Generowanie substratów ekstrakomórkowych z poliakryloamidu i silikonu o określonej sztywności dla zastosowań w biologii komórki

Summary

Mimo że sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest kluczowym regulatorem zachowania komórkowego, podstawowe mechanizmy wyczuwania i przekazywania sygnałów pozostają niejasne. Aby temu zaradzić, udostępniamy protokoły tworzenia podłoży na bazie poliakryloamidu i silikonu o regulowanej sztywności, aby poszerzyć naszą wiedzę o komunikacji między komórkami a ECM.

Abstract

Macierz pozakomórkowa (ECM) jest krytycznym regulatorem zachowania komórek, przy czym sztywność ECM pełni rolę kluczowego wskaźnika mechanicznego, który rządzi sygnalizacją komórkową, morfologią i losem komórek. Jednakże, eksperymentalne badanie reakcji komórkowych zależnych od sztywności jest często ograniczone dostępnością reproduktyjnych, ekonomicznych i dostępnych platform hodowlanych o precyzyjnie modulowanych właściwościach mechanicznych. Ten protokół opisuje metody oparte na poliakryloamidzie (PA) i silikonie do produkcji podłoży ECM o regulowanej sztywności. Procedury obejmują przygotowanie podłoża, funkcjonalizację powierzchni oraz sprzęganie białek ECM w celu zapewnienia jednolitej adhezji komórek w zakresie fizjologicznie istotnej sztywności. Podłoża na bazie PA są kompatybilne z późniejszymi badaniami biochemicznymi, w tym ekstrakcją białek i RNA, jak również wysokorozdzielczym obrazowaniem fluorescencyjnym. Podłoża na bazie silikonu są zoptymalizowane pod kątem mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), umożliwiającej wizualizację interakcji komórka-ECM na poziomie błony podstawnej. Dodatkowo, miękkie podłoża mogą być dostosowane do obsługi hodowli sferoidów umieszczonych w jednolitej płaszczyźnie obrazu, ułatwiając jednolite pozyskiwanie obrazów. Te metody dostarczają niezawodnych, ekonomicznych i reproduktyjnych platform do systematycznego badania, jak sztywność ECM reguluje procesy komórkowe, poszerzając mechanizmyczne zrozumienie interakcji komórka-ECM zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i chorobowym.

Introduction

Macierz pozakomórkowa (ECM) jest fundamentalną strukturalną i biochemiczną podstawą, która definiuje właściwości mechaniczne tkanek i wspiera ich funkcje biologiczne. Na przykład tkanki elastyczne, takie jak płuca i tętnice, są wzbogacone w ECM oparty na kolagenie i elastynie, który zapewnia wymaganą odporność mechaniczną podczas powtarzających się cykli rozciągania i kurczenia podczas oddychania. W przeciwieństwie do tego, układ nerwowy centralny zawiera ECM bogaty w glikozaminoglikany, który tworzy wysoce elastyczne środowisko zoptymalizowane pod kątem różnicowania i przekazywania sygnałów neuronów¹. W różnych tkankach w organizmie, sztywność tkanki obejmuje kilka rzędów wielkości, od setek paskali w miękkich tkankach, takich jak mózg i płuca, do poziomów sztywności w megapascalach i gigapascalach w ścięgnach i kościach, odpowiednio^2,3. Te różnice mechaniczne nie są tylko strukturalne, ale odgrywają również krytyczną rolę w regulacji zachowania komórek^4,5. Na przykład komórki mezenchymalne przechodzą specyfikację linii komórkowych zależną od sztywności, przyjmując los neuronów na miękkich podłożach, los miogeniczny na podłożach pośrednich i los osteogeniczny na sztywnych podłożach⁶. Patologiczne zmiany w sztywności ECM mogą również powodować nieprawidłowe reakcje komórkowe i przyczyniać się do inicjacji i postępu choroby^7,8,9. Podobnie zmiany właściwości ECM wokół komórek zmieniają również funkcję organelli i różne zachowania komórek^10,11. Mimo uznanej wagi ECM w sterowaniu przekaźnictwem sygnałowym, funkcją organelli i patogenezą chorób, mechanizmy, którymi komórki wyczuwają i przekazują wskazówki ECM w biochemiczne sygnały, pozostają niedostatecznie zrozumiałe.

Postęp w rozumieniu przekaźnictwa komórka-ECM był częściowo utrudniony przez ograniczoną dostępność platform eksperymentalnych, które oferują precyzyjną kontrolę nad właściwościami ECM, zachowując pełną kompatybilność ze standardowymi testami biochemicznymi i przepływami prac roboczych z obrazowaniem. Ponadto badanie interakcji komórka-ECM jest często postrzegane jako technicznie trudne, ponieważ wymaga wielodyscyplinarnej ekspertyzy obejmującej nauki materiałowe, biologię komórki i inżynierię biomedyczną. Ten metod ma na celu zaawansowanie tych wyzwań, zapewniając szczegółowe protokoły do generowania podłoży ECM opartych na PA i silikonie o zdefiniowanych właściwościach mechanicznych, które można łatwo przygotować w większości ustawień laboratorium mokrego.

Hydrożele PA o regulowanej sztywności są podstawą mechanobiologii; jednak ich przydatność jest często ograniczona przez wysoki koszt reagentów do koniugacji ECM, niekonsekwentną funkcjonalizację powierzchni i słabą kompatybilność z dużoskalowym przepływem prac biochemicznych. Ponadto praktyczne i standaryzowane podejścia do pobierania próbek i obrazowania w przypadku podłoży o zmiennej sztywności nie są dobrze ustalone. Te wąskie gardła można rozwiązać za pomocą naszego opisanego platformu PA gel, który charakteryzuje się czterema kluczowymi innowacjami: (i) znaczna redukcja kosztów, (ii) reproduktywalna chemia funkcjonalizacji, (iii) skalowalna produkcja poprzez wielokrotnego użytku sprzęt i (iv) bezproblemowa integracja z wieloma konwencjonalnymi testami biologii komórki i biochemicznymi. To podejście wykorzystuje różne proporcje akrylamidu i bisakrylamidu, aby wygenerować hydrożele o różnych właściwościach mechanicznych (Tabela 1). Żel PA jest obojętny i nie może się bezpośrednio koniugować z białkami ECM. Dlatego do koniugacji cienkiej, skonkretyzowanej sieci tetraakrylanu di(trimetylopropanu), kwasu akrylowego N-hydroksuksinimidowego estru (NHS-akrylan) i bisakrylamidu na powierzchni żelu PA (Rysunek 1) stosuje się reakcję polimeryzacji wolnorodnikowej inicjowaną UV. Ta sieć tworzy dwukierunkowy adhezywny podkład dla białek ECM: NHS-akrylan zapewnia stabilne kowalentne zakotwiczenie dla białek ECM, podczas gdy tetraakrylan umożliwia jednolite adsorpcję białek ECM¹². Ponadto dostarczamy metody pokazujące, jak zbierać białka i kwasy nukleinowe, takie jak RNA z tych podłoży w sposób zgodny z dalszymi analizami biologii komórki, takimi jak western blotting i odwrotna transkrypcja-ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR). Ponadto powstające elastyczne podłoża PA wspierają również formowanie sferoidów i pozycjonowanie sferoidów w jednolitej płaszczyźnie ogniskowej, umożliwiając systematyczną analizę 3D zachowań komórek¹³.

Natomiast ograniczenia optyczne hydrożeli PA ograniczają ich zastosowanie w zaawansowanych modalnościach obrazowania, szczególnie mikroskopi fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIRF)¹⁴. Aby rozwiązać to ograniczenie, opracowaliśmy mechanicznie regulacyjne podłoża ECM oparte na silikonie, zoptymalizowane pod kątem obrazowania TIRF. Te materiały wykazują indeks załamania bliski szkła, zachowując regulowaną sztywność w

Protocol

1. Generowanie żeli ECM opartych na PA

1. Funkcjonalizacja powierzchni szklanych do przymocowania żelu PA
   UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej na shakerze orbitalnym. Dokładnie spłukuj wodą wysokiej jakości między krokami.
   1. Oczyść powierzchnie szklane 10% wybielaczem na 3 h w chemicznej odpornej misce (np. polistyren). Użyj wystarczającej objętości, aby całkowicie pokryć szkło i upewnij się, że nie ma uwięzionych bąbelek ani suchych obszarów.
      UWAGA: Wybielacz jest wysoce żrący i reaktywny. Przestrzegaj instrukcji bezpieczeństwa producenta.
   2. Inkubację szkiełek w 0,2 M kwasie solnym (HCl) przez 16 h z łagodnym wzburzeniem na shakerze.
      UWAGA: HCl jest żrący i może powodować oparzenia skóry. Noś odpowiednie PPE.
   3. Dodaj 0,1 M NaOH i inkubację przez 1 h.
      UWAGA: Roztwory NaOH są żrącowe i mogą powodować oparzenia skóry. Noś odpowiednie PPE.
   4. Inkubację szkieł w 0,5% APTES w wodzie wysokiej jakości przez 30 min.
      UWAGA: APTES jest toksyczny. Pracuj z APTES w wyciągu laboratoryjnym z odpowiednim PPE.
   5. Spłucz szkła dużą objętością wody, aby usunąć wszelkie resztki APTES.
      UWAGA: Niekompletne mycie spowoduje reakcję między APTES i glutaraldehydem w następnym kroku i doprowadzi do białych osadów, które zakłócą aktywację powierzchni szkła.
   6. Inkubację szkieł w 0,5% glutaraldehydzie w PBS przez 1 h.
      UWAGA: Glutaraldehyd jest toksyczny. Pracuj z glutaraldehydem w wyciągu laboratoryjnym z odpowiednim PPE.
   7. Suszenie szkieł na materiałach absorpcyjnych (np. ręcznikach papierowych) przez noc. Przechowuj szkła w czystym, szczelnym pojemniku do użycia.
2. Przygotowanie roztworu żelu PA i odlewu żelu
   UWAGA: Formuły potrzebne do uzyskania żeli o określonym modulom sprężystości są podane w Tabeli 1. Zalecane objętości żelu i wymiary szkła dla różnych zastosowań eksperymentalnych są przedstawione w Tabeli 3.
   1. Wymieszaj komponenty żelu PA w 1,7 mL mikroprobówce, wyłączając persiarczany amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminę (TEMED).
      UWAGA: Nie przygotowywaj dużych objętości, ponieważ żele o wyższej sztywności polimeryzują szybko i mogą stwardnieć przed zakończeniem odlewu.
   2. Degazuj mieszankę żelu PA, APS i TEMED w komorze próżniowej przy 25 mmHg przez 30 min.
   3. Przygotuj hydrofobowe górne szkła pokrywające, nakładając hydrofobową powłokę na czyste szkła za pomocą wacika. Upewnij się, że szkła są wolne od plam, aby utrzymać spójną polimeryzację żelu.
   4. Dodaj APS i TEMED do odgazowanego roztworu, a następnie delikatnie pipetą mieszaninę na aktywowanych szklnach.
   5. Umieść hydrofobowe szkła na wierzchu roztworu, aby utworzyć jednolitą cienką warstwę żelu. Pozostaw żele do polimeryzacji przez 35 min w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że między szklami nie są uwięzione bąbelki i że roztwór nie wylewa się za krawędzie.
      UWAGA: Przestrzegaj zalecanych objętości do odlewu żelu, aby zapewnić odpowiednią grubość; zbyt cienkie żele pozwalają komórkom wyczuwać podstawowe szkło¹⁵. Przed rozłożeniem składu żelowego sprawdź pozostałą mieszaninę w mikroprobówce, aby potwierdzić polimeryzację.
   6. Zanurz skład żelowy w PBS, aby oddzielić warstwy. Upewnij się, że żel pozostaje przymocowany do aktywowanego dolnego szkła, a hydrofobowe górne szkło odczepia się łatwo.
3. Funkcjonalizacja żeli z ligandami ECM
   UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w środowisku bezpieczeństwa biologicznego.
   1. Sterilizuj żele, zanurzając je w 70% alkoholu etylowym, a następnie przenieś je do naczyń kulturalnych z tkankową kulturą za pomocą sterylnego PBS.
      UWAGA: Nie zostawiaj żeli w alkoholu na dłuższy czas, ponieważ spowoduje to odwodnienie żeli i osłabi koniugację ECM.
   2. Przygotuj główny roztwór funkcjonalizacyjny złożony z wody, alkoholu, HEPES i bisakrylamidu (Tabela 4).
      UWAGA: Bisakrylamidem jest toksyczny przy inhalacji lub połknięciu.
   3. Przygotuj rozcieńczone roztwory fotoinicjonatora UV i tetraakrylatu. Oba reagenty są rozpuszczone w alkoholu (Tabela 4).
      UWAGA: Wykonuj szeregowe rozcieńczenia tetraakrylatu za każdym razem, ponieważ nadmierny montaż może prowadzić do nadmiernej polimeryzacji i widocznych czarnych osadów na powierzchni (patrz Rysunek 3A).
   4. Waż wymaganą ilość NHS-akrylatu za pomocą wagi analitycznej. Natychmiast przed użyciem zawieś NHS-akryl w 50% alkoholu/50% wodzie.
      UWAGA: Nadmierna ilość NHS-akrylatu skutkuje powstawaniem

Results

Twardość żelu PA wygenerowana za pomocą receptur w Tabeli 1 została przetestowana eksperymentalnie za pomocą reometru. Wybrano żele o wartościach twardości nominalnej 0,4 kPa, 6 kPa i 60 kPa, rozciągając się na trzy rzędy wielkości. Zmierzone wartości twardości wynosiły 363 ± 76 Pa dla żeli 400 Pa, 6,41 ± 0,50 kPa dla żeli 6 kPa i 36 ± 8 kPa dla żeli 60 kPa (Rysunek 4A). Aby ocenić jednolite przyłączenie ECM do żeli PA, fluorescencyjnie oznakowana fibronektyna została sprzężona z powierz...

Discussion

Przedstawiony protokół wytwarzania ECM zapewnia powtarzalny, skalowalny i opłacalny proces i może być łatwo wdrożony w większości laboratoriów. Chociaż tradycyjne szklane i plastikowe naczynia do hodowli są wygodne i umożliwiają szybkie zbieranie danych, syntetyczne podłoża nie radzą sobie z odtworzeniem fizjologicznie odpowiedniej sztywności tkanki. Alternatywne mechanicznie modulujące podłoża, takie jak polidimetyloksylan (PDMS) lub żelatyna metyloakryloilowana (GelMA), są łatwiejsze do wytworzenia, ale ogólnie nie osi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1.7 mL microcentrifuge tubes	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12-well tissue culture-treated plates	-	83.3921	Sarstedt
15 mL centrifuge tubes (for orange chamber)	-	CLS430790	Corning
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamide solution	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	28718-90-3	-	Sigma
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% Acrylamide solution	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Glutaraldehyde	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm tissue culture-treated dishes	-	83.3901	Sarstedt
A549 cells	-	CCL-185	ATCC
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit antibody	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium salt))	-	A37572	Invitrogen
Ammonium persulfate	7727-54-0	-	Bio-Rad
Clear impact-resistant polycarbonate film (0.005 in.; spacer)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 silicone gel, Components A and B	2624028	-	Dow
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Ethanol, anhydrous	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectin	-	356008	Corning
Formaldehyde (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
High-temperature silicone rubber sheet (0.020 in.; gasket)	-	86435K452	McMaster-Carr
Hydrochloric acid	7647-01-0	-	BioShop
Large hollow hole punch tool set	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Microscope slide coverslips, 18 mm diameter	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Microscope slide coverslips, 50 mm diameter	-	1.84E+16	eBay
PBS (1×)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloidin	17466-45-4	-	Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) antibody	-	85567	Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) antibody	-	3671	Cell Signaling Technology
Plasma cleaner	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR primers (forward and reverse)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA Synthesis Kit	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Screw-cap tubes, conical base, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Screw-cap tubes, conical base, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Serological pipette, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Serological pipette, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Sodium hydroxide	1310-73-2	-	BioShop
SYPRO Ruby protein gel stain	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
TRIzol reagent	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
UV chamber	-	165-5031	Bio-Rad