Artykuł metodologiczny

Zgromadzenie i użycie gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin do badań nad interakcją roślina-mikrob w zbożach

DOI:

10.3791/70607

⸱

26 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, 2Department of Biological and Agricultural Engineering, North Carolina State University, 3Medialab-Matadero, Matadero Madrid

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje montaż i użycie nowego gnotobiotycznego systemu wzrostu roślin zaprojektowanego do akomodacyjnia zbóż i zweryfikowanego na pszenicy i kukurydzy. Ten gnotobiotyczny system roślin umożliwia kontrolowane eksperymenty roślina-mikrob przez zapewnienie sterylnych warunków wzrostu, zarządzania nawadnianiem i zgodności z różnorodnymi podłożami glebowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój mikrobiologicznych modyfikacji rolniczych, które działają spójnie na polu, wymaga zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji roślina-mikrob. Badanie tych podstawowych mechanizmów interakcji wymaga możliwości uprawiania roślin w warunkach sterylnych i gnotobiotycznych (tj. wszystkie mikroorganizmy współpracujące z rośliną są znane, czy chodzi o wolne od zarodników, zdefiniowane społeczności mikrobiologiczne, czy naturalne społeczności). Obecnie dostępne systemy gnotobiotyczne dla roślin nie nadają się do badania dużych roślin o znaczeniu rolniczym, takich jak zboża. Co więcej, większość tych systemów nie posiada możliwości zarządzania nawadnianiem. Wprowadzamy tutaj GNOVA, nowy system gnotobiotyczny zaprojektowany do akomodacyjnego rosnącej zbóż z możliwością zarządzania nawadnianiem. Ten nowy system to dostępna platforma składająca się z 3D drukowanej podstawy i komercyjnie dostępnych materiałów. Ten protokół zapewnia krok po kroku przewodnik po montażu systemu i konfiguracji eksperymentu. Ponadto przedstawiamy porównanie wydajności GNOVA z systemem worków gnotobiotycznych. GNOVA wydłużył wzrost roślin z dwóch tygodni w systemie worków do 17 tygodni dla pszenicy i 4 tygodni dla kukurydzy. Współczynnik kiełkowania obu roślin również wzrósł w obrębie GNOVA z 66% do 100% dla pszenicy i z 75% do 100% dla kukurydzy. Pszenica rosnąca w obrębie GNOVA wykształciła kłosy, które były nieobecne u roślin tego samego wieku w systemie worków. Świeża waga kukurydzy rosnącej w GNOVA była o 594% wyższa niż w systemie worków. Ponadto wysokość pędów i długość korzeni kukurydzy były o 89% i 57% większe w systemie GNOVA niż w workach, odpowiednio. System GNOVA rozszerza zestaw narzędzi dostępnych dla naukowców do badania interakcji roślina-mikrobiota poza etapem siewek w zbożach poprzez zapewnienie większej przestrzeni do wzrostu i zarządzania nawadnianiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowania rolnicze oparte na drobnoustroju wzbudzają znaczące zainteresowanie od kilku ostatnich dekad ze względu na ich potencjał polepszenia wydajności upraw poprzez poprawę wzrostu roślin i odporności na stres środowiskowy. Jednocześnie mechanizmy działania molekularnego tych biostymulantów pozostają słabo poznane, co może przyczyniać się do ich niekonsekwentnych wyników w różnych glebach, lokalizacjach i warunkach środowiskowych1,2. Popieranie poprawy efektywności istniejących opracowań opartych na drobnoustroju oraz rozwój nowych technologii wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji roślina–mikrob3,4. Jednakże rozdzielanie tych mechanizmów pozostaje wyzwaniem z powodu złożoności naturalnych społeczności mikrobiologicznych5,6. Aby zidentyfikować drobnoustroje i interakcje mikrobialne napędzające korzyści dla roślin, możemy zmniejszyć złożoność naturalnych systemów poprzez zastosowanie syntetycznych społeczności mikrobiologicznych (SynComs) w systemach wzrostowych, które pozwalają na kontrolowanie warunków środowiskowych i społeczności mikrobiologicznej. Gnotobiologię, badanie gospodarzy związanych z określonymi społecznościami mikrobiologicznymi7, pozwala badaczom porównywać wolne od zaraz gospodarzy z tymi skolonizowanymi znanymi społecznościami mikrobiologicznymi w celu powiązania funkcji mikrobiologicznej z fenotypem rośliny8.

Wczesne systemy gnotobiotyczne były budowane za pomocą szklanych probówek9,10,11,12 i słoików13. Od tego czasu, zobaczyliśmy szybki rozwój nowych systemów opracowanych do badania roślin gnotobiotycznie. Najczęściej stosowane systemy dziś obejmują użycie naleśników Petriego14, probówek15,16, szklanych słoików17, magenta boxów18, uszczelnionych torebek19, hydroponicznych20, FlowPot i GnotoPot21, systemów mikrofluidycznych22 i EcoFAB23. Mimo tego postępu, większość systemów jest albo zoptymalizowana pod kątem obrazowania22 lub zbierania eksudatów17,20 albo zaprojektowana dla małych gatunków modelowych14,18,21. Wiele to zamknięte systemy, które ograniczają kontrolę nawadniania i czas trwania eksperymentu. Te ograniczenia stanowią wyzwanie dla badań nad większymi roślinami rolniczymi, takimi jak zboża, które wymagają dodatkowego miejsca, przepływu powietrza i zarządzania wodą.

Rozumiejąc potrzebę systemu, który może pomieścić większe rośliny i dłuższe badania, ostatnio opracowano EcoFAB 3.0, aby rozszerzyć gnotobiotyczne uprawy na większe rośliny24. EcoFAB 3.0 oferuje większy objętość korzeni i przestrzeni głowowej, co wspiera wzrost Sorghum bicolor do 4 tygodni i pozwala na zbieranie eksudatów i obrazowanie korzeni24. Mimo że ten nowy system jest obiecującym przykładem rozszerzenia gnotobiotycznych systemów na uprawy rolnicze, nadal istnieje potrzeba dostępnej i wszechstronnej platformy, która może być łatwo przyjęta w laboratoriach i jest kompatybilna z szerokim zakresem przepływów eksperymentów. Z tego powodu opracowałyśmy GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), system zaprojektowany do akomodacyjnia upraw zbożowych w warunkach gnotobiotycznych. Tutaj, dostarczamy szczegółowy protokół montażu i eksploatacji GNOVA oraz demonstrujemy jego wydajność w porównaniu z gnotobiotycznym systemem torebkowym rutynowo używanym w naszym laboratorium. Dzięki opracowaniu tego nowego systemu, poprawiliśmy zdolność do uprawiania pszenicy i kukurydzy w warunkach sterylnych, zapewniając większą przestrzeń do wzrostu i wbudowane nawadnianie w porównaniu z wcześniejszymi zamkniętymi systemami. Wydajność GNOVA jest porównywalna z EcoFAB 3.0, rozszerzając tym samym arsenał narzędzi do badania interakcji roślina—mikrobiota u nie-modelowych upraw zbożowych. Co więcej, wszechstronność i przystosowawczość gnotobiotyki roślin są zwiększone przez prosty projekt GNOVA, użycie komercyjnie dostępnych materiałów i dostępne pliki obiektów 3D, które pozwalają badaczom zmieniać materiały i projekt aby dostosować ich potrzeby badań i budżet.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Pliki do druku 3D do bazy są dostępne w materiałach uzupełniających i są publicznie dostępne w Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Aby zwiększyć szybkość i efektywność kosztową, zalecamy drukowanie masowe w lokalnych komercyjnych usługach druku 3D.

1. Montaż systemu gnotobiotycznego

  1. Rozpocznij montaż doniczki (wykonaj raz przed wielokrotnym użyciem eksperymentalnym).
    1. Zamknij dno doniczki, umieszczając okrągłą siatkę z drutu nierdzewnego na jednym końcu poliwęglanowej rury i zabezpieczając okrągłą siatkę za pomocą szelki (Rysunek 1A).
    2. Wywierć otwory nawadniające, tworząc 1/4 cala (6,35 mm) otwór nawadniający 1,5 cm od górnej krawędzi otwartego końca poliwęglanowej rury. Wywierć dwa 1/8 cala (3,18 mm) szczeliny 3 cm od pierwszego otworu, z jedną szczeliną 1 cm od krawędzi, a drugą 2 cm od górnej szczeliny.
      UWAGA: W razie potrzeby, dodatkowe linie rurowe można dodać wokół górnej krawędzi doniczki, wykonując te same kroki.
    3. Zainstaluj rury nawadniające, wstawiając krótki odcinek silikonicznego węża przez otwór 1/4 cala.
    4. Zabezpiecz węże za pomocą przewleczenia linki przez dwie 1/8 calowe szczeliny (Rysunek 1B). Włóż samiec złącza 1 do silikonicznego węża wystającego na zewnątrz doniczki (Rysunek 1C).
      UWAGA: Kołnierz węża złącza 1 powinien być eksponowany.
    5. Przygotuj lufy strzykawek, wypełniając pustą lufę strzykawki wacikiem szklanym i zamykając koniec małą sztuką folii aluminiowej (Rysunek 1C).
    6. Przymocuj krótki odcinek silikonicznego węża do końca złącza luer z zamkiem na lufie strzykawki (Rysunek 1C).
    7. Przygotuj dwie identyczne lufy strzykawek. Przymocuj jedną z przygotowanych luf strzykawek do eksponowanego kołnierza węża złącza 1 na wężu wystającym z doniczki (Rysunek 1D).
    8. Pauza: Zmontowane doniczki mogą być przechowywane na późniejsze użycie eksperymentalne.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Montaż doniczki. A) Dno doniczki zamknięte siatką drucianą i szelką. (B) Port nawadniający na górnej krawędzi doniczki. (C) Końce linii nawadniających z eksponowanym kołnierzem węża złącza 1 z przygotowaną łufą strzykawki. (D) Zmontowana doniczka z zamkniętą linią nawadniającą Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

  1. Przygotowanie doniczki na potrzeby eksperymentu (wykonaj przed każdym nowym eksperymentem)
    1. Wyłóż dno doniczki dwiema pre-wyciętymi kołami z okładziny rurowej z włókna szklanego (Rysunek 2A).
    2. Przygotuj podłoże glebowe, mieszając dwie części gliny z jedną częścią piasku. Wlej 840 ml podłoża do doniczki.
    3. Pokrij doniczki plastikowym czapkiem i zabezpiecz za pomocą taśmy (Rysunek 2B).
    4. Autoklawuj wypełnione doniczki w suchym cyklu w temperaturze 121 °C przez 30 min. Pozostaw do ostygnięcia przez noc z plastikowymi czapkami na doniczkach. Ponownie autoklawuj w suchym cyklu w temperaturze 121 °C przez 30 min. Pozostaw do całkowitego ostygnięcia. Trzymaj doniczki pokryte plastikowym czapkiem.
      UWAGA: Można użyć innych podłoży glebowych, ale ilość potrzebna na jedną doniczkę powinna być zoptymalizowana z wyprzedzeniem. GNOVA został również przetestowany z 800 ml 100% gliny i 1 l 100% piasku. Inne podłoża glebowe mogą wymagać więcej cykli autoklawu lub różnych ustawień dla pełnej sterylizacji.
      OSTROŻNIE: Należy zachować ostrożność przy wyjmowaniu doniczek z autoklawu, ponieważ materiał będzie gorący, a szelki mogą się poluzować. Upewnij się, że szelki są zamknięte palcami po ostygnięciu, zanim podniesiesz doniczki.
    5. Włóż ostygłe doniczki do wydrukowanej na drukarce 3D podstawy. Umieść doniczkę wypełnioną glebą wewnątrz wydrukowanej na drukarce 3D podstawy. Trzymaj doniczkę za podstawę, a nie za otwarciami, ponieważ są one najbardziej kruche.
    6. Przeprowadź rury nawadniające przez jedno z dolnych otworów wydrukowanej na drukarce 3D podstawy (Rysunek 2C).
      UWAGA: Nie autoklawuj wydrukowanej na drukarce 3

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowałeśmy GNOVA, nowy system gnotobiotyczny dla roślin, który umożliwia sterylne i kontrolowane środowisko niezbędne do badania interakcji roślina-mikrob. Ten nowy system oferuje 62 cm pionowej przestrzeni dla pędów i 1,3 L doniczki kompatybilnej z kilkoma podłożami glebowymi. Całkowicie złożony system ma około 92,4 cm wysokości i 11,6 cm szerokości (Rysunek 5A–C). W porównaniu z innymi systemami, ma największą pionową pojemność na wzrost pędów i drugą co do wielkości komorę korzeniową (Tabela uzupełniająca 1). GNOVA wymaga tylko 0,0135 m2 powierzchni w komorze wzrostowej, co sprawia, że system ten jest kompaktowy i zwrotny. System ten można stosować w komorach wzrostowych z pionowym zasięgiem 1,22 m. Wszystkie elementy tego systemu, z wyjątkiem bazowanej na druku 3D podstawy, są nadające się do autoklawy i kompatybilne z autoklawami o wymiarach 61 cm × 61 cm × 91 cm (szerokość × długość × wysokość). Umożliwia to uproszczenie konfiguracji eksperymentu poprzez obejście manualnej sterylizacji poszczególnych części. Ponadto większość komponentów tego systemu jest wielokrotnego użytku, co utrzymuje koszt użycia na poziomie około 6 USD na eksperyment po początkowych kosztach konfiguracji w wysokości 54 USD za jednostkę (Tabela uzupełniająca 2). Warunki środowiskowe wewnątrz GNOVA zostały określone poprzez śledzenie temperatury i wilgotności względnej systemu za pomocą tygodniowej rośliny kukurydzy przez trzy dni. Średnia temperatura wewnątrz GNOVA była o +1,3 °C wyższa niż w komorze wzrostowej (Rysunek uzupełniający 1). Różnice w temperaturze wewnątrz systemu i komory były większe podczas cyklu świetlnego (średnio +2,5 °C) niż podczas cyklu ciemności (średnio +0,4 °C). Średnia wilgotność względna wewnątrz GNOVA wynosiła 63%, w porównaniu z 34% w komorze wzrostowej.

figure-results-1
Rysunek 5: Rendery systemu GNOVA. (A) 3D model ostatecznej konstrukcji podstawy podtrzymującej (B) Przekrój 3D modelu podstawy podtrzymującej (C) Przekrój 3D modelu całkowicie złożonego GNOVA Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zapewnić sterylność w systemie, przeprowadziliśmy czterotygodniowe testy nienawodnionych i nawadnianych systemów bez roślin. Zanieczyszczenie na szklanym cylindrze określono poprzez pobieranie próbek nad i pod pierścieniem z włókna bawełnianego za pomocą bezpośredniego wymazania na płytki. Brak wykrywalnego wzrostu mikroorganizmów powyżej trzech kolonii (czyli pojedyncza kolonia na jedną trzecią pobranej próbki) zaobserwowano nad pierścieniem z włókna bawełnianego zarówno w próbkach nienawodnionych (n=4), jak i nawadnianych (n=6) (Rysunek uzupełniający 2A). Pod pierścieniem z włókna bawełnianego wzrost zaobserwowano w jednej nienawodnionej replice, podczas gdy w systemach nawadnianych nie wykryto wzrostu (Rysunek uzupełniający 2B). Sugeruje to niski potencjał zanieczyszczenia ze strony szklanego cylindra, ponieważ wzrost mikroorganizmów był obecny tylko w ograniczonych replikach poniżej pierścienia z włókna bawełnianego, który nie ma kontaktu z rośliną. Zanieczyszczenie gleby oceniono poprzez wykonanie kolejnych rozcieńczeń na płytkach R2A (Rysunek uzupełniający 2C). Nie wykryto znacznego wzrostu mikroorganizmów w żadnej z warunków, z wyjątkiem pojedynczej repliki nawadnianej z nieocenianym liczeniem jednostek tworzących kolonie z kolejnych rozcieńczeń (czyli < 30 kolonii). Oprócz testów sterylności, przeprowadziliśmy też porównanie wydajności pszenicy i kukurydzy rosnących w GNOVA z naszym standardowym protokołem gnotobiotycznym trwającym dwa tygodnie w systemie torebkowym19. Aby zrozumieć wpływ małej wielkości i braku nawadniania na wydajność roślin, przedłużyliśmy okres wzrostu w torebkach, aby dopasować go do okresów wzrostu w GNOVA. Mimo że początkowa wilgotność gleby użyta podczas konfiguracji obu systemów była dopasowana, GNOVA otrzymywało cotygodniowe nawadnianie, podczas gdy torebki nie. Dla wszystkich porównań używamy systemu torebkowego jako referencyjnego, ponieważ był to początkowy gnotobiotyczny zestaw naszego laboratorium. Zarówno pszenica, jak i kukurydza osiągnęły 100% kiełkowanie w GNOVA, podczas gdy w systemie torebkowy systemie pszenica osiągnęła 67% (n = 3), a kukurydza 75% (n = 8) (Rysunek 6).

figure-results-2<

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tu system gnotobiotyczny dla roślin, GNOVA, zapewnia przystępne i wszechstronne narzędzie do badania interakcji roślina–mikrob w uprawach zbożowych. Jego kluczowe cechy obejmują zwiększoną zdolność wzrostu i wbudowane nawadnianie, przedłużające wzrost zbóż poza stadium siewek w sterylnych warunkach. Osiągi tego systemu są porównywalne z EcoFAB 3.0 i zapewniają przystępną alternatywę dla gnotobiotycznego systemu roślin. System jest zbudowany z dostępnych w handlu komponentów wybranych pod względem kosztów, prostoty i zgodności ze średniej wielkości autoklawami, co ułatwia wprowadzenie do laboratoriów. Montaż i eksploatacja są proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, co zmniejsza bariery wdrażania. GNOVA może być dostosowany do różnych celów badawczych dzięki kompatybilności z szeroką gamą podłoży glebowych, protokołów sterylizacji nasion, inokulantów mikrobiowych (wolnych od zaraz, SynCom lub naturalna społeczność) i różnorodnych analiz dolnoprądowych.

Minimalne zanieczyszczenie jest niezbędne w eksperymentach gnotobiotycznych z roślinami, aby upewnić się, że obserwowane efekty można przypisać mikrobom interesującym nas i nie zarazeniom. Prosty działanie GNOVA zmniejsza ryzyko skażenia. Ściśle przestrzegać techniki aseptycznej i następujących kluczowych zaleceń, aby zapewnić utrzymanie sterylności. Podczas przygotowywania eksperymentu zalecamy dezynfekcję kaptura laminarnego między inokulantami mikrobicznymi, aby zminimalizować wzajemne skażenie traktowań. Kolejność, w której stosuje się traktowania, może również zmniejszyć wzajemne skażenie. Stosowane traktowanie wolne od zaraz przed jakimkolwiek żywym traktowaniem mikrobicznym jest idealne. Obce mikroby mogą również być wprowadzane przez nasiona. Protokoły sterylizacji nasion powinny zatem być zoptymalizowane dla każdego gatunku rośliny lub źródła nasion, aby zbilansować sterylność i kiełkowanie26. Protokoły sterylizacji dla niemodelowych zbożowych, takich jak sorgo24, jęczmień29, trawa przełącznikowa i owies23, mogą być łatwo wdrożone w GNOVA. Jeśli sterylizacja negatywnie wpływa na kiełkowanie, można użyć nasion wstępnie wykiełkowanych. Nawadnianie stanowi główne źródło skażenia w systemach gnotobiotycznych. Najbardziej krytycznym punktem w tym procesie jest przymocowanie filtrów do linii nawadniających. Końcówki przewodów linii nawadniających i filtrów muszą pozostać sterylne przez cały proces. Sterylizacja płomieniem wymaga zręczności i może być pracochłonna, szczególnie w dużych eksperymentach (n >50). Dlatego alternatywna metoda na bazie wybielacza jest zalecana dla dużych eksperymentów lub gdy sterylizacja płomieniem nie jest praktyczna. Zachowanie dodatkowych sterylnych filtrów i posiadanie wybielacza lub etanolu podczas nawadniania jest również zalecane na wypadek skażenia podczas obsługi materiałów systemu. Ponadto, zaleca się mocne uwzględnienie jednostek kontroli skażenia (tzn. bez rośliny, bez mikroba, traktowanie i odbiór nawadniania) w celu monitorowania sterylności i identyfikacji skażeń.

Aby przeciwdziałać ryzyku skażenia podczas nawadniania, najwcześniejsze systemy gnotobiotyczne dla roślin były całkowicie zamknięte i nie posiadały możliwości nawadniania, co ograniczyło czas trwania eksperymentów. Kukurydza była uprawiana gnotobiotycznie w torebkach19,30, szklanych rurek i naczyń Petriego15 między dwoma a czterema tygodniami. Aby uzupełniać wodę i składniki odżywcze podczas wzrostu roślin, alternatywne systemy takie jak EcoFAB23, FlowPot i GnotoPot21 umożliwiają nawadnianie poprzez częściowe demontaż w kapturach laminarnych. Ograniczyło to ich rozmiar i kompatybilność z większymi roślinami. Ponieważ linie nawadniające są łatwo dostępne poza GNOVA, demontaż nie jest wymagany, a system nie jest ograniczony do rozmiarów kaptura laminarnego. To nie tylko umożliwia ciągłą dostawę składników odżywczych i wody, ale także zwiększa dostępną przestrzeń do wzrostu. Zmniejszona przestrzeń dla pędów może zmniejszyć zdolność fotosyntetyczną i przyczynić się do zahamowania wzrostu24, a ograniczenie objętości korzeni może prowadzić do wiązania się korzeni i zmniejszać pobieranie wody i składników odżywczych31. Połączenie małej przestrzeni do wzrostu i brak nawadniania w systemie torebkowym może wyjaśniać zmniejszoną biomasę i brak postępów fenologicznego kukurydzy i pszenicy w porównaniu z systemem GNOVA. Ten nowy system umożliwił gnotobiotyczny wzrost kukurydzy przez czas porównywalny z sorgo w EcoFAB 3.024. Co więcej, przewyższa gnotobiotyczny wzrost pszenicy przez cztery tygodnie w systemie hydroponicznym (20) w bardziej reprezentatywnym systemie glebowym. Oprócz fizycznych ograniczeń, systemy gnotobiotyczne często polegają na ograniczonym przepływie powietrza, aby utrzymać steryl

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to było sfinansowane przez Fundację Novo Nordisk (INTERACT, Numer grantu: NNF19SA0059360) oraz Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych w ramach kontraktu nr 2022-67013-36672.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Powerconnect cordless drill & 100-Piece KitBlack+DeckerBDC120VA1001/4" and 1/8" drill bits needed. 
Vinyl tape, yellow, 1" wide x 36 yards 3M471Consumable material
Sterling Rubber bands size #32  (2 rubber bands per system)AmazonB001I1QO00Consumable material. 
Wheat seedCultivar used in this experiment: Catawba
Fiberglass pipe wrap insulation, 3 " widex 1/2 " thick  (2 pre-cut circles per system)Lowe's28930Cut into 2 7/8 " (7.3 cm) diam circles. Consumable material. For high throughput production of circles roll out the wrap insulation and use the open edge of the pot to cut the circle by placing the pot on top of the insulation wrap and applying pressure and twisting. 
DW4 Filter media, Pre-cut to 15" x 75 yards  (1 cut circle per system)Class Biological Clean, LtdNACut into 6.3 " (16.02 cm) diam circles. CBC has other pre-cut or standard roll sizes that can be purchased instead if desired.  Consumable material. cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area of the DW4 media and cut with scissors.
Silicon tubing, Versilon SPX-50 High-strength, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wall thicknessSaint-GobainABX00007Cut into two long pieces ( 16" // 40.64 cm) and three short pieces (2.5" // 6.35 cm) 
Sodium hypoclorite 5% available chlorine in aqueous solutionVWRJT9416-1Dilute to 2% v/v and use for maize sterilization protocol
Murashige & Skoog medium, micro and macro elements. 25 LResearch Products InternationalM10200-25.0Diluted to 0.5x strength
Ethanol, 100%, Deacon LabsFisher scientific04-355-451Diluted to 95% v/v
Syringe 3 mL, luer lock unsterile  (2 per system)Fisher scientific14-817-117Discard plunger and only keep the barrel, fill with glass wool and cap with foil.
Glass beakers, 250 mL VWR470191-150Five are needed for wheat seed sterilization
Maize seedGenotype used in this experiment: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminum baking tray 18" x 26" AmazonB01FIK54LQMake sure it fits the dimensions of your flow hood
Sodium ChlorideFisher scientificBP358-1Prepare 0.145 M solution.
3D printed base, polylactic acid (PLA) filament used (1 per system)ProtolabsNAPrinting and editable files can be found in supplemental materials. Files available at Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. DO NOT AUTOCLAVE if PLA was used as filament to produce the base. PLA will melt above 150 °C and can get deformed above 60 °C. It is recommended that the integrity of the PLA 3D printed base is tested if it is to be used at temperatures above 40 °C. For higher heat resistance materials such as PETG (Polyethylene Terephthalate Glycol) or PC (polycarbonate) can be used instead; this will increase the cost of the part and might still not be autoclaveable. 3D printing of the base prototypes were accomplished in a personal printer with build volumes of of 256 × 256 × 256 mm (length × width × height). For speed and cost efficiency we recommend printing in bulk at local commercial 3D-printing service providers. 
Male luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polypropelene  (2 per system)Cole-ParmerEW-50114-69Refered as fitting 1 in the protocol
Male slip luer to hose barb fitting 1/8 " ID, animal derivative-free polyproylene  (1 per system)Cole-ParmerEW-50114-63Refered as fitting 2 in the protocol
201 Stainless steel worm gear hose clamps, 1 1/2" -3 1/2" clamping diameter (1 per system)Grainger5CZF2Refered as hose clamps in protocol
Airstream Gen 3 Laminar flow cabinet with simple switch, dimensions 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 " ESCO Lifesciences2120707Refered as laminar flow hood in protocol. Any laminar flow hood with similar dimensions works. Modifications might be needed in smaller flow hoods. 
Play sand, Quikrete Premium. 50 lbThe Home Depot1001709466Refered as sand in protocol
304 Stainless steel woven wire, 120 mesh (1 per system)AmazonB09KRS5F7TRefered as stainless steel wire mesh in article. Cut into 4.7" (11.9 cm) diameter circles. For high troughput or circle production, cut a template of the circle in cardboard and use it to draw circles throughout the area woven mesh of the woven mesh and cut with scissors. 
Clay (Montmorillonite), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Wt, not scentedGrainger44Z111Refered in protocol as clay. Consumable material.
Clear hurricane candle shade chimney tube without a bottom 4" OD x 30" length (1 per system)WCG InternationalHST0430Refered in protocol as glass cylinder
Clear plastic cap, 3" (7.6 cm) diam  (1 per system)ClearTec PackagingPCC3.000Refered in protocol as plastic cap
Clear Polycarbonate tubing, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' wall thickness x 12" length  (1 per system)ePlasticsPCTUB3.000X2.875Refered in protocol as pot. Can request company to cut to other desired lengths.
Cleanroom sterlization wrap, 6" x 6" (1 per system)Fisher scientific17-101-102Refered in protocol as sterilization wrap. Consumable material.
Dissecting forceps, Medium serrated tip 4 1/2" lengthVWR82027-398Refered in protocol as tweezers.
Tea strainersAmazonB0FRMRZWZYThree are needed for wheat seed sterilization
Clorox bleach with 5.7% available chlorineThe Home Depot1005131

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Batista, B. D., Singh, B. K. Realities and hopes in the application of microbial tools in agriculture. Microbial Biotechnology. , (2021).
  2. Parnell, J. J., et al. From the Lab to the Farm: An Industrial Perspective of Plant Beneficial Microorganisms. Frontiers in Plant Science. , (2016).
  3. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. , (2017).
  4. Compant, S., et al. Harnessing the plant microbiome for sustainable crop production. Nature Reviews Microbiology. , (2025).
  5. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research. Cell Host and Microbe. , (2017).
  6. Liu, Y. X., Qin, Y., Bai, Y. Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research. Current Opinion in Microbiology. , (2019).
  7. Basic, M., Bleich, A. Gnotobiotics: Past, present and future. Laboratory Animals. , (2019).
  8. Williams, S. C. P. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2014).
  9. Bennett, R. A., Lynch, J. M. Bacterial Growth and Development in the Rhizosphere of Gnotobiotic Cereal Plants. Microbiology. , (1981).
  10. Lindberg, T., Granhall, U. Acetylene reduction in gnotobiotic cultures with rhizosphere bacteria and wheat. Plant and Soil. , (1986).
  11. Maplestone, P. A., Campbell, R. Colonization of roots of wheat seedlings by bacilli proposed as biocontrol agents against take-all. Soil Biology and Biochemistry. , (1989).
  12. Simons, M. Gnotobiotic System for Studying Rhizosphere Colonization by Plant Growth-Promoting Pseudomonas Bacteria. MPMI. , (1996).
  13. Walley, F. L., Germida, J. J. Response of spring wheat to interactions between Pseudomonas species and Glomus clarum NT4. Biology and Fertility of Soils. , (1997).
  14. Ma, K. W., Ordon, J., Schulze-Lefert, P. Gnotobiotic Plant Systems for Reconstitution and Functional Studies of the Root Microbiota. Current Protocols. , (2022).
  15. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2017).
  16. Hsu, P. C. L., O’Callaghan, M., Condron, L., Hurst, M. R. H. Use of a gnotobiotic plant assay for assessing root colonization and mineral phosphate solubilization. Plant and Soil. , (2018).
  17. McLaughlin, S., et al. A Versatile Glass Jar System for Semihydroponic Root Exudate Profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  18. Miebach, M., et al. Litterbox—A gnotobiotic Zeolite-Clay System to Investigate Arabidopsis–Microbe Interactions. Microorganisms. , (2020).
  19. Salvato, F., et al. Evaluation of Protein Extraction Methods for Metaproteomic Analyses of Root-Associated Microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. , (2022).
  20. Kawasaki, A., et al. A sterile hydroponic system for characterising root exudates. Plant Methods. , (2018).
  21. Kremer, J. M., et al. Peat-based gnotobiotic plant growth systems for Arabidopsis microbiome research. Nature Protocols. , (2021).
  22. Nezhad, A. S. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a Chip. , (2014).
  23. Gao, J., et al. Ecosystem Fabrication protocols for plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  24. Gupta, K., et al. EcoFAB 3.0: a sterile system for studying sorghum. Frontiers in Plant Science. , (2024).
  25. Verma, S. K., et al. Exploring Endophytic Communities of Plants. Seed Endophytes: Biology and Biotechnology. , Springer. Cham. (2019).
  26. Parnell, J. J., et al. Effective Seed Sterilization Methods Require Optimization Across Maize Genotypes. Phytobiomes Journal. , (2024).
  27. Lee, J., Kim, H. S., Jo, H. Y., Kwon, M. J. Revisiting soil bacterial counting methods. PLOS One. , (2021).
  28. Thomas, P., et al. Optimization of single plate-serial dilution spotting method. Biotechnology Reports. , (2015).
  29. Munkager, V., et al. AgNO3 Sterilizes Grains of Barley without Inhibiting Germination. Plants. , (2020).
  30. Wagner, M. R., et al. Microbe-dependent heterosis in maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, , (2021).
  31. Poorter, H., et al. Pot size matters: effects of rooting volume on plant growth. Functional Plant Biology. , (2012).
  32. Ferrante, A., Mariani, L. Agronomic management for enhancing plant tolerance to abiotic stresses. Horticulturae. , (2018).
  33. Vollmer, R., et al. Effect of Gas Exchange Rate and Vessel Type on plant growth. Plants. , (2024).
  34. Cardoso, E. J. B. N., et al. Soil health: suitable indicators for assessment. Scientia Agricola. , (2013).
  35. Sinclair, T. R., Ludlow, M. M. Influence of soil water supply on plant water balance. Australian Journal of Plant Physiology. , (1986).
  36. Döll, S., Koller, H., van Dam, N. M. Protocol for collecting root exudates from soil grown plants. Rhizosphere. , (2024).
  37. Williams, A., et al. Comparing root exudate collection techniques. Soil Biology and Biochemistry. , (2021).
  38. Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains. Nature Ecology and Evolution. , (2019).
  39. Seethepalli, A., et al. RhizoVision Explorer: software for root image analysis. AoB Plants. , (2021).
  40. Pace, J., et al. Analysis of maize seedling roots using ARIA. PLOS One. , (2014).
  41. Jensen, T. B. N., et al. High-throughput DNA extraction and metagenome preparation. PLOS One. , (2024).
  42. Romero-Salas, E. A., Ibarra-Sánchez, C. L. Isolation of Metagenomic DNA from Plant Roots. Plant Microbiome Engineering. , Springer. New York. (2025).
  43. Su, P., et al. Recovery of metagenome-assembled genomes from rice phyllosphere. Scientific Data. , (2022).
  44. Northen, T. R., et al. Community standards for synthetic communities in plant–microbiota research. Nature Microbiology. , (2024).
  45. Poursalavati, A., Javaran, V. J., Laforest-Lapointe, I., Fall, M. L. Soil Metatranscriptomics: improved RNA extraction method. Phytobiomes Journal. , (2023).
  46. Vannier, N., et al. Genome-resolved metatranscriptomics reveals conserved root colonization determinants. Nature Communications. , (2023).
  47. Zheng, L., et al. Extraction of Proteins from Soil. Metaproteomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  48. Zheng, L., et al. Comparative physiological and proteomic response to phosphate deficiency. Journal of Proteomics. , (2023).
  49. Rieusset, L., et al. Cross-metabolomic approach in wheat–Pseudomonas interaction. Metabolites. , (2021).
  50. Zhang, Y., et al. Metabolite-mediated responses of phyllosphere microbiota. Microbiology Spectrum. , (2023).
  51. Swenson, T. L., Northen, T. R. Untargeted Soil Metabolomics. Microbial Metabolomics: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BiologiaWydanie 232Wydanie 232Warto pustaWydanieGnotobiotyka ro linInterakcje ro lin z mikroorganizmamisyntetyczne spo eczno ci mikroboweSynComspszenicakukurydzakukurydzamikrobiommikrobiota
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły