Ten protokół opisuje montaż i użycie nowego gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin zaprojektowanego do akomodacyjnia zbóż i zweryfikowanego na pszenicy i kukurydzy. Ten gnotobiotyczny system roślin umożliwia kontrolowane eksperymenty roślina-mikrob przez zapewnienie sterylnych warunków wzrostu, zarządzania nawadnianiem i zgodności z różnorodnymi podłożami glebowymi.
Artykuł metodologiczny
Zgromadzenie i użycie gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin do badań nad interakcją roślina-mikrob w zbożach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwój mikrobiologicznych modyfikacji rolniczych, które działają spójnie na polu, wymaga zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji roślina-mikrob. Badanie tych podstawowych mechanizmów interakcji wymaga możliwości uprawiania roślin w warunkach sterylnych i gnotobiotycznych (tj. wszystkie mikroorganizmy współpracujące z rośliną są znane, czy chodzi o wolne od zarodników, zdefiniowane społeczności mikrobiologiczne, czy naturalne społeczności). Obecnie dostępne systemy gnotobiotyczne dla roślin nie nadają się do badania dużych roślin o znaczeniu rolniczym, takich jak zboża. Co więcej, większość tych systemów nie posiada możliwości zarządzania nawadnianiem. Wprowadzamy tutaj GNOVA, nowy system gnotobiotyczny zaprojektowany do akomodacyjnego rosnącej zbóż z możliwością zarządzania nawadnianiem. Ten nowy system to dostępna platforma składająca się z 3D drukowanej podstawy i komercyjnie dostępnych materiałów. Ten protokół zapewnia krok po kroku przewodnik po montażu systemu i konfiguracji eksperymentu. Ponadto przedstawiamy porównanie wydajności GNOVA z systemem worków gnotobiotycznych. GNOVA wydłużył wzrost roślin z dwóch tygodni w systemie worków do 17 tygodni dla pszenicy i 4 tygodni dla kukurydzy. Współczynnik kiełkowania obu roślin również wzrósł w obrębie GNOVA z 66% do 100% dla pszenicy i z 75% do 100% dla kukurydzy. Pszenica rosnąca w obrębie GNOVA wykształciła kłosy, które były nieobecne u roślin tego samego wieku w systemie worków. Świeża waga kukurydzy rosnącej w GNOVA była o 594% wyższa niż w systemie worków. Ponadto wysokość pędów i długość korzeni kukurydzy były o 89% i 57% większe w systemie GNOVA niż w workach, odpowiednio. System GNOVA rozszerza zestaw narzędzi dostępnych dla naukowców do badania interakcji roślina-mikrobiota poza etapem siewek w zbożach poprzez zapewnienie większej przestrzeni do wzrostu i zarządzania nawadnianiem.
Wprowadzenie
Opracowania rolnicze oparte na drobnoustroju wzbudzają znaczące zainteresowanie od kilku ostatnich dekad ze względu na ich potencjał polepszenia wydajności upraw poprzez poprawę wzrostu roślin i odporności na stres środowiskowy. Jednocześnie mechanizmy działania molekularnego tych biostymulantów pozostają słabo poznane, co może przyczyniać się do ich niekonsekwentnych wyników w różnych glebach, lokalizacjach i warunkach środowiskowych1,2. Popieranie poprawy efektywności istniejących opracowań opartych na drobnoustroju oraz rozwój nowych technologii wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji roślina–mikrob3,4. Jednakże rozdzielanie tych mechanizmów pozostaje wyzwaniem z powodu złożoności naturalnych społeczności mikrobiologicznych5,6. Aby zidentyfikować drobnoustroje i interakcje mikrobialne napędzające korzyści dla roślin, możemy zmniejszyć złożoność naturalnych systemów poprzez zastosowanie syntetycznych społeczności mikrobiologicznych (SynComs) w systemach wzrostowych, które pozwalają na kontrolowanie warunków środowiskowych i społeczności mikrobiologicznej. Gnotobiologię, badanie gospodarzy związanych z określonymi społecznościami mikrobiologicznymi7, pozwala badaczom porównywać wolne od zaraz gospodarzy z tymi skolonizowanymi znanymi społecznościami mikrobiologicznymi w celu powiązania funkcji mikrobiologicznej z fenotypem rośliny8.
Wczesne systemy gnotobiotyczne były budowane za pomocą szklanych probówek9,10,11,12 i słoików13. Od tego czasu, zobaczyliśmy szybki rozwój nowych systemów opracowanych do badania roślin gnotobiotycznie. Najczęściej stosowane systemy dziś obejmują użycie naleśników Petriego14, probówek15,16, szklanych słoików17, magenta boxów18, uszczelnionych torebek19, hydroponicznych20, FlowPot i GnotoPot21, systemów mikrofluidycznych22 i EcoFAB23. Mimo tego postępu, większość systemów jest albo zoptymalizowana pod kątem obrazowania22 lub zbierania eksudatów17,20 albo zaprojektowana dla małych gatunków modelowych14,18,21. Wiele to zamknięte systemy, które ograniczają kontrolę nawadniania i czas trwania eksperymentu. Te ograniczenia stanowią wyzwanie dla badań nad większymi roślinami rolniczymi, takimi jak zboża, które wymagają dodatkowego miejsca, przepływu powietrza i zarządzania wodą.
Rozumiejąc potrzebę systemu, który może pomieścić większe rośliny i dłuższe badania, ostatnio opracowano EcoFAB 3.0, aby rozszerzyć gnotobiotyczne uprawy na większe rośliny24. EcoFAB 3.0 oferuje większy objętość korzeni i przestrzeni głowowej, co wspiera wzrost Sorghum bicolor do 4 tygodni i pozwala na zbieranie eksudatów i obrazowanie korzeni24. Mimo że ten nowy system jest obiecującym przykładem rozszerzenia gnotobiotycznych systemów na uprawy rolnicze, nadal istnieje potrzeba dostępnej i wszechstronnej platformy, która może być łatwo przyjęta w laboratoriach i jest kompatybilna z szerokim zakresem przepływów eksperymentów. Z tego powodu opracowałyśmy GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), system zaprojektowany do akomodacyjnia upraw zbożowych w warunkach gnotobiotycznych. Tutaj, dostarczamy szczegółowy protokół montażu i eksploatacji GNOVA oraz demonstrujemy jego wydajność w porównaniu z gnotobiotycznym systemem torebkowym rutynowo używanym w naszym laboratorium. Dzięki opracowaniu tego nowego systemu, poprawiliśmy zdolność do uprawiania pszenicy i kukurydzy w warunkach sterylnych, zapewniając większą przestrzeń do wzrostu i wbudowane nawadnianie w porównaniu z wcześniejszymi zamkniętymi systemami. Wydajność GNOVA jest porównywalna z EcoFAB 3.0, rozszerzając tym samym arsenał narzędzi do badania interakcji roślina—mikrobiota u nie-modelowych upraw zbożowych. Co więcej, wszechstronność i przystosowawczość gnotobiotyki roślin są zwiększone przez prosty projekt GNOVA, użycie komercyjnie dostępnych materiałów i dostępne pliki obiektów 3D, które pozwalają badaczom zmieniać materiały i projekt aby dostosować ich potrzeby badań i budżet.
Protokół
UWAGA: Pliki do druku 3D podstawy znajdują się w materiałach uzupełniających i są publicznie dostępne w bazie Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Ze względu na szybkość i efektywność kosztową zalecamy druk masowy w lokalnych komercyjnych punktach usług druku 3D.
1. Montaż systemu gnotobiotycznego
- Rozpocznij montaż doniczki (wykonaj raz przed wielokrotnym użyciem eksperymentalnym).
- Zamknij dno doniczki, kładąc stalowy krążek z siatki na jednym końcu rurki poliwęglanowej i mocując go za pomocą opaski zaciskowej (Rysunek 1A).
- Wywierć otwory nawadniające, tworząc otwór nawadniający o średnicy 1/4 cala (6,35 mm) w odległości 1,5 cm od górnej krawędzi otwartego końca rurki poliwęglanowej. Wywierć dwa otwory o szerokości 1/8 cala (3,18 mm) w odległości 3 cm od pierwszego otworu, przy czym jeden otwór powinien znajdować się 1 cm od krawędzi, a drugi 2 cm od otworu górnego.
UWAGA: W razie potrzeby wokół górnej krawędzi doniczki można dodać dodatkowe linie rurek, postępując zgodnie z tymi samymi krokami. - Zainstaluj rurkę nawadniającą, wkładając krótki odcinek rurki silikonowej przez otwór 1/4 cala.
- Zabezpiecz rurkę, przeplatając opaskę zaciskową przez dwa otwory ⅛ cala (Rysunek 1B). Włóż męski konektor luer złączki 1 do rurki silikonowej wystającej na zewnątrz doniczki (Rysunek 1C).
UWAGA: Barb rurkowy złączki 1 powinien pozostać odsłonięty. - Przygotuj korpusy strzykawek, wypełniając pusty korpus strzykawki wełną szklaną i zamykając koniec małym kawałkiem folii aluminiowej (Rysunek 1C).
- Przymocuj krótki odcinek rurki silikonowej do końca luer lock korpusu strzykawki (Rysunek 1C).
- Przygotuj dwa identyczne korpusy strzykawek. Przymocuj jeden z przygotowanych korpusów strzykawki do odsłoniętego barbu rurkowego złączki 1 na rurce wystającej z doniczki (Rysunek 1D).
- Przerwa: Zmontowane doniczki można przechowywać do późniejszego wykorzystania w eksperymentach.
Rycina 1: Montaż doniczki. A>) Dno doniczki zamknięte siatką drucianą i opaską zaciskową. (B>) Otwór nawadniający na górnej krawędzi doniczki. (C>) Linia nawadniająca zakończona odsłoniętą kostką przyłączeniową Złączki 1 z przygotowaną rurką strzykawki. (D>) Zmontowana doniczka z zamkniętą linią nawadniającą Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Przygotowanie doniczek do eksperymentu (należy wykonać przed każdym nowym eksperymentem)
- Wyłóż dno doniczki dwoma wcześniej wyciętymi okręgami z włóknistej owijki do rur (Ryc. 2A).
- Przygotuj podłoże glebowe, mieszając dwie części gliny z jedną częścią piasku. Wsyp do doniczki 840 mL podłoża.
- Przykryj doniczki plastikową zakrętką i zabezpiecz taśmą (Ryc. 2B).
- Autoklawuj wypełnione doniczki w cyklu suchym w temperaturze 121 °C przez 30 min. Pozostaw do wystygnięcia na noc z założonymi plastikowymi zakrętkami. Ponownie autoklawuj w cyklu suchym w temperaturze 121 °C przez 30 min. Pozostaw do całkowitego ostygnięcia. Przechowuj doniczki przykryte plastikową zakrętką.
UWAGA: Można stosować inne podłoża glebowe, jednak ilość potrzebna na jedną doniczkę powinna zostać zoptymalizowana wcześniej. GNOVA testowano również z 800 mL 100% gliny oraz 1 L 100% piasku. Inne podłoża glebowe mogą wymagać większej liczby cykli autoklawowania lub innych ustawień w celu pełnej sterylizacji.
OSTROŻNIE: Należy zachować ostrożność podczas wyjmowania doniczek z autoklawu, ponieważ materiał będzie gorący, a opaski zaciskowe mogą się poluzować. Przed podniesieniem doniczek upewnij się, że opaski zaciskowe są dokręcone palcami po ostygnięciu. - Włóż wystudzone doniczki do wydrukowanej w technologii 3D podstawy. Umieść doniczkę wypełnioną glebą wewnątrz podstawy 3D. Trzymaj doniczkę za podstawę, a nie za filary otworu, ponieważ są one najbardziej kruchą częścią.
- Przeciągnij rurkę irygacyjną przez jeden z dolnych otworów podstawy 3D (Ryc. 2C).
UWAGA: Nie autoklawuj podstawy wsporczej wydrukowanej w 3D, ponieważ element mógłby się stopić. Eksperymenty wymagające temperatur powyżej 60 °C mogą wymagać zastosowania alternatywnego filamentu odpornego na ciepło (patrz Tabela materiałów). - Po autoklawowaniu przechowuj doniczki w temperaturze pokojowej; nie zdejmuj plastikowej zakrętki ani nie usuwaj przygotowanej strzykawki aż do końcowego etapu konfiguracji eksperymentu.
Rysunek 2: Ilustracja przygotowanego naczynia. (A) Dno naczynia wyłożone włóknistą owijką do rur. (B) Góra naczynia zamknięta plastikową zakrętką. (C) Puste naczynie dopasowane do końcowej konstrukcji podstawy wydrukowanej w technologii 3D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Przygotowanie cylindra szklanego (należy wykonać przed każdym nowym eksperymentem)
- Jeden koniec cylindra szklanego przykryć dociętym filtrem DW4 i zabezpieczyć go za pomocą taśmy winylowej (Rysunek 3A).
- Obrócić cylinder szklany drugim otwartym końcem i zamocować wewnątrz rurki pierścień bawełniany w odległości 14 cm od krawędzi. Pierścień bawełniany zabezpieczyć taśmą chirurgiczną (Rysunek 3B).
- Dolny koniec cylindra zamknąć folią do sterylizacji, mocując ją za pomocą dwóch gumek recepturek (Rysunek 3B).
- Przygotowane cylindry szklane autoklawować w cyklu suchym w temperaturze 121 °C przez 30 min przed użyciem. Po autoklawowaniu przechowywać sterylne cylindry szklane w temperaturze pokojowej do momentu użycia, nie usuwając folii.
Rycina 3: Montaż cylindra szklanego. (A) Górny koniec cylindra szklanego zamknięty za pomocą medium filtrującego DW4 i taśmy winylowej. (B) Dolny koniec cylindra szklanego wyposażony w pierścień bawełniany i zamknięty folią do sterylizacji oraz gumkami recepturkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Przygotowanie filtra nawadniającego (należy przeprowadzić przed każdym podlewaniem, z wyjątkiem kroków 1.4.4–1.4.6, które należy wykonać tylko raz)
- Zmontować uchwyt filtra, umieszczając membranę filtra PES (Rysunek 4A.4) pomiędzy uchwytem filtra (Rysunek 4A.5) a dyskiem filtra (Rysunek 4A.3).
- Zorientować gładką stronę membrany filtra w kierunku wypływu, tak aby była skierowana ku górnej części uchwytu filtra (Rysunek 4A.1).
- Osadzić pierścień O-ring (Rysunek 4A.2) w górnej części uchwytu filtra (Rysunek 4A.1). Przymocować górną część filtra do uchwytu filtra. Dokręcić wyłącznie ręcznie.
- Przymocować złączki. Wsunąć męski koniec złączki 2 do górnego portu uchwytu filtra.
- Przymocować krótki odcinek rurki silikonowej do króćca węża na filtrze (Rysunek 4B). Wsunąć męski luer złączki 1 do końca drugiego przygotowanego korpusu strzykawki z kroku 1.1.6 (Rysunek 4B).
- Połączyć filtr z króćcem węża na przygotowanym korpusie strzykawki.
- Zautoklawować zmontowane filtry w cyklu suchym w temperaturze 121 °C przez 30 min. Dokręcić filtry po ich ostygnięciu i przed użyciem.
UWAGA: Zaleca się przygotowanie wszystkich potrzebnych filtrów i ich autoklawowanie w zamkniętym pudełku z polipropylenu. Po autoklawowaniu filtry nawadniające można przechowywać sterylnie w temperaturze pokojowej do momentu użycia, pod warunkiem nieodłączania przygotowanej strzykawki.
Rysunek 4: Montaż uchwytu filtra. (A) Rozłożone elementy uchwytu filtra: 1. Górna część uchwytu filtra, 2. O-ring, 3. Dysk filtra, 4. Membrana filtra oraz 5. Uchwyt filtra. (B) Zmontowany uchwyt filtra wraz z odpowiednio przygotowanym korpusem strzykawki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Przygotowanie eksperymentu
- Przygotować i wysterylizować roztwory oraz materiały co najmniej jeden dzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Przygotować pożywkę do wzrostu roślin Murashige i Skoog 0,5X zgodnie z instrukcjami producenta. Autoklawować pożywkę w cyklu dla cieczy w temperaturze 121 °C przez 30 min.
- Autoklawować rozmontowany dozownik nakrętkowy do butelek w cyklu dla suchego sprzętu w temperaturze 121 °C przez 30 min. Autoklawować 1 L wody dejonizowanej w cyklu dla cieczy w temperaturze 121 °C przez 30 min.
- Autoklawować szklane płytki Petriego, zlewki 500 mL, sitka herbaciane i pęsety w cyklu dla suchego sprzętu w temperaturze 121 °C przez 30 min z jednodniowym wyprzedzeniem.
UWAGA: O ile nie wskazano inaczej, poniższe kroki należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę aseptyczną.
- Przeprowadzić sterylizację powierzchniową nasion.
UWAGA: Protokół sterylizacji powierzchniowej nasion zależy od użytego gatunku rośliny. System gnotobiotyczny został przetestowany zarówno dla pszenicy, jak i kukurydzy, stosując następujące protokoły sterylizacji nasion.
OSTROŻNIE: Podczas pracy z wybielaczem i podchlorynem sodu należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki i okulary ochronne, ponieważ substancje te mogą działać drażniąco lub żrąco na skórę i oczy. Etanol jest łatwopalny; nie używać w pobliżu otwartego ognia.- Sterylizacja nasion pszenicy25
- Napełnić dwie zlewki 150 mL 95% v/v etanolu, jedną zlewkę 150 mL nierozcieńczonego wybielacza domowego oraz dwie zlewki 150 mL wody.
- Umieścić nasiona pszenicy w sitku herbacianym. Delikatnie potrząsać sitkiem z nasionami w jednej z zlewki z 95% v/v etanolem przez jedną minutę.
- Przenieść nasiona do nowego sitka herbacianego. Delikatnie potrząsać sitkami z nasionami w wybielaczu przez 10 min.
- Przenieść nasiona do nowego sitka herbacianego. Delikatnie potrząsać sitkami z nasionami w drugiej zlewce z 95% v/v etanolem.
- Delikatnie potrząsać sitkami z nasionami w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 30 s. Delikatnie potrząsać sitkami z nasionami w drugiej zlewce ze sterylną wodą dejonizowaną przez 2 min. Umieścić sterylne nasiona w pustej, sterylnej płytce Petriego.
- Sterylizacja nasion kukurydzy26
- Umieścić nasiona kukurydzy w probówce stożkowej 50 mL. Napełnić probówkę stożkową 70% v/v etanolem. Delikatnie odwracać probówkę stożkową przez 3 min.
- Odlać 70% etanol i napełnić probówkę stożkową z nasionami 2% v/v podchlorynem sodu. Delikatnie odwracać probówkę stożkową przez 3 min.
- Odlać 2% podchloryn sodu i wypłukać nasiona sterylną wodą dejonizowaną. Odlać wodę i wypłukać nasiona wodą cztery razy. Umieścić nasiona kukurydzy w sterylnej płytce Petriego.
- Sterylizacja nasion pszenicy25
- Dodać inokulum mikrobiologiczne do pożywki, jeśli jest to wymagane.
UWAGA: Podczas optymalizacji i testów sterylności systemu gnotobiotycznego nie stosowano inokulum mikrobiologicznego. - Złożyć dozowniki nakrętkowe i przymocować je do butelek z pożywką.
UWAGA: Ponieważ jest to system otwarty, zalecamy posiadanie pojemnika do zbierania przepływającej pożywki. Stwierdzono, że dobrze sprawdza się blacha do pieczenia, która umożliwia łatwe przemieszczanie, ale wymaga częstego opróżniania. - Zdjąć plastikową pokrywkę z doniczki i wlać do niej 378 mL pożywki.
UWAGA: Odpowiada to w przybliżeniu 70% wypełnienia przestrzeni porowej wodą (WFPS), co należy skorygować przy użyciu innych podłoży glebowych. W przypadku gliny użyć 360 mL, a w przypadku piasku 358 mL.- Zasiać wysterylizowane nasiona na odpowiednią głębokość, używając sterylnej pęsety.
- Zasiać pszenicę na głębokość ½ cala, a kukurydzę na głębokość 1 cala. Alternatywnie można zasiać sterylne, wcześniej wykiełkowane siewki do GNOVA. W przypadku testów wzrostu kukurydzy należy użyć nasion wcześniej wykiełkowanych.
- Nałożyć plastikową pokrywkę na górę doniczki.
3. Montaż końcowy i praca eksperymentalna
- Przenieś doniczkę i szklany cylinder do komory wzrostu. Trzymaj szklany cylinder dnem do dołu w pobliżu doniczki.
- Szybko zdejmij plastikową nasadkę z doniczki oraz folię sterylizacyjną ze szklanego cylindra. Opuść szklany cylinder na górę, osadzając go na krawędzi wydrukowanej w technologii 3D podstawy.
UWAGA: Podczas końcowego montażu systemu wzrostu obok doniczki można umieścić płomień (np. przenośny palnik Bunsena), aby dodatkowo zmniejszyć ryzyko kontaminacji.
OSTROŻNIE: Upewnij się, że podczas pracy z otwartym ogniem w pobliżu nie znajdują się inne materiały łatwopalne. Zwróć uwagę na położenie płomienia względem ciała, aby zapobiec poparzeniom. - Uprawiaj rośliny przez okres od 4 do 17 tygodni, w zależności od gatunku rośliny, stosując warunki wzrostu specyficzne dla danego gatunku.
- Uprawiaj pszenicę w temperaturach dzień/noc 22 °C/16 °C, a kukurydzę w 27 °C/23 °C. Fotoperiod dla obu roślin wynosi 12 h wyłącznie pod światłem fluorescencyjnym.
4. Irygacja
- Przyłącz długi przewód silikonowy do dozownika nakręcanego na butelkę.
- Podczas podlewania zachowuj sterylność, korzystając z przenośnego palnika. Jeśli użycie przenośnego palnika nie jest możliwe, przeprowadź nawadnianie z użyciem wybielacza w celu zachowania sterylności.
- Nawadnianie z użyciem przenośnego palnika.
UWAGA: Pracuj ostrożnie w pobliżu otwartego ognia, aby zapobiec obrażeniom ciała i uszkodzeniom obiektu.- Umieść palnik w pobliżu linii nawadniającej. Zdejmij korpus strzykawki z linii nawadniającej oraz z uchwytu filtra. Trzymaj wszystkie końce przewodów w strefie płomienia.
- Przyłącz uchwyt filtra do linii nawadniającej. Połącz ze sobą dwa korpusy strzykawek. Drugi długi przewód silikonowy z dozownika nakręcanego na butelkę podłącz do dolnego otworu uchwytu filtra.
- Odlicz 150 mL pożywki Murashige and Skoog 0.5X. Rozdziel oba korpusy strzykawek.
- Odłącz przewód silikonowy od uchwytu filtra i zastąp go jednym korpusem strzykawki.
- Nawadnianie z użyciem 10% wybielacza
UWAGA: Zalecamy stosowanie tej strategii nawadniania w dużych eksperymentach (n > 50), aby zwiększyć wydajność podczas podlewania.
UWAGA: Podczas pracy z wybielaczem należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne.- Odlej 10% v/v roztwór wybielacza do dwóch małych zlewków plastikowych i ustaw je w pobliżu linii nawadniającej. Zdejmij korpus strzykawki z linii nawadniającej oraz z uchwytu filtra.
- Zanurz wszystkie końce przewodów w 10% roztworze wybielacza do momentu ich użycia. Strząśnij nadmiar roztworu wybielacza. Przyłącz uchwyt filtra do linii nawadniającej doniczki.
- Podłącz drugi długi przewód silikonowy z dozownika nakręcanego na butelkę do dolnego otworu uchwytu filtra.
- Odlicz 150 mL pożywki Murashige and Skoog 0.5X. Odłącz przewód silikonowy od uchwytu filtra.
UWAGA: Objętość nawadniania wynosi 120 mL dla piasku i 360 mL dla gliny. - Po strząśnięciu nadmiaru wybielacza zastąp filtr w linii nawadniającej korpusem strzykawki.
UWAGA: W przypadku zmiany objętości nawadniania należy uwzględnić około 20 mL pożywki na zaprawienie linii nawadniającej.
- Nawadniaj doniczki raz w tygodniu. Dostosuj objętość i częstotliwość nawadniania w zależności od celu eksperymentu i zastosowanego podłoża glebowego. W przypadku użycia 100% piasku zwiększ częstotliwość nawadniania do dwóch razy w tygodniu.
5. Zbiór
UWAGA: Niniejszy protokół zbioru był stosowany podczas testowania i optymalizacji systemu gnotobiotycznego. Protokół zbioru należy zmodyfikować w celu dostosowania go do konkretnych celów badawczych oraz objętości przetwarzanych próbek.
- Przygotować i wysterylizować wszystkie roztwory i materiały co najmniej jeden dzień przed zbiorem.
- Autoklawować 4 L wody dejonizowanej oraz 500 mL 0,145 M NaCl w cyklu dla cieczy w temperaturze 121 °C przez 30 min z jednodniowym wyprzedzeniem.
- Autoklawować nożyczki i pęsetę w cyklu suchym w temperaturze 121 °C przez 30 min z jednodniowym wyprzedzeniem.
UWAGA: O ile nie wskazano inaczej, następujące kroki należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę aseptyczną. Jeśli sterylność nie jest wymagana do pobrania próbek, wszystkie te czynności można wykonywać poza komorą z laminarnym przepływem powietrza.
- Przenieść systemy gnotobiotyczne z komory wzrostowej do laboratorium i ustawić je obok komory z laminarnym przepływem powietrza.
- Wyjąć szklany cylinder z doniczki i szybko umieścić doniczkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wyjąć doniczkę z wydrukowanej w technologii 3D podstawy.
- Przytrzymać roślinę u podstawy i wysypać podłoże glebowe do pojemnika. Delikatnie strząsnąć duże grudki podłoża z korzeni.
UWAGA: Próbki podłoża glebowego można pobrać i przetworzyć zgodnie z konkretnym celem badawczym na tym etapie zbioru. Protokół krótko opisany w tym miejscu został zastosowany do badania sterylności gleb. - Zbiór gleby w celu oznaczania liczby bakterii glebowych27 z wykorzystaniem metody kropelkowych rozcieńczeń seryjnych na pojedynczej płytce28.
- Napełnić dołki płytki 96-dołkowej 270 µL 0,145 M NaCl. Pozostawić pierwszy rząd pusty. Dodać 1 g podłoża glebowego do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 9 mL 0,145 M NaCl.
- Mieszać na wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez 5 min. Przenieść 30 µL próbki do pustego dołka płytki 96-dołkowej.
- Przygotować siedem rozcieńczeń seryjnych każdej próbki, pipetując 30 µL każdej z nich do dołka poniżej zawierającego 270 µL roztworu NaCl.
- Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół podczas każdego przenoszenia.
- Przygotować kropelkowe rozcieńczenia seryjne każdej próbki, nakładając 10 µL każdego rozcieńczenia seryjnego na pojedynczą płytkę z pożywką R2A.
- Przechylić płytki, aby rozprowadzić krople. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej.
- Policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU) i obliczyć liczbę CFU/g gleby.
- Oddzielić pędy od korzeni za pomocą sterylnych nożyczek. Zapisać masę świeżą pędów.
- Oczyścić korzenie, delikatnie potrząsając nimi w zlewce z wodą dejonizowaną. Osuszyć korzenie za pomocą papierowego ręcznika i zapisać masę świeżą.
UWAGA: Materiał nadziemny i podziemny można pobrać na tym etapie i przetworzyć zgodnie z metodologią najodpowiedniejszą dla planowanej analizy końcowej.
Wyniki
Opracowaliśmy GNOVA, nowy gnotobiotyczny system roślinny, który zapewnia sterylną i kontrolowaną środowiskową warunki niezbędne do badania oddziaływań roślina–mikroorganizm. Ten nowy system oferuje 62 cm pionowej przestrzeni dla pędów oraz doniczkę o pojemności 1,3 L, kompatybilną z kilkoma podłożami glebowymi. W pełni zmontowany system ma około 92,4 cm wysokości i 11,6 cm szerokości (Rycina 5A–C). W porównaniu z innymi systemami charakteryzuje się on największą pionową pojemnością dla wzrostu pędów oraz drugą co do wielkości komorą korzeniową (Tabela uzupełniająca 1). GNOVA wymaga jedynie 0,0135 m2 powierzchni w komorze wzrostowej, co czyni ten system kompaktowym i mobilnym. System ten może być stosowany w komorach wzrostowych z prześwitem pionowym wynoszącym 1,22 m. Wszystkie komponenty systemu, z wyjątkiem wydrukowanej w technologii 3D podstawy, można autoklawować; są one kompatybilne z autoklawami o wymiarach 61 cm × 61 cm × 91 cm (szerokość × długość × wysokość). Usprawnia to przygotowanie eksperymentu poprzez wyeliminowanie konieczności ręcznej sterylizacji poszczególnych części. Ponadto większość komponentów tego systemu jest wielokrotnego użytku, co sprawia, że koszt eksploatacji na jeden eksperyment wynosi około 6 USD po początkowym koszcie konfiguracji wynoszącym 54 USD za jednostkę (Tabela uzupełniająca 2). Warunki środowiskowe wewnątrz GNOVA określono poprzez monitorowanie temperatury i wilgotności względnej systemu z tygodniową rośliną kukurydzy przez trzy dni. Temperatura wewnątrz GNOVA była średnio o +1,3 °C wyższa niż w komorze wzrostowej (Rycina uzupełniająca 1). Różnice w temperaturze między systemem a komorą były większe w cyklu świetlnym (średnio +2,5 °C) niż w cyklu ciemnym (średnio +0,4 °C). Wilgotność względna wewnątrz GNOVA wynosiła średnio 63%, w przeciwieństwie do 34% w komorze wzrostowej.
Rycina 5: Wizualizacje systemu GNOVA. (A) Model 3D ostatecznego projektu podstawy wsporczej (B) Przekrój poprzeczny modelu 3D podstawy wsporczej (C) Przekrój poprzeczny modelu 3D w pełni zmontowanego systemu GNOVA Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Aby zapewnić sterylność wewnątrz układu, przeprowadzono czterotygodniową próbę w układach nieirygowanych i irygowanych bez roślin. Zanieczyszczenie szklanego cylindra określono poprzez pobieranie próbek powyżej i poniżej pierścienia bawełnianego metodą bezpośredniego posiewu wymazów. Powyżej pierścienia bawełnianego nie zaobserwowano wzrostu drobnoustrojów przekraczającego trzy kolonie (tj. pojedyncza kolonia na jedną trzecią pobranej powierzchni) zarówno w próbkach nieirygowanych (n=4), jak i irygowanych (n=6) (Rysunek dodatkowy 2A). Poniżej pierścienia bawełnianego zaobserwowano wzrost w jednej powtórce niepodlewanej, natomiast w układach podlewanych nie stwierdzono wzrostu (Rysunek dodatkowy 2B). Sugeruje to niski potencjał kontaminacji ze strony cylindra szklanego, ponieważ wzrost drobnoustrojów wystąpił jedynie w ograniczonej liczbie powtórzeń poniżej pierścienia bawełnianego, który nie pozostaje w kontakcie z rośliną. Kontaminację gleby oceniono poprzez wysiew rozcieńczeń seryjnych na płytki z pożywką R2A (Rycina dodatkowa 2C). W żadnym z warunków nie stwierdzono istotnego wzrostu drobnoustrojów, z wyjątkiem jednej powtórki irygowanej, w której liczba jednostek tworzących kolonie uzyskana z rozcieńczeń seryjnych była niemożliwa do oceny (tj. < 30 kolonii). Oprócz testów sterylności przeprowadziliśmy porównanie wydajności pszenicy i kukurydzy hodowanych w systemie GNOVA z naszym standardowym gnotobiotycznym protokołem wzrostu trwającym dwa tygodnie w systemie workowym19Aby zrozumieć wpływ niewielkiego rozmiaru i braku nawadniania na kondycję roślin, przedłużyliśmy okresy wzrostu w workach tak, aby odpowiadały okresom w systemie GNOVA. Mimo że początkowa zawartość wody w glebie podczas przygotowania obu systemów była taka sama, GNOVA otrzymywała cotygodniową fertygację, podczas gdy worki nie. we wszystkich porównaniach jako punkt odniesienia przyjmujemy system workowy, ponieważ był on pierwotnym układem gnotobiotycznym w naszym laboratorium. Zarówno pszenica, jak i kukurydza osiągnęły 100% kiełkowania w systemie GNOVA, natomiast w systemie workowym pszenica osiągnęła jedynie 67% (n = 3), a kukurydza 75% (n = 8) (Rycina 6).
Rycina 6: Kiełkowanie pszenicy (n = 3) i kukurydzy (n = 8) w systemie GNOVA (fioletowy) oraz systemie bag (zielony). Wynik kiełkowania każdego powtórzenia jest przedstawiony punktami na osi y jako brak kiełkowania lub wykiełkowane dla każdego systemu gnotobiotycznego. Słupki reprezentują wskaźnik kiełkowania (%) każdego gatunku rośliny w różnych systemach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Przeprowadzono również test wzrostu pszenicy i kukurydzy, aby określić maksymalny okres żywotnego wzrostu oraz wydajność roślin w systemie GNOVA. Chociaż nasz standardowy protokół dla worków przewiduje jedynie dwa tygodnie wzrostu, przedłużyliśmy ten okres wewnątrz worków powyżej dwóch tygodni, aby uzyskać lepsze porównanie między oboma systemami. Po dwóch tygodniach pszenica hodowana w GNOVA (n=3) osiągnęła już stadium wzrostu (GS) 13 według skali Zadoka (Rysunek 7A), podczas gdy w worku pozostała w stadium GS11. W piątym tygodniu rośliny w systemach GNOVA osiągnęły stadium GS21, co objawiło się pojawieniem pędów bocznych (Rysunek 7B). W przeciwieństwie do nich, w systemach workowych pędy boczne nie wystąpiły, a rośliny pozostały w stadium GS13. To zahamowanie wzrostu i brak zmian fenologicznych w systemie workowym doprowadziły do zakończenia hodowli roślin w tym systemie w szóstym tygodniu. Rośliny pszenicy kontynuowały wzrost przez kolejne pięć tygodni w GNOVA, gdzie zaobserwowano zwiększenie liczby liści i biomasy (Rysunek 7C). Mimo że biomasa pszenicy wizualnie wzrosła po 12 tygodniach wzrostu w GNOVA, u roślin zaczęły pojawiać się bardziej chlorotyczne liście, a objętość szklanego cylindra została wypełniona przez biomasę roślinną (Rysunek 7D). Pszenica była hodowana przez kolejne dwa tygodnie (Rysunek 7E,F). Nie odnotowano jednak wizualnego przyrostu biomasy, w związku z czym test wzrostu zakończono po 17 tygodniach. Oceniono również wzrost kukurydzy w GNOVA przez cztery tygodnie i porównano go z kukurydzą hodowaną w workach (Rysunek 8A,B). W tym doświadczeniu nasiona kukurydzy zostały wysterylizowane i wstępnie wykiełkowane przed wysianiem do systemu GNOVA lub worka. Świeża masa pędów i korzeni kukurydzy różniła się istotnie między oboma systemami (test t dla dwóch prób, p-value < 0.05, Tabela uzupełniająca 3). Kukurydza hodowana w GNOVA miała świeżą masę pędów i korzeni wynoszącą średnio odpowiednio 11.2 g i 5.7 g (Rysunek 8C,D). W przeciwieństwie do niej, pędy i korzenie kukurydzy hodowanej w worku miały świeżą masę odpowiednio 1.29 g i 1.15 g. Ogółem świeża biomasa kukurydzy hodowanej w GNOVA wzrosła o 593% w porównaniu do kukurydzy hodowanej w systemie workowym. Co więcej, długość pędów i korzeni była w GNOVA istotnie większa niż w workach, odpowiednio o 89% i 57% (Rysunek 8E,F).
Rycina 7: Wzrost pszenicy w prototypie GNOVA. (A) Pszenica po dwóch tygodniach w stadium wzrostu (GS) 13 według skali Zadocka. (B) Porównanie pszenicy po pięciu tygodniach wzrostu w worku i w systemie GNOVA. W GNOVA widoczne są pokłosia (GS21), natomiast w worku są one nieobecne (GS13). (C) Przyrost biomasy pszenicy po 10 tygodniach wzrostu. (D) Przyrost biomasy pszenicy po 13 tygodniach wzrostu z pojawieniem się liści chlorotycznych. (E) Dalszy przyrost biomasy pszenicy po 15 tygodniach wzrostu. F) Biomasa pszenicy zajmuje większość dostępnej objętości wzrostu po 17 tygodniach wzrostu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Wzrost kukurydzy w prototypie GNOVA (fioletowy) w porównaniu do systemu workowego (zielony). Słupki wskazują wartości średnie ± błąd standardowy (n=4) (A) Kukurydza hodowana przez cztery tygodnie w GNOVA i systemie workowym. (B) Porównanie wielkości zebranych roślin hodowanych w GNOVA i systemie workowym. (C) Świeża masa pędów (Mean±SE). (D) Świeża masa korzeni (Mean±SE). (E) Długość pędów (Mean±SE). F) Długość korzeni (Mean±SE). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek dodatkowy 1: Dynamika czasowa wilgotności względnej i temperatury mierzonej wewnątrz GNOVA (fioletowy) oraz w komorze wzrostowej (pomarańczowy). Dane zapisywano w odstępach pięciominutowych przez trzy dni. Dane wewnątrz GNOVA zapisywano dla siedmiotygodniowej rośliny kukurydzy. Obszary zacieniowane na jasnoniebiesko odpowiadają okresom nocnym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina dodatkowa 2: Wzrost drobnoustrojów w wyniku testów sterylności GNOVA bez roślin niepodlewanych (Kontrola) oraz podlewanych (Podlewane). (A) Próbki z cylindra szklanego powyżej pierścienia bawełnianego. (B) Próbki z cylindra szklanego poniżej pierścienia bawełnianego. (C) Posiewy seryjnych rozcieńczeń próbek gleby na pojedynczych płytkach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Porównanie cech systemu GNOVA z innymi istniejącymi systemami gnotobiotycznymi dla roślin (EcoFAB, pudełka purpurowe, worki, FlowPot, GnotoPot oraz EcoFAB 3.0). Systemy porównano pod kątem kluczowych parametrów istotnych dla projektu doświadczalnego, takich jak dopuszczalna wysokość rośliny, pojemność objętości korzeni oraz kontrola nawadniania. Informacje zestawiono na podstawie opublikowanej literatury i dostępnych opisów systemów; w przypadkach, gdy dane nie zostały podane wprost, wskazano wartości szacunkowe. † Najlepsze przybliżenie, gdy nie określono w literaturze; ‡ System nie wymaga demontażu ani przeniesienia do komory z laminarnym przepływem powietrza w celu wykonania czynności; * Możliwe po wprowadzeniu modyfikacji do systemu; Kategorie kosztów zdefiniowano jako: niskie (< 30 USD za jednostkę), średnie (30-100 USD za jednostkę), wysokie (> 100 USD za jednostkę)Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 2: Wykaz materiałów (BOM) i szacunkowe koszty montażu oraz eksploatacji pojedynczej jednostki GNOVA. Materiały podzielono na komponenty wielorazowe i jednorazowe, podając odpowiadający im koszt jednostkowy, ilość wymaganą na system oraz całkowity koszt na system. Komponenty wielorazowe wpływają na początkowy koszt konfiguracji, a materiały jednorazowe stanowią koszt materiałów eksploatacyjnych na jeden eksperyment. * obliczono na podstawie wynegocjowanych cen hurtowych w celu uzyskania opłacalnych stawek; ** ilość potrzebna zależy od długości eksperymentu, użytego podłoża glebowego i celu badawczego. Wartość dla czterotygodniowego eksperymentu z tygodniowym harmonogramem nawadniania przy użyciu mieszanki gliny i piasku; † przybliżony koszt ilości materiału potrzebnej na system; ‡ nie obejmuje ceny roztworu odżywczego ani podłoża glebowego, ponieważ będą one zależeć od celu eksperymentalnegoKliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 3: Wynikowe wartości p z testu t dla dwóch prób dla zmiennych mierzących wzrost kukurydzy hodowanej w systemie GNOVA oraz w systemie workowym.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Przedstawiony tu system gnotobiotyczny dla roślin, GNOVA, zapewnia przystępne i wszechstronne narzędzie do badania interakcji roślina–mikrob w uprawach zbożowych. Jego kluczowe cechy obejmują zwiększoną zdolność wzrostu i wbudowane nawadnianie, przedłużające wzrost zbóż poza stadium siewek w sterylnych warunkach. Osiągi tego systemu są porównywalne z EcoFAB 3.0 i zapewniają przystępną alternatywę dla gnotobiotycznego systemu roślin. System jest zbudowany z dostępnych w handlu komponentów wybranych pod względem kosztów, prostoty i zgodności ze średniej wielkości autoklawami, co ułatwia wprowadzenie do laboratoriów. Montaż i eksploatacja są proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, co zmniejsza bariery wdrażania. GNOVA może być dostosowany do różnych celów badawczych dzięki kompatybilności z szeroką gamą podłoży glebowych, protokołów sterylizacji nasion, inokulantów mikrobiowych (wolnych od zaraz, SynCom lub naturalna społeczność) i różnorodnych analiz dolnoprądowych.
Minimalne zanieczyszczenie jest niezbędne w eksperymentach gnotobiotycznych z roślinami, aby upewnić się, że obserwowane efekty można przypisać mikrobom interesującym nas i nie zarazeniom. Prosty działanie GNOVA zmniejsza ryzyko skażenia. Ściśle przestrzegać techniki aseptycznej i następujących kluczowych zaleceń, aby zapewnić utrzymanie sterylności. Podczas przygotowywania eksperymentu zalecamy dezynfekcję kaptura laminarnego między inokulantami mikrobicznymi, aby zminimalizować wzajemne skażenie traktowań. Kolejność, w której stosuje się traktowania, może również zmniejszyć wzajemne skażenie. Stosowane traktowanie wolne od zaraz przed jakimkolwiek żywym traktowaniem mikrobicznym jest idealne. Obce mikroby mogą również być wprowadzane przez nasiona. Protokoły sterylizacji nasion powinny zatem być zoptymalizowane dla każdego gatunku rośliny lub źródła nasion, aby zbilansować sterylność i kiełkowanie26. Protokoły sterylizacji dla niemodelowych zbożowych, takich jak sorgo24, jęczmień29, trawa przełącznikowa i owies23, mogą być łatwo wdrożone w GNOVA. Jeśli sterylizacja negatywnie wpływa na kiełkowanie, można użyć nasion wstępnie wykiełkowanych. Nawadnianie stanowi główne źródło skażenia w systemach gnotobiotycznych. Najbardziej krytycznym punktem w tym procesie jest przymocowanie filtrów do linii nawadniających. Końcówki przewodów linii nawadniających i filtrów muszą pozostać sterylne przez cały proces. Sterylizacja płomieniem wymaga zręczności i może być pracochłonna, szczególnie w dużych eksperymentach (n >50). Dlatego alternatywna metoda na bazie wybielacza jest zalecana dla dużych eksperymentów lub gdy sterylizacja płomieniem nie jest praktyczna. Zachowanie dodatkowych sterylnych filtrów i posiadanie wybielacza lub etanolu podczas nawadniania jest również zalecane na wypadek skażenia podczas obsługi materiałów systemu. Ponadto, zaleca się mocne uwzględnienie jednostek kontroli skażenia (tzn. bez rośliny, bez mikroba, traktowanie i odbiór nawadniania) w celu monitorowania sterylności i identyfikacji skażeń.
Aby przeciwdziałać ryzyku skażenia podczas nawadniania, najwcześniejsze systemy gnotobiotyczne dla roślin były całkowicie zamknięte i nie posiadały możliwości nawadniania, co ograniczyło czas trwania eksperymentów. Kukurydza była uprawiana gnotobiotycznie w torebkach19,30, szklanych rurek i naczyń Petriego15 między dwoma a czterema tygodniami. Aby uzupełniać wodę i składniki odżywcze podczas wzrostu roślin, alternatywne systemy takie jak EcoFAB23, FlowPot i GnotoPot21 umożliwiają nawadnianie poprzez częściowe demontaż w kapturach laminarnych. Ograniczyło to ich rozmiar i kompatybilność z większymi roślinami. Ponieważ linie nawadniające są łatwo dostępne poza GNOVA, demontaż nie jest wymagany, a system nie jest ograniczony do rozmiarów kaptura laminarnego. To nie tylko umożliwia ciągłą dostawę składników odżywczych i wody, ale także zwiększa dostępną przestrzeń do wzrostu. Zmniejszona przestrzeń dla pędów może zmniejszyć zdolność fotosyntetyczną i przyczynić się do zahamowania wzrostu24, a ograniczenie objętości korzeni może prowadzić do wiązania się korzeni i zmniejszać pobieranie wody i składników odżywczych31. Połączenie małej przestrzeni do wzrostu i brak nawadniania w systemie torebkowym może wyjaśniać zmniejszoną biomasę i brak postępów fenologicznego kukurydzy i pszenicy w porównaniu z systemem GNOVA. Ten nowy system umożliwił gnotobiotyczny wzrost kukurydzy przez czas porównywalny z sorgo w EcoFAB 3.024. Co więcej, przewyższa gnotobiotyczny wzrost pszenicy przez cztery tygodnie w systemie hydroponicznym (20) w bardziej reprezentatywnym systemie glebowym. Oprócz fizycznych ograniczeń, systemy gnotobiotyczne często polegają na ograniczonym przepływie powietrza, aby utrzymać steryl
Oświadczenia
Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Badanie to było sfinansowane przez Fundację Novo Nordisk (INTERACT, Numer grantu: NNF19SA0059360) oraz Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych w ramach kontraktu nr 2022-67013-36672.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Powerconnect cordless drill & 100-Piece Kit | Black+Decker | BDC120VA100 | 1/4" and 1/8" drill bits needed. |
| Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards | 3M | 471 | Consumable material |
| Sterling Rubber bands size #32 (2 rubber bands per system) | Amazon | B001I1QO00 | Consumable material. |
| Wheat seed | Cultivar used in this experiment: Catawba | ||
| Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick (2 pre-cut circles per system) | Lowe's | 28930 | Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting. |
| DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards (1 cut circle per system) | Class Biological Clean, Ltd | NA | Cut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired. Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors. |
| Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thickness | Saint-Gobain | ABX00007 | Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm) |
| Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solution | VWR | JT9416-1 | Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol |
| Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 L | Research Products International | M10200-25.0 | Diluted to 0.5x strength |
| Ethanol, 100%, Deacon Labs | Fisher scientific | 04-355-451 | Diluted to 95% v/v |
| Syringe 3 mL, luer lock unsterile (2 per system) | Fisher scientific | 14-817-117 | Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil. |
| Glass beakers, 250 mL | VWR | 470191-150 | Five are needed for wheat seed sterilization |
| Maize seed | Genotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17 | ||
| Aluminum baking tray 18" x 26" | Amazon | B01FIK54LQ | Make sure it fits the dimensions of your flow hood |
| Sodium Chloride | Fisher scientific | BP358-1 | Prepare 0.145 M solution. |
| 3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system) | Protolabs | NA | Printing and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers. |
| Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene (2 per system) | Cole-Parmer | EW-50114-69 | Refered as fitting 1 in the protocol |
| Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene (1 per system) | Cole-Parmer | EW-50114-63 | Refered as fitting 2 in the protocol |
| 201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system) | Grainger | 5CZF2 | Refered as hose clamps in protocol |
| Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 " | ESCO Lifesciences | 2120707 | Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods. |
| Play sand, Quikrete Premium. 50 lb | The Home Depot | 1001709466 | Refered as sand in protocol |
| 304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system) | Amazon | B09KRS5F7T | Refered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors. |
| Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scented | Grainger | 44Z111 | Refered in protocol as clay. Consumable material. |
| Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system) | WCG International | HST0430 | Refered in protocol as glass cylinder |
| Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam (1 per system) | ClearTec Packaging | PCC3.000 | Refered in protocol as plastic cap |
| Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length (1 per system) | ePlastics | PCTUB3.000X2.875 | Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths. |
| Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system) | Fisher scientific | 17-101-102 | Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material. |
| Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" length | VWR | 82027-398 | Refered in protocol as tweezers. |
| Tea strainers | Amazon | B0FRMRZWZY | Three are needed for wheat seed sterilization |
| Clorox bleach with 5.7% available chlorine | The Home Depot | 1005131 |
Bibliografia
- Batista, B. D., Singh, B. K. Realities and hopes in the application of microbial tools in agriculture. Microbial Biotechnology. , (2021).
- Parnell, J. J., et al. From the Lab to the Farm: An Industrial Perspective of Plant Beneficial Microorganisms. Frontiers in Plant Science. , (2016).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. , (2017).
- Compant, S., et al. Harnessing the plant microbiome for sustainable crop production. Nature Reviews Microbiology. , (2025).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research. Cell Host and Microbe. , (2017).
- Liu, Y. X., Qin, Y., Bai, Y. Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research. Current Opinion in Microbiology. , (2019).
- Basic, M., Bleich, A. Gnotobiotics: Past, present and future. Laboratory Animals. , (2019).
- Williams, S. C. P. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2014).
- Bennett, R. A., Lynch, J. M. Bacterial Growth and Development in the Rhizosphere of Gnotobiotic Cereal Plants. Microbiology. , (1981).
- Lindberg, T., Granhall, U. Acetylene reduction in gnotobiotic cultures with rhizosphere bacteria and wheat. Plant and Soil. , (1986).
- Maplestone, P. A., Campbell, R. Colonization of roots of wheat seedlings by bacilli proposed as biocontrol agents against take-all. Soil Biology and Biochemistry. , (1989).
- Simons, M. Gnotobiotic System for Studying Rhizosphere Colonization by Plant Growth-Promoting Pseudomonas Bacteria. MPMI. , (1996).
- Walley, F. L., Germida, J. J. Response of spring wheat to interactions between Pseudomonas species and Glomus clarum NT4. Biology and Fertility of Soils. , (1997).
- Ma, K. W., Ordon, J., Schulze-Lefert, P. Gnotobiotic Plant Systems for Reconstitution and Functional Studies of the Root Microbiota. Current Protocols. , (2022).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2017).
- Hsu, P. C. L., O’Callaghan, M., Condron, L., Hurst, M. R. H. Use of a gnotobiotic plant assay for assessing root colonization and mineral phosphate solubilization. Plant and Soil. , (2018).
- McLaughlin, S., et al. A Versatile Glass Jar System for Semihydroponic Root Exudate Profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
- Miebach, M., et al. Litterbox—A gnotobiotic Zeolite-Clay System to Investigate Arabidopsis–Microbe Interactions. Microorganisms. , (2020).
- Salvato, F., et al. Evaluation of Protein Extraction Methods for Metaproteomic Analyses of Root-Associated Microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. , (2022).
- Kawasaki, A., et al. A sterile hydroponic system for characterising root exudates. Plant Methods. , (2018).
- Kremer, J. M., et al. Peat-based gnotobiotic plant growth systems for Arabidopsis microbiome research. Nature Protocols. , (2021).
- Nezhad, A. S. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a Chip. , (2014).
- Gao, J., et al. Ecosystem Fabrication protocols for plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Gupta, K., et al. EcoFAB 3.0: a sterile system for studying sorghum. Frontiers in Plant Science. , (2024).
- Verma, S. K., et al. Exploring Endophytic Communities of Plants. Seed Endophytes: Biology and Biotechnology. , Springer. Cham. (2019).
- Parnell, J. J., et al. Effective Seed Sterilization Methods Require Optimization Across Maize Genotypes. Phytobiomes Journal. , (2024).
- Lee, J., Kim, H. S., Jo, H. Y., Kwon, M. J. Revisiting soil bacterial counting methods. PLOS One. , (2021).
- Thomas, P., et al. Optimization of single plate-serial dilution spotting method. Biotechnology Reports. , (2015).
- Munkager, V., et al. AgNO3 Sterilizes Grains of Barley without Inhibiting Germination. Plants. , (2020).
- Wagner, M. R., et al. Microbe-dependent heterosis in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2021).
- Poorter, H., et al. Pot size matters: effects of rooting volume on plant growth. Functional Plant Biology. , (2012).
- Ferrante, A., Mariani, L. Agronomic management for enhancing plant tolerance to abiotic stresses. Horticulturae. , (2018).
- Vollmer, R., et al. Effect of Gas Exchange Rate and Vessel Type on plant growth. Plants. , (2024).
- Cardoso, E. J. B. N., et al. Soil health: suitable indicators for assessment. Scientia Agricola. , (2013).
- Sinclair, T. R., Ludlow, M. M. Influence of soil water supply on plant water balance. Australian Journal of Plant Physiology. , (1986).
- Döll, S., Koller, H., van Dam, N. M. Protocol for collecting root exudates from soil grown plants. Rhizosphere. , (2024).
- Williams, A., et al. Comparing root exudate collection techniques. Soil Biology and Biochemistry. , (2021).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains. Nature Ecology and Evolution. , (2019).
- Seethepalli, A., et al. RhizoVision Explorer: software for root image analysis. AoB Plants. , (2021).
- Pace, J., et al. Analysis of maize seedling roots using ARIA. PLOS One. , (2014).
- Jensen, T. B. N., et al. High-throughput DNA extraction and metagenome preparation. PLOS One. , (2024).
- Romero-Salas, E. A., Ibarra-Sánchez, C. L. Isolation of Metagenomic DNA from Plant Roots. Plant Microbiome Engineering. , Springer. New York. (2025).
- Su, P., et al. Recovery of metagenome-assembled genomes from rice phyllosphere. Scientific Data. , (2022).
- Northen, T. R., et al. Community standards for synthetic communities in plant–microbiota research. Nature Microbiology. , (2024).
- Poursalavati, A., Javaran, V. J., Laforest-Lapointe, I., Fall, M. L. Soil Metatranscriptomics: improved RNA extraction method. Phytobiomes Journal. , (2023).
- Vannier, N., et al. Genome-resolved metatranscriptomics reveals conserved root colonization determinants. Nature Communications. , (2023).
- Zheng, L., et al. Extraction of Proteins from Soil. Metaproteomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
- Zheng, L., et al. Comparative physiological and proteomic response to phosphate deficiency. Journal of Proteomics. , (2023).
- Rieusset, L., et al. Cross-metabolomic approach in wheat–Pseudomonas interaction. Metabolites. , (2021).
- Zhang, Y., et al. Metabolite-mediated responses of phyllosphere microbiota. Microbiology Spectrum. , (2023).
- Swenson, T. L., Northen, T. R. Untargeted Soil Metabolomics. Microbial Metabolomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2019).
Przedruki i uprawnienia
