Opisujemy metodę izolowania pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus laevis i sortowania ich według wielkości komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolowanie pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus i sortowanie ich według rozmiaru
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wczesna embrigeneza wymaga wykładniczego zmniejszenia rozmiaru komórek, podczas gdy zarodek pozostaje stały pod względem wielkości na najwcześniejszych etapach rozwoju. Funkcjonalne znaczenie oraz mechanizmy, dzięki którym wielkość komórek wpływa na rozwój zarodka, są wciąż w dużej mierze niedostatecznie zbadane. Wczesny zarodek Xenopusa zapewnia unikalny system do wypełniania tych poważnych luk. W porównaniu z innymi organizmami modelowymi, wczesny zarodek Xenopus jest niezwykle duży i zawiera gradient wielkości komórek, od małych komórek na biegunie zwierzęcym do dużych komórek na biegunie roślinnym, na całym zarodku na etapach przejścia środkowego blastuli. Tutaj opisujemy protokół dysocjacji pojedynczych komórek od wczesnych zarodków Xenopus i sortowania ich według rozmiaru za pomocą sitek komórkowych o różnych rozmiarach porów siatkowych. Według pomiarów obrazowania i rozmiaru, posortowane komórki mieszczą się w oczekiwanym zakresie rozmiarów i mogą być używane do analizy lub sekwencjonowania komórek żywych, albo stałe do obrazowania. System ten rzuci nowe światło na ujawnienie mechanizmów regulacyjnych zależnych od wielkości podczas wczesnego rozwoju.
Wprowadzenie
Zmiana rozmiaru komórek jest częstą cechą wczesnej embriogenezy, gdy zapłodnione komórki jajowe przechodzą wielokrotne rundy rozszczepienia, generując coraz większą liczbę komórek. Chociaż wiele wiadomo o roli rozmiaru komórek jako głównego parametru sterującego funkcjami komórkowymi 1,2,3, to jednak wpływ rozmiaru komórek na wczesny rozwój jest mniej znany. Najnowsze badania dotyczące różnych modelowych systemów embrionalnych sugerują, że rozmiar komórek reguluje aktywację genomu zygotycznego (ZGA)4 oraz specyfikację losu komórki5, co wspiera istotną rolę rozmiaru komórek w decyzjach rozwojowych 6,7.
Wczesny embrion Xenopusa jest ważnym modelem do badania decyzji rozwojowych regulowanych przez wielkość komórek. Ponieważ wczesny zarodek Xenopusa jest duży (~1,2 mm średnicy), łatwo jest fizycznie zmieniać jego rozmiar, co czyni go przydatnym do oceny bezpośrednich konsekwencji zmiany wielkości komórek. Na przykład miniaturowe zarodki o różnych rozmiarach mogą być generowane przez zwężenie zarodków jednokomórkowych za pomocą pętli włosowych 4,8, co wykazuje zależność od dawki ZGA4. Ponadto wczesny embrion Xenopus zawiera gradient wielkości komórek wzdłuż osi zwierzęcej-roślinny, z najmniejszymi komórkami na biegunie zwierzęcym i największymi na biegunie roślinnym, co świadczy o ponad 100-krotnej różnicy objętości4. Co ważne, poprzez bezpośrednie wizualizowanie i ilościowe określenie początkujących transkryptów w pojedynczych komórkach zarodków pełnego zarodku, zidentyfikowaliśmy próg wielkości komórki, który reguluje ZGA4. Ponadto izolacja pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus i ich sortowanie według rozmiaru potwierdziły znaczenie progu wielkości komórek ZGA4.
Tutaj opisujemy szczegółowe procedury izolowania pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus laevis oraz ich sortowania według rozmiaru. Wczesne zarodki Xenopus mogą być dysocjowane na pojedyncze komórki poprzez inkubację w Ca2+, ośrodku wolnym od Mg2+ (CMFM)9, a te pojedyncze komórki można dalej sortować za pomocą sitek komórkowych o różnych rozmiarach porów siatkowych. Posortowane komórki mogą być oczyszczane i wykorzystywane w różnych zastosowaniach, w tym analizie żywych komórek, sekwencjonowaniu czy testach obrazowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisane tutaj prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Południowej.
1. Przygotowanie roztworu
UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu przygotuj następujące rozwiązania.
- Przygotuj 20× MMR: Wymieszaj 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 oraz 40 mM CaCl2. Ustaw pH do 7,8 z NaOH. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj Ca2+, Mg2+-free medium (CMFM): Wymieszaj 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM KH2PO4, 2,4 mM NaHCO3 oraz 1,0 mM EDTA. Jeśli trzeba, dostosuj pH do 7,4. Zautoklawuj i przechowuj w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj żel agarozowy o pojemności 1,5% w szalce Petriego o średnicy 60 mm: Dodaj 0,75 g agarozy do 50 ml CMFM. Podgrzej agarozę, aby rozpuścić ją w mikrofalówce. Dodaj 5-10 ml żelu agarozowego, aby pokryć cienką warstwę w szalce Petriego o średnicy 60 mm.
- Przygotuj medium gradientowe 15% gęstości (masa/objętość)/CMFM: Powoli dodawaj 15 g medium gradientu gęstości do 100 mL CMFM. Aby ułatwić rozpuszczanie, podgrzej i mieszaj na płytce, aż medium gradientu gęstości całkowicie się rozpuści. Utrzymuj roztwór w temperaturze 4 °C do użycia.
- Przygotuj 4% PFA/1× MEM: Wymieszaj 1 fiolkę (10 mL) 16% paradehydu i 4 mL 10× MEM (1000 mM MOPS pH 7,4, 20 mM EGTA i 10 mM MgSO4). Dodaj ultraczystą wodę do 40 mL.
UWAGA: Aby uzyskać zarodki Xenopus , należy stosować standardowy protokół przeprowadzania zapłodnienia in vitro (IVF) (na przykład zob. Sive i in., 2007)10. Zarodek powinien być gotowy do użycia w zakresie 0,1× MMR.
2. Rozdzielanie wczesnych zarodków na pojedyncze komórki
- Dodaj ~15 ml CMFM do nowej 60-mm szalki Petriego pokrytej żelem agarozowym o średnicy 1,5%. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść 10-100 zarodków (w zależności od potrzeb eksperymentalnych) do naczynia. Poddaj talerz stereomikroskopowi.
- Użyj pęsety w obu rękach, aby ostrożnie usunąć błonę witellinową, chwytając ją na powierzchni zarodków jedną pęsetą i odklejając drugą. Unikaj uszkodzenia zarodków podczas procesu.
- Inkubuj devitelline zarodki w CMFM przez ~1 godzinę w temperaturze pokojowej. Potrząsaj miseczką bardzo delikatnie co 5 minut, aby ułatwić dysocjację komórek. Regularnie sprawdzaj, aż nie zobaczysz żadnych stosów blastomerów (Rysunek 1).
3. Sortowanie komórek dysocjowanych według rozmiaru
- Podczas dysocjacji blastomerów zanurz barwniki komórkowe (40 μm, 70 μm i 100 μm) w pojedynczych szalkach Petriego wypełnionych CMFM (Rysunek 2). Ułóż dania w kolejności od lewej do prawej, zgodnie z wskazaniem. Dodaj także dwie dodatkowe misy wypełnione CMFM między grupami do krótkiego mycia barwników komórkowych podczas każdego sortowania.
- Delikatnie mieszaj naczynie zawierające poszczególne blastomery, aby wzbogacić je w centrum dania. Ostrożnie przenieś blastomery do barwnika 40 μm w CMFM.
- Delikatnie potrząśnij sitkiem kilka razy, aby blastomery < 40 μm się ustabilizowały. Następnie szybko przenieś sitko 40 μm do naczynia wypełnionego CMFM na krótkie umycie. Ostrożnie przenieś blastomery w sicie 40 μm, które są > 40 μm, do sita 70 μm.
- Powtarzaj kroki, aż blastomery zostaną uporządkowane w sicie 100 μm.
- Delikatnie mieszaj każde danie z uporządkowanymi blastomerami, aby wzbogacić je w centrum dania. Ostrożnie przenieś blastomery (~4 mL) na wierzch 0,5 mL ośrodka gradientowego o gęstości 15% w rurce aktywowanej fluorescencją (FACS) (Rysunek 3). Unikaj mieszania.
- Zostaw tubkę na 10 minut. Nienaruszone blastomery opadają na dno pod wpływem grawitacji, oddzielając się od kulek żółtka od pękniętych blastomerów podczas sortowania i transferu (Rysunek 3).
- W zależności od celu dalszych eksperymentów, należy przeprowadzić analizę żywych komórek, zamrozić blastomery w ciekłym azocie do pracy z RNA lub ustalić blastomery do immunobarwienia (Rysunek 3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zarodki Xenopus laevis (n = 50) na etapie 9 były inkubowane w ośrodku CMFM, aby rozłożyć się na pojedyncze blastomery zgodnie z tym protokołem (patrz przykład na Rysunku 1). Dysocjowane pojedyncze blastomery zostały posortowane sekwencyjnie za pomocą filtrów komórkowych 40 μm, 70 μm i 100 μm, jak opisano powyżej. Niesortowana mieszanka kontrolna oraz pojedyncze blastomery zostały utrwalone w 4% paraformaldehydu i obrazowane pod mikroskopem jasnego pola (rysunek ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozmiar komórek jest fundamentalnie ważny dla funkcji komórkowych3, a jego wpływ na wczesny rozwój wymaga większej analizy w modelowych systemach embrionalnych. Tutaj opisaliśmy szczegóły izolowania pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus laevis oraz sortowania komórek według rozmiaru za pomocą sitników komórkowych, co może być przydatne w badaniach rozmiaru komórek. Ta metoda pozwoliła nam dostarczyć bezpośrednich dowodów na aktywację genów zygotycznych regulowaną wielkością we...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor deklaruje brak konkurencyjnych interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować laboratorium Matthew Gooda na Uniwersytecie Pensylwanii za szkolenie. Prace te były częściowo wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 16% paraformaldehydu (PFA) | EMS | 15710-S | Do przygotowania roztworu utrwalacza |
| Jednorazowe szalki Petriego 60 mm | VWR | 25384-092 | Do inkubujących się zarodków |
| Stereomikroskopy ACCU-SCOPE 3075 Zoom | VWR | 470351-130 | Do wizualizacji zarodków |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9414 | Do powlekania szalek Petriego |
| Sietko komórkowe, 100 & mikro; m | VWR | 76327-102 | Do sortowania komórek według rozmiaru |
| Ceder komórkowy, 40 & mikro; m | VWR | 76327-098 | Do sortowania komórek według rozmiaru |
| Sietko komórkowe, 70 & mikro; m | VWR | 76327-100 | Do sortowania komórek według rozmiaru |
| Jednorazowe pipety transferowe | VWR | 414004-035 | Do transferu zarodków |
| Pinceta Dumont, styl 5 | Nauki o mikroskopii elektronowej | 72701-D | Do usuwania błony vitelline |
| Szklana szalka Petriego, 60 & razy; 15 mm | VWR | 75845-542 | Do inkubujących się zarodków |
Bibliografia
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
- Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
- Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
- Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
- Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
- Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
- Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
- Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
- Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
