L | USA Scientific | 1111-3700 | Do mocowania węzłów do włosów |
| Blok woskowy, | Carolina Biological Supply Co. | 974228 | Do mocowania węzłów do włosów |
Bibliografia
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
