Charakterystyka struktury membrany lipid-białko Charakterystyka z wykorzystaniem dwuwarstw interfejsu kroplowego

Summary

Przedstawiono eksperymentalny protokół służący do złożenia, stymulacji elektrycznej i analizy dwuwarstw interfejsu kropli domieszkowanych gramicidyną A. Relacje struktura między białkiem a funkcja są ilościowo określane poprzez pomiar zmian powierzchni błony, strumienia jonowego i przewodności jednokanałowej, a także powiązanie tych odpowiedzi ze zmianami plastyczności w przewodzeniu jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Abstract

Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB) oferują regulowaną platformę do badania właściwości elektromechanicznych lipidów i membran lipidowo-peptydowych pod kontrolowaną stymulacją elektryczną. DIB umożliwiają zarówno pomiary przewodnictwa jonów jednokanałowych, jak i zespołowych na obszarach błon o rzędy wielkości większych niż tradycyjne techniki patch clamp, co pozwala na analizy odkształceń elektromechanicznych na poziomie membrany i ich wpływu na peptydy prowadzące jony. Systematyczne strojenie struktury membrany w fazie oleju węglowodorowego (np. heksadekan [C16] vs. dodekan/heksadekan [C12/C16] [25%/75%, v/v]), ta oddolna platforma umożliwia systematyczną zmienność składu błony i środowiska olejowego, co wpływa na lepkoelastyczność i reorganizację strukturalną membrany, a tym samym na przewodzenie jonów peptydowych. Szczegółowe procedury dotyczą montażu membran domieszkujących gramicydyną A 1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC) przy użyciu różnych składów olejów węglowodorowych oraz stosowania protokołów impulsów napięciowych, które wprowadzają membrany w metastabilne stany elektromechaniczne. Charakteryzuje się adaptacyjne przewodzenie jonów błonowych, w tym krótkotrwałe odpowiedzi podobne do plastyczności (STP) oraz długoterminowe potencjacyjne i depresyjne (LTP-podobne/LTD-podobne) odpowiedzi w modelowym systemie błonowym. Szerzej rzecz biorąc, protokół ten zapewnia solidne, powtarzalne podejście do systematycznego badania składu zależnego, membranowego wkładu elektromechanicznego do synaptycznopodobnego przewodzenia oraz do zrozumienia, jak środowiska błonowe lipidowe modulują funkcję kanału jonowego.

Introduction

Błony biologiczne są kluczowymi strukturami nadmolekularnymi, które mogą regulować przewodzenie jonowe i umożliwiać komunikację między neuronami poprzez synapsy elektryczne i chemiczne ^1,2,3,4. Ten typ komunikacji jest dodatkowo kontrolowany przez plastyczność synaptyczną, gdzie zmiany strukturalne synaps modulują ich siłę i trwałość w różnych skalach czasowych ^5,6, często opisywane jako krótkotrwała plastyczność (STP) oraz długoterminowa potencjacja lub obniżenie (LTP lub LTD). Zjawiska te, które obejmują dynamiczne zmiany przewodnictwa błon w odpowiedzi na aktywność neuronalną, często są powiązane z neuroplastycznością⁷, która leży u podstaw uczenia się i pamięci⁸. Tradycyjne modele plastyczności często podkreślają biochemiczną regulację kanałów jonowych poprzez syntezę, transport białek lub fosforylację⁹. Jednak rola błon plazmatycznych neuronalnych w modelach plastyczności została w dużej mierze pomijana^10,11.

Metody patch-clamp są stosowane od ponad pół wieku do badania elektrofizjologii kanału jednojonowego (single-ion-channel). Jednak mogą badać tylko obszary błon znacznie mniejsze niż nienaruszone synapsy lub duże modele syntetyczne. W związku z tym stanowią techniczne ograniczenie w badaniu mezoskalowej reorganizacji i deformacji membran. Mezoskala jest coraz bardziej uznawana za krytyczną skalę długości do zrozumienia wielu aspektów biofizyki błon^12,13.

Przedstawiono metodologię wykorzystania dwuwarstw interfejsu kropli 1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocholiny (DIBs)^14,15 domieszkowanych monovalentnym jonoforem kationowym peptydu, gramicydyną A (gA), do modelowania przewodzenia jonowego, podobnie jak w synapsie elektrycznej. System ten oferuje kilka kluczowych zalet: (i) DIB zapewniają regulowaną platformę lipidową i olejową, która umożliwia systematyczną reorganizację błon¹⁶; (ii) DIB umożliwiają badanie zdarzeń kanałowych jednokanałowych i zespołowych w zakresie skal długości^17,18; oraz (iii) DIB umożliwiają badanie submilimetrowych platek membrany o rozmiarze², które rejestrują zbiorową elektromechanicznie indukowaną restrukturyzację membrany, jednocześnie zachowując zdolność do rozwiązywania zdarzeń przewodzenia jonów jednokanałowych^19,20. Metoda ta jest najbardziej odpowiednia do badań wymagających jednoczesnego badania elektromechaniki membran elektrycznych i optycznych na obszarach większych niż dostępne za pomocą konwencjonalnego patch clamp, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do rozdzielania dyskretnych zdarzeń kanałowych. Jest szczególnie przydatny, gdy celem eksperymentu jest zbadanie, jak skład membrany, środowisko olejowe oraz fale napięciowe wpływają na zbiorową restrukturyzację membran i przewodzenie peptydów. Metoda ta jest mniej odpowiednia do eksperymentów wymagających natywnej architektury komórkowej lub bezpośrednich odczytów molekularnych zmian konformacyjnych białek w nienaruszonych błonach biologicznych 19,20,21.

Stosując fizjologicznie istotną stymulację elektryczną, DIB są wprowadzane w nierównowagowe stany ustalone, w których dynamiczna restrukturyzacja elektromechaniczna zmienia przewodnictwo jonowych kanałów peptydowych. Te pojawiające się zmiany w przewodnictwie jonowym są opisowo analogiczne do neurologicznych zjawisk STP, LTP i LTD omawianych w neurobiologii 22,23,24. W niniejszym badaniu zachowania te interpretowane są głównie jako fizyczne odpowiedzi na poziomie błony na stymulację elektryczną związane z właściwościami mechanicznymi błony wewnętrznej, takimi jak lepkoelastyczność i ściśliwość w modelowym systemie membranowym²⁵. Co istotne, opisane tutaj badanie opiera się na wcześniejszych dowodach, że dwuwarstwy lipidowe mogą wykazywać fundamentalną pamięć elektryczną poprzez trwałe przesunięcia przewodności i pojemnościowe magazynowanie ładunku po stymulacji 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^,34, oferując nowe spojrzenie na mechanizmy, dzięki którym dwuwarstwy lipidowe mogą wspierać adaptacyjną, synaptyczną funkcjonalność w przypadku braku złożonej maszynerii komórkowej. Wreszcie, ta metodologia umożliwia również bezpośrednie badanie relacji struktura-funkcja oraz tego, jak emergentne zachowanie makroskalowe powstaje z prostej reorganizacji strukturalnej 21,25,27.

Protocol

Dokładnie umyj wszystkie szkła i sprzęt przygotowawczy odpowiednimi detergentami laboratoryjnymi i opłucz wodą destylowaną przed przygotowaniem próbki. Zawsze noś okulary ochronne oraz rękawice nitrylowe lub lateksowe, aby uniknąć zanieczyszczenia. Utylizacja wszystkich odpadów chemicznych zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego. Upewnij się, że lotne rozpuszczalniki są przechowywane prawidłowo zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego. Zadbaj o to, aby przestrzeń i sprzęt laboratorium eksperymentalnego (rysunek 1A), statek eksperymentalny (rysunek 1B) oraz połączenia elektryczne i optyczne (rysunek 1C) pozostały niezakłócone i wolne od przeszkód.

1. Przygotowanie wodnego roztworu buforowego

1. Waż odpowiednią ilość 3-(N-morfolino) kwasu propanonowego (MOPS) i chlorku potasu (KCl), aby uzyskać pożądane końcowe stężenia (np. 10 mM MOPS, 0,1 M KCl w 500 mL).
2. Dodaj MOPS i KCl do ~450 mL wody destylowanej w kolbie objętościowej 500 mL lub cylindrze stopniowanym i mieszaj magnetycznym prętem mieszającym aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. Zmierz pH za pomocą skalibrowanego miernika pH. Dostosuj pH do 7,4, dodając 1 M wodorotlenku potasu (KOH) lub kwasu solnego (HCl) w krokach po 0,25 mL, mieszając cały czas.
4. Zwiększ całkowitą objętość do 500 mL wodą destylowaną i dokładnie wymieszaj. Przełóż bufor do czystej, oznaczonej butelki, zamknij i przechowuj w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Używaj bufora do ~2 miesięcy. Przed każdym użyciem zweryfikowaj i ponownie dostosuj pH do 7,4.

2. Przygotowanie roztworu gramicidyny

1. W chemicznym okapu dodaj 5 mg gramicydyny A (gA) do czystej szklanej fiolki o pojemności 20 mL. Dodaj 10 ml metanolu za pomocą szklanej lub gazoszczelnej strzykawki i wirującej substancji, aż peptyd całkowicie się rozpuści. Oznacz fiolkę jako "gA bulion" i przechowuj w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Eksperymenty zespołowe wykorzystują molowe stosunki lipid i peptyd ~1:^10-4. Eksperymenty jednokanałowe wykorzystują peptyd ~10–100 razy niższy (1:^10-5–^10-6) do rozwiązywania pojedynczych zdarzeń w krótkim czasie zapisu (<1 min). Przygotowanie rozcieńczonego materiału poprawia dokładność pipetowania przy niskich stosunkach molowych (< ~ 1:^10-4).
2. Usuń dwie dodatkowe czyste szklane fiolki po 20 mL z argonem na ~5 sekund każda, aby usunąć kurz.
3. Używając czystej, szczelnej gazoszczelnej strzykawki, podaj 9,9 mL metanolu do każdej przepluchanej fiolki.
4. Pipeta 100 μL roztworu zapasowego gA sterylną, gazoszczelną strzykawką do jednej fiolki, aby uzyskać łączną objętość 10,0 mL. Oznacz tę fiolkę jako "A". Stężenie = 2,66 μM gA w metanolu.
5. Pipetą wlej 100 μL roztworu "A" do drugiej szklanej fiolki, aby uzyskać całkowitą objętość 10,0 mL. Oznacz tę fiolkę jako roztwór "B". Stężenie = 26,6 nM gA w metanolu.
6. Zamknij fiolki kapsułkami i owiń parafilmem.
7. Wszystkie roztwory gA przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Przygotowanie pęcherzyków lipidowo-peptydowych

1. Przeplukuj czystą szklaną fiolkę 20 mL z argonem na ~5 sekund.
2. Do fiolki dodaj 4 mg lipidu 1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC).
3. W okapie do spalin dodaj 1 ml metanolu za pomocą szklanej pipety. Delikatnie mieszaj lub wiruj, aż wszystkie lipidy się rozpuszczą.
4. Używając gazoszczelnej strzykawki o pojemności 500 μL, dodaj 178 μL roztworu "A" (do eksperymentów STP na poziomie zespołowym; DPhPC:gA molowy stosunek = 1:^10-4) lub 890 μL roztworu "B" (dla eksperymentów jednokanałowych; DPhPC:gA molowy stosunek = 1:5×^10-6) do roztworu metanolu DPhPC. Delikatnie wymieszaj wir.
5. Pod delikatnym strumieniem argonu w okapie odparuj metanol, aż na dnie fiolki utworzy się cienka, jednolita warstwa lipidowa.
6. Umieść otwartą fiolkę w piekarniku próżniowym o temperaturze 40 °C i podciśnij pełną próżnię przez 10–12 godzin lub przez noc, aby usunąć resztki rozpuszczalnika.
7. Wyjmij fiolkę z piekarnika próżniowego i dodaj 2 mL buforu KCl o pojemności 0,1 M przygotowanego w Sekcji 1 do eksperymentów STP, co daje końcowe stężenie lipidów i gramycydyny w zawiesie odpowiednio 2,36 mM i 236 nM. Dla eksperymentów jednokanałowych dodaj 2 mL bufora KCl o pojemności 1 M, jak przygotowano w Sekcji 1. Vortex w celu nawilżenia filmu lipidowego i uzyskania zawiesiny lipidowej o stężeniu 2 mg/mL, co skutkuje końcowym stężeniem lipidów i gramicydyny w zawiesie odpowiednio 2,36 mM i 11,8 nM.
8. Zamroź fiolkę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 6 minut, a następnie rozmroź ją na grzewcy lub kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C przez 6 minut. Krótko zmieszać wir. Powtórz ten cykl zamarzania i rozmrażania sześć razy, aby wspierać powstawanie pęcherzyków wielolamelowych.
9. Złóż wytłacznik lipidowy z membraną trawioną o porach 0,1 μm, zgodnie z instrukcjami producenta. Przepuszcz 500 μL buforu przez ekstruder trzy razy, aby nawodnić membranę, sprawdź, czy nie ma przecieków i wyrzuć bufor.
10. Załaduj 1 mL rozmrożonej zawiesiny lipidowo-peptydowej do ekstrudera i wykonaj 31 przejść przez membranę o pojemności 0,1 μm, aby uzyskać pęcherzyki unilamellarne o średnicy ~100 nm i zapewnić jednorodność rozmiaru.
11. Przełóż wytłoczone pęcherzyki (duże pęcherzyki jednoilamelarne, LUV) do probówki PCR o pojemności 1 mL, oznacz i przechowuj w temperaturze 4 °C. Użyj w ciągu 2 tygodni od przygotowania.
12. Zabezpiecz pozostałą zawiesinę lipidowo-białkową w oryginalnej fiolce, owiń parafilmem i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
13. Jeśli używasz wcześniej zamrożonych, niewytłaczonych próbek, ponownie stopić w temperaturze 40 °C na gorącej płycie lub pozwól próbce ogrzać się do temperatury pokojowej, następnie wytłaczać ją.

4. Przygotowanie żelu agarozowego

1. Umieść czystą szklaną zlewkę o pojemności 50 ml na grzewcu. Dodaj jedną tabletkę agarozy do 50 mL tego samego buforu, który służy do nawilżania filmu lipidowego (np. 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4), aby uzyskać 1% roztwór żelu agarozowego.
2. Dodaj czysty baton teflonowy i mieszaj energicznie, aż tabletka się rozproszy.
3. Przykryj zlewkę folią aluminiową i przebij mały otwór wentylacyjny metalową łopatką. Ustaw temperaturę płyty grzewcza na 220–230 °C. Roztwór staje się przezroczysty i osiąga toczące się wrzenia, co wskazuje na całkowite rozpuszczenie agarozy.
4. Wyłącz ogień i ostrożnie zdejmij folię. Przejeń każdą warstwę powierzchniową czystą metalową szpatułką. Użyj gorącego roztworu agarozy natychmiast do powlekania elektrod lub pozwól jej ostygnąć i zastygnąć w zlewce do późniejszego użycia.
5. Po powleknięciu elektrody agarozą przykryj stwardniałą agarozę folią, uszczelnij parafilmem, oznacz i przechowuj w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby podgrzej do wrzenia i mieszaj, aż całkowite roztopienie.

5. Przygotowanie elektrod

1. Przeciąć drut srebrny o średnicy 0,125 mm na ~70 mm dla elektrod na scenie i ~130 mm na elektrody uziemiające.
2. Używając otwartego płomienia (np. zapalniczki ręcznej lub palnika Bunsena), trzymaj jeden koniec każdego srebrnego drutu poziomo w najgorętszym centralnym stożku płomienia, aż końcówka stopi się i utworzy kulę kuliczną o średnicy ~0,2 mm (Rysunek 2A).
3. Umieść przewody na czystej powierzchni i sprawdź pod mikroskopem, czy kulki są kuliste i mają podobny rozmiar. Jeśli kula jest podłużna lub nieregularna, odetnij czubek i powtórz stopienie (Krok 5.2).
4. Włóż końce obu srebrnych drutów do szklanego pojemnika ze świeżym domowym wybielaczem (podchlorynem sodu, NaClO). Upewnij się, że kulki są całkowicie zanurzone i inkubują przez co najmniej godzinę, aby chlorować powierzchnię i tworzyć Ag/AgCl. Matowy brązowo-szary wygląd potwierdza skuteczną chlorację (rysunek 2B).
5. Usuń przewody z wybielacza, gdy końcówki kul są matowo-szare w kolorze, dokładnie opłucz wodą destylowaną i połóż je na czystej, wolnej od kłaczków powierzchni do wyschnięcia.
6. Zdobądź jeden uchwyt na pipetę na scenę główną i jeden uchwyt na elektrodę uziemiającą. Przetnij na pół naczynie naczyniowe naczynia włosowatego z borokrzemianu (średnica 1,0 mm, średnica 0,58 mm) za pomocą wycinarki do szkła.
7. Włóż jedną półkapilarę do uchwytu na pipetę na scenie głównej i dokręć uchwyt, aby ją zabezpieczyć. Zamontuj pełną kapilarę o średnicy 100 mm na utrzymaniu elektrody uziemiającej i zabezpiecz ją.
8. Włóż niekulkowy koniec srebrnego drutu o średnicy 130 mm do kapilary elektrody uziemiającej, aż ~20 mm końca kuli wystaje na zewnątrz. Przyklej przeciwległy koniec przewodu do uchwytu, pozostawiając odsłonięte ~5 mm na połączenie uziemienia.
9. Powtórz kolejny krok z 70 mm przewodem do elektrody sceny głównej, zapewniając solidny kontakt między przewodem a złączem sceny głównej (element w kolorze złotym). Przytnij nadmiar przewodów od końca złącza sceny głównej.
10. Zanurz każdą chlorowaną kulkę srebra w agarozie, tuż nad połączeniem kula-wał, aby uzyskać cienką, jednolitą powłokę. Zanurz się i wyjdź co najmniej 10 razy.
11. Wyjmij elektrodę i pozwól agarozie żelować w temperaturze pokojowej. Powtarzaj zanurzanie, jeśli trzeba, aby uzyskać gładką, równą agarozową skorupę o grubości dziesiątek mikrometrów. Unikaj zbyt wysokiej lub zbyt niskiej powłoki na przewodzie (rysunek 2C).
12. Zamontuj elektrody sceny głównej i uziemienia na mikromanipulatorach. Podłącz odsłonięty przewód uziemiający (~5 mm) do masy wzmacniacza za pomocą klipsa aligatorowego.
13. Za pomocą pęsety delikatnie zgiąć każdą elektrodę w połowie między końcem kulki a naczynią włosowatą tak, aby była ona prostopadle do stołu mikroskopu. Unikaj zakrętów większych niż 90°, aby zminimalizować zniekształcenia optyczne w widokach wizualnych i wideo z mikroskopu.
14. Dostosuj orientację elektrod w ich uchwytach tak, aby końcówki kulek pokryte agarozą były prostopadle do płaszczyzny obrazowania mikroskopu (Rysunek 3A).

6. Tworzenie dwuwarstw interfejsu kropli (DIB)

1. Umieść czystą, przezroczystą szalkę Petriego na scenie odwróconego mikroskopu. Napełnij naczynie olejem alkanowym (np. 100% heksadekan, lub 25%/75% v/v dodekan/heksadekan) na głębokość ~5 mm (rysunek 1B).
2. Za pomocą sterowania mikromanipulatora oba końce kul pokryte agarozą opuszczają do oleju na głębokość ~2,5 mm poniżej powierzchni oleju. Unikaj szybkiego ruchu mikromanipulatora, aby zapobiec kolizjom z głowicą kulki elektrody z szalką Petriego.
3. Reguluj ostrość mikroskopu, aż oba końce kulek i ich powłoki agarozowe będą ostre. Umieść elektrody blisko krawędzi pola widzenia, aby obie mogły być obserwowane jednocześnie.
4. Używając skalibrowanej pipety o pojemności 2 μL, aspiruj wytłoczony zawiesin pęcherzyków lipidowo-peptydowych. Powoli rozlewaj 250 nL zawieszenia bezpośrednio na każdy końcówkę kulki pokrytą agarozą, używając osobnej końcówki pipety, nie dotykając agarozowej muszli końcówką pipety.
   UWAGA: Aby zminimalizować drgania dłoni i zwiększyć stabilność, zakotwicz oba łokcia do krawędzi stołu antywibracyjnego. Stabilizuj nadgarstek pipetujący ręką niepipetującą, powoli zanurz pipetę w oleju i stopniowo zbliżaj się do elektrody. Krótkie wstrzymanie oddechu podczas ładowania kropli może dodatkowo zmniejszyć niezamierzone ruchy.
5. Pozwól kropelkom rozprzestrzenić się i pokryć powłokę agarozy, a następnie oddalić się od elektrody pod wpływem grawitacji. Obserwuj ugięcie się z boku przez ścianę szalki Petriego, jeśli jest to czyste (Rysunek 3B).
   UWAGA: Czas potrzebny na opadanie kropelek zależy od rozkładu wielkości pęcherzyka, temperatury oraz topografii agarozy. W przypadku DIB DPhPC należy odczekać co najmniej 5 minut po depozycji kropli¹⁵.
6. Delikatnie szturchnij stół antywibracyjny, aby ocenić gotowość kropel. Potwierdź, że opadające krople poruszają się z niewielkim opóźnieniem względem ruchu elektrody, co wskazuje na powstawanie w pełni pokrytych kropli monowarstwy lipidowej.
   UWAGA: Opóźniony ruch występuje, ponieważ tworzenie lipidowej monowarstwy wokół kropli wodnej znacząco obniża napięcie powierzchniowe, opóźniając tym samym reakcję fizyczną podczas poruszania elektrody w oleju.
7. Jeśli to zachowanie nie zostanie zaobserwowane, odczekaj dodatkowe 2–3 minuty i powtórz proces.

7. Instalacja elektryczna i monitorowanie dwuwarstwowe (wizualne i elektryczne)

1. Upewnij się, że mikroskop, stół antydrgacyjny, klatka Faradaya oraz wszystkie komponenty elektryczne, w tym wzmacniacz, cyfryzator, generator funkcji i komputer, są podłączone do wspólnego masowania (Rysunek 1).
2. Ułóż połączenia instrumentów zgodnie z instrukcjami produkcyjnymi. Użyj Rysunku 1C jako referencyjnego schematu dla podstawowej konfiguracji elektrycznej i optycznej. Zapoznaj się ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi uziemienia^35, konfiguracji sprzętowo-programowej oraz regulacji przesunięcia pipety dla eksperymentów DIB.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami konfiguracji sprzętu specyficznymi dla całego oprogramowania i sprzętu wymienionych w Tabeli Materiałów.
3. Podłącz elektrody sceny głównej i masy do wzmacniacza patch-clamp.
4. Konfiguruj zewnętrzny generator funkcji (lub kanał wyjściowy oprogramowania akwizycji) do generowania przebiegu napięcia trójkąta 10 Hz, 10 mV. Potwierdź amplitudę i częstotliwość na podłączonym oscyloskopie oraz w oprogramowaniu rejestracyjnym.
5. Po opadnięciu kropelek przez ~ 10 minut użyj mikromanipulatorów, aby delikatnie je zetknąć. Ustawij położenie elektrod tak, aby powierzchnia styku kropelek początkowo nie przekraczała ~ 1/4 ich^średnicy.
6. Włącz przebieg trójkąta 10 Hz, 10 mV i monitoruj odpowiedź prądu pojemnościowego za pomocą wzmacniacza i oprogramowania akwizycji.
7. Poczekaj na spontaniczne powstawanie dwuwarstwy, co jest elektrycznie sygnalizowane przez rozszerzającą się odpowiedź pojemnościową od szczytu do szczytu oraz optycznie przez rosnące odbicie wewnętrzne (owalny wygląd) od kontaktu dwuwarstwowego (Rysunek 4). Potwierdź, że czyste dwuwarstwy lipidowe wykazują prostokątne plateau prądu względem trójkątnego bodźca napięciowego, podczas gdy dwuwarstwy dopingowane gA przy ~1:^10-4 lipidów: peptydy wykazują pochylone plateaue odzwierciedlające przewodzenie jonowe zespołu.
8. Reguluj powierzchnię kontaktu kropli poprzez niewielkie przesunięcie elektrod do momentu, gdy prąd pojemnościowy na przebieg trójkąta 10 Hz, 10 mV wynosi między ~100–200 pA dla ~250 nL DIB w olejach C16 lub C12/C16, co odpowiada zakresowi pojemności ~250–500 pF³³.
   UWAGA: Impulsy o wysokiej częstotliwości lub niezerowe napięcia utrzymania prądu stałego mogą wywołać elektrozwilżanie i nadmierną rozszerzalność dwuwarstw, prowadząc do koalewacji kropelek i pęknięcia dwuwarstwy. Zakres 100–200 pA zapewnia równowagę między stabilnością dwuwarstwową a stosunkiem sygnał-szum, pozwalając na wystarczającą ekspansję powierzchni podczas stymulacji.
9. Jeśli DIB się zbliży, wyciągnij elektrody z oleju. Dokładnie opłucz głowice elektrod tym samym buforem wodnym, który był używany do próbek lipidów i agarozy.
10. Usuń wszelkie krople wodne z szalki Petriego sterylną strzykawką. W razie potrzeby uzupełnij świeżym olejem, ponownie zanurz elektrody. Ponownie załaduj roztwór LUV na elektrody zgodnie z Sekcją 6 i powtórz proces.
11. Po potwierdzeniu stabilnych odpowiedzi pojemnościowych lub przewodzących wyłącz przebieg trójkąta i pozwól DIB wyrównać się przez co najmniej 15 minut przed zastosowaniem protokołów stymulacji.

8. Protokoły stymulacji elektrycznej

1. Eksperymenty impulsowe (zespołowe odpowiedzi podobne do STP oraz LTP / LTD)
   1. Konfiguruj generator funkcji lub oprogramowanie akwizycji tak, aby dostarczał impulsy napięciowe o pożądanej amplitudzie, czasie trwania i interwałach między impulsami (np. wzory PPF [ułatwianie parowanego impulsu] i PPD [depresja impulsów parowanych]).
   2. Otwórz oprogramowanie do nagrywania wideo. Wybierz odpowiednie ustawienia aparatu i obiektywu. Ustaw liczbę klatek na co najmniej 20 klatek na sekundę i poupewnij się, że podczas nagrywania pozostaje stabilna.
   3. W oprogramowaniu do akwizycji danych ustaw częstotliwość próbkowania na co najmniej 5 kHz dla bieżącego sygnału.
   4. Kliknij Przejmuj > Nowy Protokół, aby utworzyć nowy protokół, lub Pobierz > Edytuj Protokóń, aby zmodyfikować istniejący. W zakładce Tryb Akwizycji wybierz Stymulację Epizodyczną. Ustaw Runs/Trial na 1, a Sweeps/Run na 1.
   5. Ustaw czas przemiatania na 4 s dłuższy niż całkowity czas trwania eksperymentu. Dla protokołu STP o długości 120 sekund (60 sekund PPF + 60 sekund poprzemierzanego) ustaw czas przemiatania na 124 sekundy, aby umożliwić 2 sekundy przed i po bodźcu.
   6. W zakładce Inputs przypisz kanał nagrania do bieżącego wejścia. W zakładce Wyjścia przypisz kanał stymulacyjny do napięcia wyjściowego sterującego elektrodami.
   7. Otwórz zakładkę Waveform . W kolumnie A ustaw Typ na Krok, Pierwszy Poziom na 0 mV, a Pierwszy Czas trwania na 2000 ms, aby zdefiniować punkt bazowy przed stymulacją.
   8. W kolumnie B (PPF) ustaw Typ na Krok. Określ pożądaną amplitudę napięcia (np. +100 mV), czas trwania impulsu (np. 100 ms) oraz Train Rate , aby ustawić inter-pulse inter-inter odpowiadający docelowemu cyklowi obciążenia (np. 90,9%).
   9. W kolumnie C (PPD) podobnie ustaw typ na krok z tą samą amplitudą i czasem trwania impulsu, ale zwiększ Train Rate lub interpulse interinter, aby osiągnąć pożądany niższy cykl pracy (np. 28,6%).
   10. W kolumnie D konfiguruj bazę po stymulacji identyczną z kolumną A (0 mV, 2000 ms).
       UWAGA: Jeśli całkowity czas trwania wszystkich epok w zakładce Waveform przekracza czas przemiatania w zakładce Tryb/Szybkość, nieco wydłż czas przemiatania, aż błąd się rozwinie.
   11. Zapisz protokół z opisową nazwą (np. "STP_120s").
   12. Rozpocznij nagrywanie wideo, a następnie natychmiast rozpocznij akwizycję/stymulację elektryczną, klikając czerwony przycisk "Nagrywaj", aby nagrać dane. Alternatywnie, skonfiguruj cyfrowy wyzwalacz tak, aby początek bodźców jednocześnie wywoływał nagranie wideo i nagranie elektryczne.
   13. Przez pierwsze 60 sekund stymulacji (PPF) zmierzona odpowiedź prądowa zazwyczaj wzrasta od pierwszego impulsu i może osiągnąć widoczny plateau o t = 60 s, podczas gdy przez ostatnie 60 sekund stymulacji (PPD) zmierzona odpowiedź prądowa zazwyczaj maleje (rysunek 5). Po zakończeniu protokołu zatrzymaj jednoczesne nagrania elektryczne i nagrywanie wideo.
2. Eksperymenty z pojedynczym kanałem
   1. Na przednim panelu wzmacniacza patch clamp ustaw przełącznik External Command Input na WYŁĄCZONE. Ustaw napięcie podtrzymujące na +200 mV. Ustaw wbudowany filtr dolnoprzepustowy wzmacniacza na 1 kHz. W oprogramowaniu rejestracyjnym ustaw częstotliwość próbkowania na 10–50 kHz i wybierz ciągły tryb nagrywania "bez przerw".
      UWAGA: Wysokie częstotliwości próbkowania mogą obniżyć stosunek sygnału do szumu w uzyskanych danych. Ważne jest stosowanie wyższych częstotliwości próbkowania przy rozwiązywaniu szybkich przejść bramkowych lub krótkotrwałych stanów migotania. Średnie otwarte czasy życia gramicidyny A zazwyczaj mieścią się w zakresie od 0,1 s do 10 s, podczas gdy stany migotania mogą występować w skalach czasowych poniżej ms i μs; dlatego do uchwycenia takich zdarzeń³⁶ mogą być konieczne częstotliwości próbkowania ~50 kHz. Kolejna analiza idealizacji pojedynczego kanału za pomocą JSMURF pozwala na solidne wykrywanie zdarzeń na nagraniach przy zmiennych stosunkach sygnału do szumu³⁷.
   2. Bez zewnętrznego polecenia rozpocznij rejestrowanie sygnału prądu bazowego. Na wzmacniaczu przełącz polecenie napięcia z OFF na "+", aby przyłożyć napięcie DC +200 mV na DIB.
   3. Rejestruj przez ~15 sekund, aby uchwycić zdarzenia jednokanałowe, ograniczając dryf bazowy. Przy stężeniu molowym lipid:gA 1:5×^10-6 _{zarejestrowany} prąd wydaje się stopniowy ze względu na powstawanie i eliminację zdarzeń przewodności kanału.
   4. Przed przerwaniem nagrywania przełącz komendę Napięcia z "+" z powrotem na WYŁĄCZONE. Zatrzymaj akwizycję danych i zapisz nagranie z opisową nazwą pliku (np. "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      UWAGA: Nagrania jednokanałowe o określonym czasie trwania mogą być również wykonywane poprzez zaprogramowaną stymulację epizodyczną, z ustaloną amplitudą i czasem trwania opisanym w Sekcji 8 dla PPF/PPD. W eksperymentach jednokanałowych "post-PPF" stymulacja epizodyczna z napięciem DC +200 mV jest podłączana bezpośrednio po 60 sekundach PPF.

9. Powierzchnia błony i ekstrapolacja strumienia

1. Na końcu każdego eksperymentu zespołowego (STP, LTP/LTD) powoli przesuwaj jedną elektrodę na boki za pomocą mikromanipulatorów, aby odłączyć DIB.
2. Poluzuj uchwyt elektrody mikromanipulatora i obróć elektrodę w jej utrzymaniu o ~45°, tak aby drut srebrny o średnicy 125 μm leżał w płaszczyźnie obrazowania.
3. Reguluj wysokość elektrody, aż drut będzie ostry pod mikroskopem. Zrób nieruchome zdjęcie lub zrzut ekranu ostrego srebrnego drutu za pomocą oprogramowania aparatu. Zachowaj obraz w skali na późniejszą kalibrację rozmiaru piksela do milimetrów.
4. Przetworzyć zarejestrowane ślady prądu zgodnie z procedurami opisanymi w ref. 28, aby uzyskać ciągłe, wolne od artefaktów dane dotyczące prądu i czasu (rysunek 6A).
5. Określ mapowanie klatka na czas, dzieląc indeksy klatek przez zmierzoną liczbę klatek i dopasowując do znaczników czasu akwizycji.
6. Zaimportuj obraz kalibracji skali i klatki eksperymentu do oprogramowania do analizy obrazów.
7. Użyj znanej średnicy drutu (125 μm) z obrazu kalibracyjnego skali, aby ustawić skalę przestrzenną za pomocą funkcji kalibracji oprogramowania (Analyze > Set Scale).
8. Do obliczeń strumienia dla każdego eksperymentu wybierz N punktów czasowych obejmujących cały okres stymulacji (np. 30 punktów czasowych w 120 sekundach eksperymentu). Upewnij się, że pierwszy punkt czasowy odpowiada pierwszemu impulsowi bodźca.
9. W każdym punkcie czasowym zmierz średnicę DIB, rysując linię na przecięciu krawędzi dwuwarstwowej i zapisując jej długość w skalibrowanych jednostkach.
10. Przelicz każdą zmierzoną średnicę na powierzchnię błony (A), zakładając geometrię kołową lub używając odpowiedniego współczynnika skali geometrycznej elipsy dla konkretnej konfiguracji lipid-olej. Wykorzystaj uzyskane obszary do oceny ewolucji powierzchni błon w czasie dla różnych warunków eksperymentalnych (Rysunek 6B).
11. Dla każdego punktu czasowego podziel odpowiadającą wartość prądu przez powierzchnię, aby uzyskać strumień (I/A). Podziel wszystkie N punktów danych strumienia przez pierwszą wartość strumienia, aby uzyskać strumień znormalizowany do pierwszego impulsu (I/A) / (I₀/_{A 0}), gdy pożądana jest znormalizowana analiza strumienia (Rysunek 6C).
12. Narysuj strumień lub normalizowany strumień względem czasu lub liczby impulsów względem czasu. Powtórz analizę strumienia dla wszystkich eksperymentów zespołowych (STP, LTP/LTD) (rysunek 6D).
13. Interpretuj utrzymujące się podwyższenia strumienia lub normalizowany strumień względem pierwszego impulsu podczas PPD lub po 2 minutach jako zwiększone przewodnictwo, podczas gdy powroty do poziomu wyjściowego lub spadki poniżej wartości pierwszego impulsu wskazują na obniżone przewodnictwo. Wykorzystaj uzyskane skale czasowe do klasyfikacji reakcji jako zachowania przypominające krótkotrwałą plastyczność (<2 min) lub zachowania przypominające potencjację / depresję (> ~5 min).

10. Analiza jednokanałowa

1. Importuj surowe nagrania jednokanałowe do preferowanego środowiska analitycznego lub interfejsu clampSeg i odwołuj się do³⁷ , aby uzyskać pełne opisy i wyjaśnienia funkcji oprogramowania.
2. Zastosuj cyfrowy filtr dolnoprzepustowy odpowiadający eksperymentalnemu filtrowi akwizycyjnemu (np. 1 kHz Bessel).
3. Konfiguracja parametrów.
   1. Ustaw alfa (α) = 0,05, definiując statystyczny poziom ufności tak, że każdy wykryty krok ma <5% prawdopodobieństwo, że jest losową fluktuacją szumową.
   2. Określ 5 000-10 000 iteracji Monte Carlo na segment 1 s, aby oszacować rozkład szumu i zwiększyć statystyczną odporność wykrywania zdarzeń.
      UWAGA: Stosuj równoległe przetwarzanie obliczeniowe o 1 s "chunk", jeśli jest dostępne, aby skrócić czas analizy.
   3. Uruchom algorytm JSMURF na filtrowanym śladzie prądu.
4. Walidacja modelu.
   1. Nałóż idealizowaną (falę prostokątną) ścieżkę przewodności na przefiltrowany ślad prądu i wizualnie potwierdzić, że przejścia krokowe pokrywają się z nagłymi zmianami sygnału eksperymentalnego.
   2. Wykorzystaj znane charakterystyki filtra dolnoprzepustowego do wygenerowania skonvoluowanej rekonstrukcji idealizowanego śladu i nałóż ją na surowy ślad³⁷. Potwierdź, że zrekonstruowany sygnał dokładnie odpowiada obwiedni czasowej i amplitudzie zarejestrowanego prądu.
5. Ilościowa przewodność i czas życia.
   1. Zdefiniuj najniższy stabilny płaskowyż w idealizowanym śladzie jako stan bazy zamkniętej. Zidentyfikować pierwszą niezerową amplitudę płaskowyżu jako pierwotną przewodność otwartego stanu (poziom jednokanałowy).
   2. Klasyfikuj wyższe całkowitoliczbowe wielokrotności tej amplitudy jako wielokanałowe stany otwarte (2+, 3+ itd.). Zidentyfikuj plateauy pośrednie, które są stabilne, ale niższe niż pełne otwarte poziomy jako stany podprzewodnicze.
   3. Wyodrębnij amplitudę i czas trwania każdego zdarzenia z idealizowanego śladu i włącz je do pojemności, aby uzyskać histogramy przewodnictwa, amplitudy i histogramy na cały czas.
6. Histogramy amplitudy i rozkłady w czasie życia
   1. Porównaj idealizowane histogramy przewodności i amplitudy z histogramami amplitudy generowanymi bezpośrednio z filtrowanych danych. Potwierdź, że idealizowane histogramy pokazują ostrzejsze, lepiej rozdzielone piki odpowiadające stanom przewodności dyskretnej³⁷.
   2. Dla każdego warunku eksperymentalnego oblicz funkcję przeżycia N(t)/N(0), gdzie N(0) to całkowita liczba zdarzeń otwartych (pełna i podprzewodzeń), a N(t) to liczba zdarzeń o czasie trwania dłuższym niż t. Wyklucz przedziały stanu zamkniętego z tej analizy.
   3. Rysuj N(t)/N(0) względem czasu i dopasowuj funkcje wykładniczego zaniku za pomocą nieliniowej procedury najmniejszych kwadratów w preferowanym oprogramowaniu.
   4. Interpretuj przesunięcia w prawo w szczytach rozkładu przewodności w histogramach amplitudy jako zwiększoną przewodność, dłuższe stałe czasu zaniku w N(t)/N(0) w porównaniu z wykresami czasowymi jako zwiększoną stabilność stanu otwartego, a rozkłady przesunięcia w lewo jako krótsze żywotności kanału.
      UWAGA: Minimalizuj zakłócenia środowiskowe, takie jak prądy powietrza, drgania i poruszające się obiekty w pobliżu. Unikaj opierania się o stół optyczny i trzymaj rozmowy z dala od eksperymentalnego układu. Trzymaj telefony komórkowe, tablety, laptopy i inne osobiste urządzenia elektroniczne co najmniej 1,5 m od klatki Faradaya, aby ograniczyć zakłócenia elektromagnetyczne. Użyj optycznie przezroczystego zbiornika oleju i zoptymalizuj oświetlenie i kontrast mikroskopem, aby wyostrzyć krawędzie kropelek i dwuwarstw. Pobierz i/lub eksportuj filmy w skali szarości, jeśli poprawia to kontrast brzegów i upraszcza ręczne pomiary średnicy DIB. W przypadku eksperymentów niebadających wpływu temperatury należy zadbać o utrzymanie środowiska laboratoryjnego, podstawki mikroskopowej i oleju w temperaturze 21–22 °C.

Results

Eksperymentalny zestaw DIB
System nagrywania jest umieszczony w klatce Faradaya na stole antywibracyjnym, a dane elektryczne i wideo są pozyskiwane przez dwa oddzielne komputery (rysunek 1A), choć można użyć jednego komputera z możliwością podzielonego ekranu. Środowisko próbki DIB składa się z dwóch elektrod pokrytych agarozą zanurzonych w określonej objętości oleju alkanowego (Rysunek 1B). Rysunek 1C przedstawia schemat kluczowych połączeń elektrycznych i optycznych dla eksperymentalnego układu opisanego w tym manuskrypie.

Rysunek 1: Eksperymentalne przygotowanie.(A) Stół antydrganiowy i obudowa klatki Faradaya z głównymi komponentami, w tym wzmacniaczem, cyfryzatorem, filtrem szumów, generatorami funkcji oraz interfejsem dwukomputerowym do akwizycji elektrycznej i wideo. (B) Widok z góry na środowisko próbki DIB i elektrody. (C) Schemat połączeń elektrycznych i optycznych związanych z eksperymentalnym układem opisanym w tym manuskrypcie. Wszystkie poszczególne elementy mają wspólną podstawę w budynku laboratorium. Wszystkie eksperymenty przeprowadzano w temperaturze pokojowej (21–22 °C). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Przygotowanie i kontrola jakości elektrod Ag/AgCl
Stopienie srebrnego końcówki drutu tworzy kulę kulistyczną (Rysunek 2A); stopione stopy słabej jakości wyglądają podłużnie lub nieregularnie. Chlorowanie w wybielaczu powoduje matową, brązowo-szarą powierzchnię Ag/AgCl (Rysunek 2B). Cienka, jednolita warstwa agarozowa o grubości kilkudziesięciu mikrometrów na kuli jest niezbędna do stabilnego podparcia kropelek i niskoimpedancyjnego sprzężenia elektrochemicznego, podczas gdy nierównomierna powłoka prowadzi do słabego przyczepienia kropelek (rysunek 2C).

Rysunek 2: Przygotowanie elektrod. (A) Mikroskopowe obrazy stopionych elektrod dobrej i niskiej jakości. (B) Porównanie głów elektrod niechlorowanych i chlorowanych. (C) Przykłady powłok agarozowych dobrej i niskiej jakości. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 3: Ustawienie elektrody. (A) Widok górny kąta zamontowanego elektrody. (B) Widok boczny porównania kropelek nieopadających bezpośrednio po załadunku LUV z opadającymi kroplami po formowaniu się monowarstwy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pozycjonowanie elektrod i zachowanie opadania kropli
Widoki z góry pokazują prawidłowe kątowe ustawienie elektrod w celu minimalizacji zniekształceń optycznych (rysunek 3A). Widoki boczne porównują niezwisające (bezpośrednio po załadunku roztworu LUV) oraz opadające, pokryte lipidem kropelki (po 5 minutach) (Rysunek 3B). Opadające krople używane do tworzenia DIB wykazują opóźnioną reakcję fizyczną na ruch z powodu znacznego spadku napięcia powierzchniowego z monowarstw lipidowych, co wizualnie potwierdza powstanie zawieszonej kropli wodnej całkowicie pokrytej monowarstwą lipidową. Po ustaleniu opadnięcia stosuje się stymulację falą trójkątną, aby uzyskać elektryczne potwierdzenie powstawania i stabilności dwuwarstwowej³⁵.

Rysunek 4: Formowanie dwuwarstwy na interfejsie kropelki. (A) Sekwencja poklatkowa pokazująca formowanie się i rozszerzanie dwuwarstwy po kontakcie kropli. (B) Odbicie błony wewnętrznej wykorzystywane do szacowania średnicy i powierzchni dwuwarstwy. Obrazowanie DIB wykonywane jest od spodu urządzenia za pomocą mikroskopu odwróconego. Pasek skali = 50 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Formowanie DIB i pomiar powierzchni
Zdjęcia sekwencyjne rejestrują spontaniczne "zipowanie" i rozszerzanie powierzchni dwuwarstwowe, gdy dwie opadające krople stykają się ze sobą (Rysunek 4A). Jasne, wewnętrzne, owalne odbicia w miejscu kontaktu kropli służą do oszacowania średnicy dwuwarstwy, a co za tym idzie, powierzchni błony w czasie (Rysunek 4B).

Rysunek 5: Protokół STP — stymulacja i odpowiedź. Reprezentatywne reakcje prądowe podczas facilitacji parowanych impulsów (PPF, 0–60 s, czerwony) oraz depresji parowanego impulsu (PPD, 60–120 s, niebieskie) są pokazane (góra), wraz z odpowiadającym protokołem stymulacji (dolny). Impulsy PPF i PPD trwają 100 ms oraz odpowiednio 10 ms i 250 ms, co daje cykle pracy na poziomie 90,9% i 28,6%. Facilitacja odpowiada netto wzrostowi prądu jonowego; Depresja odpowiada spadkom netto. Aktualne odpowiedzi są rejestrowane tylko podczas okresów ON; Dla wizualizacji dane między impulsami są interpolowane, aby podkreślić ogólne trendy prądu. Schematyczne długości czasowe impulsów oraz liczba impulsów w fazach PPF i PPD nie są rysowane w skali i są ilustrowane w celach wizualizacji. Reprezentatywne dane odpowiedzi prądowej pozyskane z Podar PT i in., ²⁵ według CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 The Author(e). Wydane przez PNAS. Schemat stymulacji zmodyfikowany na potrzeby niniejszego rękopisu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół stymulacji elektrycznej w celu wywołania krótkotrwałego zachowania podobnego do plastyczności (podobnego do STP)
Wzorce stymulacji opisane tutaj reprezentują facilitację parowaną pulsu (PPF) oraz depresję (PPD) analogicznie do terminologii neurobiologicznej, podobnie jak Koner i Najem^28,29. Facilitacja impulsów parowanych (PPF; 0–60 s) oraz depresja impulsów parowanych (PPD; 60–120 s) są dostarczane przy użyciu impulsów o długości 100 ms z czasami OFF odpowiednio 10 ms i 250 ms, co odpowiada cyklom pracy 90,9% dla PPF i 28,6% dla PPD. Górny panel pokazuje reprezentatywne reakcje prądowe podczas okresów ON, natomiast dolny panel pokazuje wzór stymulacji.

Prąd, powierzchnia i strumień jonów podczas STP i późniejszej długotrwałej stymulacji
Normalizowany prąd (I/I₀) dla dwuwarstw DPhPC domieszkowanych gA w olejach C16 i C12/C16 jest pokazany podczas PPF i PPD (Rysunek 6A). Znormalizowana powierzchnia błony (A/A₀) mierzona w 30 punktach czasowych pokazuje podobną ewolucję powierzchni w obu warunkach ropy, mimo różnych prądów (rysunek 6B). Dane dotyczące normalizowanego prądu i powierzchni są reprezentowane jako średnie chmury i pasy ± S.D., odpowiednio w 28 niezależnych DIB na każdy stan oleju. Znormalizowany strumin, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀), rozdziela zmiany przewodności niezależne od powierzchni i jest zgodny ze zmianami przewodzenia błonowego wykraczające poza proste rozszerzanie powierzchni (rysunek 6C). Jednak zmiany te mogą odzwierciedlać wpływ zarówno przewodności jednokanałowej, jak i liczby aktywnych kanałów przewodzących. Przedłużona stymulacja PPD trwająca do 30 minut powoduje długotrwałe zachowania podobne do depresji (LTD) w błonach C16, ale utrzymuje podwyższony przepływ zgodny z zachowaniem podobnym do LTP w błonach C12/C16 (Rysunek 6D). Dane te razem pokazują, że skład membran moduluje zarówno krótkoskalowe, jak i długoskalowe zmiany plastyczności przepływu jonowego.

Rysunek 6: Prąd, powierzchnia i obliczony strumień jonów DIB podczas STP i przejścia do LTP/LTD.(A) Normalizowany prąd (I/I₀) podczas PPF (0–60 s, białe tło) i PPD (60–120 s, szare tło) dla membran DPhPC domieszkowanych gA w olejach C16 (pomarańczowy) i C12/C16 (niebieski), przy czym każdy stan składa się z n = 28 niezależnie utworzonych DIB. (B) Znormalizowane obszary błon (A/A₀), mierzone w 30 punktach czasowych, wykazujące porównywalne trajektorie powierzchni mimo różnych odpowiedzi prądowych; dane są przedstawione jako średnia ± S.D. dla tego samego n = 28 niezależnych DIB na stan oleju. (C) Znormalizowany strumin, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), jest obliczany na podstawie odpowiednich pomiarów prądu i powierzchni, podkreślając zmiany przewodności wykraczające poza efekty powierzchniowe. (D) Zachowanie długoterminowe przy przedłużonej stymulacji PPD: po początkowym STP 120 s (szary cień) DIB byli poddawani 30-minutowym PPD z ON = 100 ms i OFF = 250 ms (stały czerwony/zielony) lub 30 s (pomarańczowy/szary) impulsami. Strumień zanika do lub poniżej poziomu bazowego w błonach C16, co wskazuje na zachowanie podobne do LTD, ale pozostaje podwyższony w błonach C12/C16, co wskazuje na utrzymujące się zachowanie podobne do LTP. Obszary cieniowane reprezentują błąd propagowany z I/I₀ i A/A₀. Zestawy danych rozszerzonej PPD w (D) uzyskano z n = 6 niezależnych DIB na stan oleju dla protokołu 120 s, a następnie 3 DIB na każdy stan rozszerzonego PPD. Wszystkie punkty danych są połączone wyłącznie w celach wizualizacji. Panele A, B i D zostały odtworzone pod CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 The Author(e). Wydane przez PNAS. Panel C został nowo utworzony dla obecnego manuskryptu na podstawie danych opublikowanych w Podar PT i in., ²⁵. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywny ślad prądu jednokanałowego 15s z DIB dopowanym gA, utworzonego w oleju C16 po stymulacji PPF
Ślad obejmuje surowy sygnał rejestrowany na 50 kHz za pomocą filtra dolnoprzepustowego 1 kHz, ścieżkę 250 Hz z 8-biegunowym filtrem Bessela oraz idealizowany dopasowanie JSMURF. Najniższy poziom stabilny definiuje stan zamknięty, a wyższe poziomy odpowiadają zdarzeniom jednokanałowym, wielokanałowym oraz podprzewodnictowym. Te ślady stanowią podstawę analizy przewodności, amplitudy i czasu życia. Przykładowy czas zatrzymania w stanie przewodności wskazany oznacza czas trwania określonego poziomu przewodności, którego amplituda i czas trwania odzwierciedlają łączny wkład wielu jednoczesnych zdarzeń pełnej i/lub podprzewodzeń.

Amplituda przewodności i rozkłady w czasie życia
Histogramy amplitudy przewodności dla membran C16 i C12/C16 (rysunek 7A–B) porównują warunki przed i po PPF przy stosunku molowym DPhPC:gA 1:5×^10-6. Przybliżenia Gaussa poniżej danych wskazują przesunięcia szczytów średniej przewodności po PPF i rozstrzygają oddzielne szczyty odpowiadające stanom podprzewodniczym i wielokanałowym. Statystyczne porównania rozkładów przewodności przeprowadzono na danych na poziomie zdarzeń połączonych przy użyciu testu Welcha t-testu oraz testu Mann-Whitney U (α = 0,05), przy czym każdy warunek składał się z 3 niezależnych nagrań DIB, a N dla danego stanu przewodności oznaczało łączną liczbę wykrytych zdarzeń połączonych w tych nagraniach. Rozkłady prawdopodobieństwa w czasie życia, N(t)/N(0), przed i po (Rysunek 7C–D) pokazują, że błony C12/C16 rozwijają rozkłady przewodności o dłuższym ogonie i zmieniają czas życia względem C16, co wskazuje na zmiany stabilności kanału. Dane z histogramu są reprezentatywne dla filtrowanego śladu 15 s (czerwonego śladu) uzyskanego dla każdego stanu. Rozkłady stanu przewodności w czasie życia były generowane z 3 niezależnych nagrań DIB na każdy stan; krzywe przerywane oznaczają pojedyncze replikaty, a krzywe bryły oznaczają globalne dopasowania wykładnicze do N(t) / N(0) względem t.

Rysunek 7: Histogramy amplitudy przewodności oraz rozkłady czasu przebywania w stanie przewodności. Histogramy amplitudy przewodności dla aktywności gA w błonach (A) C16 i (B) C12/C16 porównują warunki przed PPF (szare) i po PPF (pomarańczowo/niebieskie) przy 5 × 10-6 gA:lipidowy stosunek molowy. Przybliżenia gaussa pod histogramami wskazują na przesunięcia szczytów średniej przewodności i odchyleń standardowych dla stanów jedno- i wielokanałowych. Zmiany średniej przewodności po PPF są oznaczane przerywanymi liniami (= przed PPF; niebieski/pomarańczowy = po PPF) oraz strzałkami. Każdy warunek to 3 niezależne nagrania DIB. Statystyczne porównania rozkładów przewodności przeprowadzono na danych na poziomie zdarzenia połączonych z wykorzystaniem testu Welcha t-test oraz testu U Manna-Whitneya (α = 0,05), gdzie N dla danego stanu przewodności oznacza łączną liczbę wykrytych zdarzeń zsumowanych na tych trzech nagraniach. W analizie uwzględniono również zdarzenia podprzewodni, z reprezentatywnymi rozkładami podprzewodnictwa zaznaczonymi po lewej stronie pierwszego piku stanu otwartego dla każdego stanu membranowego. Rozkłady prawdopodobieństwa zdarzeń stanu przewodności w ciągu życia w błonach C16 (C) i C12/C16 (D) przed (pomarańczowa / niebieska) oraz po stymulacji PPF (ciemnopomarańczowa / ciemnoniebieska) przy 5×10-6 M gA:lipid odpowiadają analizom przewodności pokazanym na Rysunku 7A–B. Tutaj N(t) oznacza skumulowaną liczbę zdarzeń pełnej i podprzewodnościowej o czasie dłuższym niż czas t. Przerywane linie oznaczają rozkłady żywotności z pojedynczych replikacji (n = 3 niezależne DIB na warunki), a solidne wstawki pokazują globalne dopasowania wykładnicze wykonywane za pomocą oprogramowania do nieliniowego dopasowania krzywych. Panele A–D zostały odtworzone z Podara PT i in., ²⁵ i opracowane na potrzeby niniejszego rękopisu pod CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 The Author(e). Wydane przez PNAS. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 8: Badanie zachowania jednokanałowego — ślad prądu odpowiedzi dla DIB w C16 po stymulacji PPF. (A) Przykład śladu prądu 15 s pokazujący surowe dane (niebieskie), filtrowane przez 250 Hz 8-biegunowy dolnoprzepustowy filtr Bessela (czerwony) oraz idealizowany ślad (zielony) używany do identyfikacji stanów przewodności. Najniższy stabilny poziom definiuje bazowy stan "zamknięty". (B) Reprezentatywne poziomy podprzewodności wykryte pomiędzy drugim^a trzecim poziomem^pełnej przewodności, potwierdzone przez wyraźne piki pośrednie w histogramie amplitudy (patrz Rysunek 7A, pomarańczowy). Czasy przetrzymywania przewodności są wyodrębniane z czasu trwania każdego zidentyfikowanego poziomu przewodności (z wyłączeniem stanu zamkniętego), aby wygenerować rozkłady N(t)/N(0) w czasie życia. Powtórzono z Podar PT i in., ^{25 pod} CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 The Author(e). Opublikowane przez PNAS. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po PPF membrany C12/C16 wykazują wyraźne przesunięcie w prawo w rozkładzie amplitudy przewodności, co wskazuje na zwiększone przewodnictwo jednokanałowe, któremu towarzyszy przesunięcie rozkładów żywotności stanów przewodności w lewo, zgodne z krótszymi czasami otwarcia kanału. Zmiany te są zgodne z elektromechanicznym przerzedzeniem dwuwarstwy C12/C16 podczas PPF, co potwierdzają bezpośrednie pomiary mechaniczne i grubości opisane w ref. 25, co obniża barierę energetyczną transportu jonów przez gA i zwiększa przepływ jonów na otwarcie, jednocześnie obniżając stabilność kanału. Natomiast błony C16 wykazują minimalne zmiany w obu rozmieszczeniach, co podkreśla ich ograniczoną zdolność strukturalną. Wyniki te pokazują, że platforma DIB rejestruje zarówno korelaty zespołowe, jak i jednokanałowe korelaty adaptacji elektromechanicznej membrany, w tym zmiany przewodzenia jonowego podobne do STP i LTP/LTD, wynikające z dynamiki zależnej od składu membrany (rysunek 8).

Discussion

W praktyce metoda ta zapewnia trzy kluczowe możliwości eksperymentalne: kontrolowaną zmienność składu dwuwarstwowego poprzez skład lipidów i fazę olejową, jednoczesny optyczny i elektryczny monitoring restrukturyzacji membran oraz dostęp do reżimu powierzchni błon, który łączy elektrofizjologię jednokanałową i mezoskalową mechanikę membran 14,15,20,21,25. Te cechy sprawiają, że metoda ta jest szczególnie przydatna do badań struktury i funkcji w uproszczonych systemach membran, gdzie eksperymentalna perspektywa jest interesująca raczej elektromechanika membran niż pełna złożoność komórkowa 14,15,20,21,25,39.

Protokół ten opisuje montaż i analizę DIB domieszkowanych gramicydyną A w olejkach alkanowych w celu zbadania zdolności błon lipidowych do restrukturyzacji pod fizjologicznie istotną stymulacją elektryczną 14,15,25,35,38. W porównaniu z technikami patch^{clamp 21}, platforma DIB bada łaty membranowe o rzędy wielkości większe, zachowując jednocześnie wystarczającą rozdzielczość do rejestrowania dyskretnych zdarzeń kanałowych jonów 14,15,19,20,21,28,38. Ta zdolność jest szczególnie cenna do rozwiązywania mezoskalowych remodelacji elektromechanicznych (np. jako elektrozwilżanie i elektrokompresja) oraz powiązania jej z mikroskopijnym zachowaniem kanałów, które łącznie prowadzą do fenotypów przewodności membranowej podobnej do STP, LTP i LTD pod wpływem stymulacji fizjologicznej 13,25,27,38 . Obecny system DIB nie ma na celu odtworzenia złożoności molekularnej synaps^{biologicznych} 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . W związku z tym terminy takie jak STP, LTP, LTD, PPF i PPD są używane w sensie opisowym, opartym na analogii do oznaczania krótko- i długich wzrostów i spadków przewodzenia jonów przez błonę zgodnie z określonymi protokołami stymulacji. Główne ustalenia tej pracy są więc najbardziej bezpośrednio interpretowane w kontekście elektromechaniki błon, adaptacji przewodności oraz restrukturyzacji nierównowagi zależnej od składu w DIB, co może oferować użyteczne analogie koncepcyjne i perspektywy fizyczne na plastyczność synaptyczną, nie sugerując mechanistycznej równoważności z obwodami neuronalnymi lub biochemiczną regulacją synaptyczną 10,11,25,38.

Kilka kroków technicznych jest kluczowych dla uzyskania powtarzalnych wyników. Staranne przygotowanie elektrody Ag/AgCl, w tym równomierne stopienie srebrnej kulistej końcówki, dokładne chlorowanie oraz cienka, równomierna warstwa agarozowa, zapewnia stabilne przyczepienie kropel i niskoimpedancyjne sprzężenie elektrochemiczne^20,35. Wizualne potwierdzenie opadnięcia kropli i prawidłowego ustawienia elektrody minimalizuje zniekształcenia optyczne podczas nagrywania wideo i poprawia dokładność pomiarów powierzchni błon. Kalibracja skali po akwizycji z użyciem znanej średnicy drutu srebrnego zapewnia solidną konwersję piksel na mm, co jest niezbędne do niezawodnego obliczania powierzchni błony i strumienia jonów. W niniejszej pracy przewodność membrany (strumień) definiowana jest jako prąd na jednostkę powierzchni (I/A), a ponieważ powierzchnia DIB zmienia się podczas elektromokowania, dokładna ilościowa pomiar strumienia wymaga dopasowanych pomiarów prądu i powierzchni dwuwarstwowych 13,25,27,35.

To podejście obsługuje również komplementarne odczyty na poziomie zespołu i pojedynczym kanałem na tej samej platformie: 14,15,20,25,35,38. Na poziomie zespołu synchronizowane nagrania wideo i elektryczne ilościowo określają dynamiczne zmiany powierzchni (zwilżanie elektroelektromagnetyczne) i prądu, z których pochodzi strumień jonowy (prąd/powierzchnia). Pod wpływem stymulacji elektrycznej membrany są wprowadzane w stany ustalone poza równowagą (NESS), gdzie restrukturyzacja membran zależna od składu generuje krótkoskalowe reakcje podobne do plastyczności, które mogą ewoluować w zachowania podobne do potencjacji lub depresji w dłuższych czasach (min)25,26,28,29,30,31, 32,33,38. Na poziomie jednokanałowym analiza polega na idealizacji śladów prądu na poziomy przewodności stopniowej (stany zamknięte, jednokanałowe, wielokanałowe i podprzewodnicze). Tradycyjne narzędzia idealizacji fal prostokątnych zazwyczaj rozwiązują tylko ograniczoną liczbę dyskretnych poziomów; dla bardziej złożonych lub szumowych danych preferowane są metody idealizacji bezmodelowej, takie jak JSMURF³⁷. Krótkie potencjały utrzymania prądu stałego analizowane za pomocą JSMURF zapewniają statystycznie rygorystyczne wykrywanie zdarzeń przy niejednorodnym szumie, dając histogramy przewodności-amplitudy (poziomy całkowite i podprzewodnicze) oraz rozkłady życia N(t)/N(0). Nałożenie idealizowanych i filtrowanych histogramów amplitudy umożliwia wizualną i ilościową walidację przypisań stanów przewodności, podczas gdy rekonstrukcje skonwolowane (idealizowane ślady przechodzące przez znany filtr dolnoprzepustowy) potwierdzają wybór parametrów i wierność zdarzeń³⁷.

Skład membrany, dostrojony tutaj przez otaczającą fazę ropy (np. C16 vs C12/C16), ma modulować lepkoelastyczność dwuwarstwową i zdolność restrukturyzacji pod wpływem stymulacji elektrycznej, zgodnie z bezpośrednimi pomiarami przedstawionymi w poprzednich badaniach 22,25,39. Oczekuje się, że bardziej elastyczne membrany wykazują większe przerzedzenie sterowane przez EC oraz lepsze dopasowanie hydrofobowe z gA podczas PPF 22,23,25, co prowadzi do zwiększenia przewodności jednokanałowej i ułatwiania, które mogą stabilizować się jako zachowanie podobne do LTP ^25,38. Natomiast sztywniejsze błony wykazują ograniczoną reakcję strukturalną, mniejsze zmiany przewodności podczas PPF i PPD oraz tendencję do LTD przy długotrwałym pulsowaniu. Te zależne od składu wyniki podkreślają, jak właściwości materiału predysponują błony do odrębnych, funkcjonalnie istotnych długoterminowych reżimów 22,23,25,39.

Platforma DIB ma również istotne ograniczenia²¹. Przedstawiona tu mechanistyczna interpretacja zakłada, że różnice w składzie oleju wpływają na właściwości materiału dwuwarstwowego oraz podatność na przebudowę elektromechaniczną, co z kolei moduluje przewodnictwo gramycydyny A 22,23,25. Tę interpretację potwierdzają wcześniejsze badania, które bezpośrednio mierzyły lepkoelastyczność błon, napięcie międzypowierzchniowe, a także dynamiczne zmiany grubości błony w tych warunkach i stymulację²². W niniejszej pracy jednak właściwości tych materiałów nie były mierzone jednocześnie w każdym eksperymencie i dlatego są wykorzystywane tutaj do wspierania różnych reakcji strukturalnych i mechanicznych na stymulację elektryczną membran w środowiskach C16 i C12/C16, zamiast samodzielnie ustanawiać mechanistyczną interpretację danych. Ponadto prąd i strumień zespołu mogą odzwierciedlać zarówno zmiany przewodności pojedynczego kanału, jak i zmiany liczby przewodzących kanałów, które mogą się różnić w zależności od powierzchni błony, dyfuzji peptydów i dimeryzacji w warunkach nierównowagowych 17,18,22,23. Otaczająca faza olejowa może również dynamicznie przenikać lub cofać się od rdzenia dwuwarstwowego podczas stymulacji, przyczyniając się do dryfu bazowego w nagraniach jednokanałowych oraz stopniowych zmian składu błony w czasie 13,21,25. Razem te czynniki ograniczają użycie długotrwałych nagrań stałego napięcia do definiowania właściwości membran statycznych i podkreślają, że DIB zachowują się jak systemy otwarte, dynamiczne, a nie zamknięte membrany równowagi 13,21,25. Tak więc, choć obecny protokół rejestruje zmiany przewodzenia zależne od stymulacji, podobne do plastyczności, w zamierzonych skalach czasowych eksperymentów^25,38, przyszłe badania łączące bezpośrednie pomiary mechaniczne z jednoczesnymi rejestracjami elektrycznymi i optycznymi, potencjalnie w połączeniu z obrazowaniem pojedyncząsteczkowym opartym na fluorescencji, będą potrzebne do pełniejszego rozróżnienia odpowiednich wkładów restrukturyzacji membrany, przewodności kanałowej i kanału populacja ^21,25.

Typowe tryby awarii to niestabilne przyczepanie kropel, niepełne opadanie kropelki, przedwczesne zgrupowanie się kropelek podczas tworzenia dwuwarstwy oraz słaba definicja optyczna krawędzi dwuwarstwowej podczas analizy powierzchniowej. Niestabilne przyczepianie kropelki często jest spowodowane nieregularną geometrią srebrnej kulki lub nierówną powłoką agarozową i można je zredukować poprzez weryfikację symetrii kuli i utrzymanie gładkiej powłoki agarozowej. Załadowanie elektrody wymaga również ręcznego osadzania nanolitrowych kropelek wodnych na głowicę elektrody submilimetrowej, co wymaga znacznej koordynacji ręka-oko oraz percepcji głębi w różnych ośrodkach o różnych współczynnikach załamania światła (powietrze vs olej). W rezultacie końcówka pipety może przypadkowo stykać się z agarozową powłoką lub nie trafić w głowicę elektrody podczas wydawania. Techniki poprawiające stabilność, takie jak ortezy nadgarstkowe, powolne przesuwanie pipety w oleju i wstrzymanie oddechu, wraz z powtarzalną praktyką, mogą poprawić biegłość w ładowaniu. Ponadto niepełne opadanie lub opóźnione tworzenie monowarstwy może być spowodowane heterogenicznością pęcherzyków, zmianami temperatury lub topografią agarozową i może być poprawione przez wydłużenie czasu oczekiwania po osadzaniu kropelek 15,20,35. Koalescencja podczas tworzenia dwuwarstwy często wiąże się z nadmierną powierzchnią kontaktu lub nadmiernie agresywną stymulacją elektryczną (> ± 200 mV) i można ją złagodzić, stosując mniejsze początkowe powierzchnie kontaktu kropel, co pozwala na dodatkowy czas na stabilizację monowarstwy oraz weryfikację odpowiedzi pojemności fali trójkątnej o niskiej amplitudzie przed impulsowaniem^{25, 35, 38}.

Pomimo tych ograniczeń, platforma DIB jest wysoce strojalna, skalowalna i powtarzalna 14,15,20,21,25,35,38,40, a także uzupełnia elektrofizjologię skoncentrowaną na białkach, izolując wkład mechaniki lipidów w przewodnictwo ^{22,23, 25}. Poprzez ujednolicenie pomiarów zespołowych i jednokanałowych w jednym systemie, protokół ten zapewnia praktyczną drogę do analizy, jak praca elektryczna i lepkoelastyczność membran łączą się, tworząc synaptyczne przewodzenie podobne do synaptycznych zachowań (odpowiedzi podobne do STP, LTP i LTD) w kontrolowanym, oddolnym modelu 25,29,30,31,32,33,38. W związku z tym metodologia ta stanowi podstawę do systematycznego badania reguł uczenia się zależnych od składu w membranach oraz do ilościowego określenia, jak siły mechaniczne i elektryczne sprzyjają białka błon z ich dwuwarstwą gospodarza na skalach czasowych i przestrzennych 21,22,23,25 . Łącznie te możliwości pozycjonują DIB jako potężne ramy do dekonstrukcji złożonych zachowań neurobiologicznych na wykonalne, testowalne mechanizmy biofizyczne 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-difitanoj-sn-glicero-3-fosfocholina (DPhPC)	Awantyczne lipidy polarne	850356P/850356C	Kupowany jako liofilizowany proszek (P) lub w chloroformie (C)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agaroza (tabletki agarozy 0,5g)	Benchmark	A2501	Możesz użyć zarówno proszku, jak i tabletek, & nbsp;
Agilent Technologies 33522A generator przebiegów i przebiegów;	Keysight	–	Możesz użyć dowolnego generatora przebiegu z wyjściami kabla BNC
Gaz argon (Ar)	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argon skompresowany; Ultra Wysoka Czystość
Analityczna waga	Mettler Toledo	Model: MS304S/03	Każda laboratoryjna waga analityczna o precyzji 0,0001 g
Wzmacniacz Axopatch 200B	Urządzenia molekularne	–
Generator przeszukiwania/funkcji DD BK Precision 4017B 10 MHz	Digi-Key	BK4017B-ND
Naczynia włosowate ze szkła borokrzemowego	Światowe Precyzyjne Instrumenty	1B100F-4
Pakiet oprogramowania Clampex pCLAMP 11	Urządzenia molekularne	–
System DigiData 1550B	Urządzenia molekularne	–	Obejmuje to mini-ekstruder, 2 strzykawki, 100 membran PC, 100 wsporników filtrów oraz 1 uchwyt/blok grzewczy
Dodekan, 99%	Sigma-Aldrich	112-40-3
Zestaw ekstrudera z uchwytem/blokiem grzewczym	Awantyczne lipidy polarne	610000
Oprogramowanie Fiji	ImageJ	–
Zamrażarka (-80 stopni; C)	Fisher Scientific	Isotemp; Model: 8964; S/N: 828278-21
Szkło	VWR International	–
Gramicidyna-A	Millipore Sigma	368020
Heksadekan, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Eliminator szumu pluskowego (60Hz)	Systemy A-M	726300
System mikroskopu odwróconego (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Można użyć dowolnego mikroskopu odwróconego lub pionowego
Alkohol izopropylowy	VWR International	BDH1133-4LP
Uchwyt mikroelektrod	Światowe Precyzyjne Instrumenty	MEH1S
Mikromanipulatory	Sutter Instrument	MP-285	Można używać manipulatorów ręcznych
Kamera mikroskopowa	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Oprogramowanie kamery mikroskopowej NIS-Elements	Nikon	–	Można używać oprogramowania do przechwytywania kamery z możliwością podglądu na żywo i/lub wideo. Nagrywanie ekranu na żywo i jednoczesne może być używane jako zamiennik za przechwytywanie wideo.
Parafilm M Uniwersalny Film Laboratoryjny	Parafilm	PM999
Szalka Petriego	-	-	Naczynie musi być przezroczyste na dole, a najlepiej także na ściance bocznej
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Rękawice do badania z miękkim nitrylem bez pudru i	VWR International	CA89-38-272
Chłodnica (4 i stopnie; C)	Fisher Scientific	Numer KATA: 97-938-1; Numer modelu: 3556FS
Srebrny drut	GoodFellow	147-346-94
Mieszanie gorącej płyty	Thermo Scientific	SP131325