Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół służący do szybkiego identyfikowania i genotypowania szczepów Toxoplasma gondii za pomocą przenośnego sekwencjonowania nanoporami wybranych markerów genetycznych, umożliwiając skalowalną, ukierunkowaną identyfikację szczepów w izolatów hodowanych w laboratorium z potencjalnym przyszłym zastosowaniem w ustawieniach nadzorczych.

Streszczenie

Toxoplasma gondii to pasożytniczy pierwotniak rozprzestrzeniony na całym świecie, charakteryzujący się znaczną różnorodnością genetyczną, co wymaga dokładnych metod molekularnych w celu rozróżnienia szczepów. Celem tego protokołu jest ustanowienie reproduktybilnego przepływu pracy dla ukierunkowanej wielolokacyjnej genotypizacji hodowli izolacji T. gondii. Procedura obejmuje in vitro propagację reprezentatywnych szczepów typu I (RH) i typu II (ME49), ekstrakcję DNA genomowego, lokus-specyficzną amplifikację genów SAG2 i SAG3 oraz analizy oparte na sekwencjonowaniu w celu wykrycia polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) i zdarzeń wstawiania/delecji (INDEL). Dane sekwencjonowania są przetwarzane w celu wygenerowania konsensusowych sekwencji o wysokiej pewności oraz przeprowadzenia porównawczej alinacji w celu identyfikacji polimorfizmów specyficznych dla szczepu. Zastosowanie tego przepływu pracy do archetypowych szczepów wykazało wysoką efektywność mapowania, jednolitą głębokość odczytów na całym obszarze docelowych lokusa oraz dokładne odzyskiwanie oczekiwanych rozmiarów amplikonów, potwierdzając wiarygodne wykrywanie różnorodności genetycznej na poziomie lokusa. Chociaż pełne przypisywanie genotypu wymaga włączenia dodatkowych standaryzowanych markerów, ten protokół zapewnia skalowalny i reproduktybilny rama dla ukierunkowanej charakteryzacji genetycznej izolacji T. gondii utrzymywanych w laboratorium i wspiera spójną wielolokacyjną analizę sekwencji.

Wprowadzenie

Toxoplasma gondii to globalnie rozpowszechniony pasożyt z grupy apikompleksów i główne ryzyko zoonozy przenoszonej przez żywność i wodę, zdolny do infekcji praktycznie wszystkich ciepłokrwistych zwierząt, przy czym kotowate pełnią rolę ostatecznych gospodarzy¹. Zakażenie u ludzi i zwierząt najczęściej następuje poprzez połknięcie cyst tkankowych lub oocyst sporulowanych, a zdolność pasożyta do przechodzenia między etapami tachyzoitu i bradyzoitu umożliwia długotrwałą persystencję w tkankach nerwowych i mięśniowych, przyczyniając się zarówno do przenoszenia przez mięso, jak i do transmisji środowiskowej^2,3.

Chociaż trzy klonalne linie (Typy I, II i III) dominują w Europie i Ameryce Północnej, rozległa zmienność genetyczna, w tym atypowe i rekombinowane szczepy, została udokumentowana na całym świecie, szczególnie w regionach o bogatym zbiorniku dzikich zwierząt⁴. Dokładna dyskryminacja szczepów jest zatem niezbędna do wyjaśnienia dynamiki transmisji, badania wybuchów chorób i zrozumienia epidemiologii regionalnej. Tradycyjne podejścia do genotypowania, takie jak PCR-RFLP, oparta na Sangerze wielolokusowa typizacja sekwencji (MLST) i analiza mikrosatelitarów, znacząco przyczyniły się do zrozumienia struktury populacji T. gondii, ale są ograniczone pod względem rozdzielczości, przepustowości i zdolności do wykrywania wewnątrzgenotypowych zmian. Te podejścia często wymagają wielu oddzielnych reakcji i mogą nie wykrywać insercji, delecji lub złożonych haplotypów w obrębie polimorficznych locus¹. Krótkoczytowe sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) poprawiło wykrywanie rzadkich wariantów, ale nadal ogranicza się w identyfikacji złożonych zmian strukturalnych⁴.

Platformy sekwencjonowania długich odczytów, zwłaszcza Oxford Nanopore Technologies, oferują teraz możliwość generowania ciągłych odczytów o wysokiej dokładności, nadających się do rozdzielania wariantów strukturalnych i wysoce polimorficznych locus⁵. Ich przenośność, zdolność do analizy w czasie rzeczywistym i kompatybilność z warunkami pracującymi na podstawie amplikongenów sprawiają, że są obiecującymi narzędziami do zastosowań terenowych i badań wybuchów⁶. Mimo tych zalet, standaryzowane wielolokusowe warunkiem długich odczytów do rutynowego genotypowania T. gondii są nadal ograniczone.

Aby wypełnić tę lukę, opracowałeśmy skalowalny warunek sekwencjonowania amplikongenów z długimi odczytami, ukierunkowany na dwa polimorficzne locus (Rysunek 1). W połączeniu z konsensualnym polerowaniem i pipelinem wykrywania wariantów, to podejście umożliwia dokładne wykrywanie SNP i INDEL, wspierając dyskryminację na poziomie szczepów. Protokół jest odpowiedni dla laboratoriów wyposażonych w amplifikację PCR i sekwencjonowanie długich odczytów i został zweryfikowany przy użyciu hodowlanych izolatów. Chociaż adaptacja do pierwotnych próbek klinicznych lub środowiskowych może być możliwa, takie zastosowania wymagają dodatkowej optymalizacji i walidacji. Ogólnie rzecz biorąc, ten warunek zapewnia strukturalną ramę dla ukierunkowanej molekularnej charakteryzacji i może wspierać badania epidemiologiczne.

Protokół

To the best of our knowledge, this is the first study to use nanopore long-read sequencing to genotype T. gondii from fibroblast cell cultures.

NOTE: This protocol describes the use of T. gondii RH strain genomic DNA as an example. This protocol can be applied to other strains, but the primers used in the PCR amplification step must be adjusted accordingly.

NOTE: To ensure high-quality results, it is important to optimize the protocol at every step. Here, we provide a general protocol, but researchers may need to make adjustments to suit their specific experimental setups.

NOTE: The protocol described here was optimized using Oxford Nanopore Technologies' MinION device. It is expected that similar results can be obtained using other nanopore devices.

1. Biomarker selection

1. Download genomic sequences of SAG2 and SAG3 in FASTA format from ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app) genome database.
2. Perform pairwise sequence alignments using EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
3. Select amplicon regions ≤1,600 base-pairs (bp) to minimize sequencing time and ensure efficient PCR amplification.
4. Ensure each region contains informative SNPs or INDEL polymorphisms for strain differentiation.

2. Culture and harvesting of Toxoplasma gondii tachyzoites

1. Maintenance of host cell cultures
   1. Obtain human foreskin fibroblasts (HFFs) from a certified commercial source and culture them in complete growth medium composed of Dulbecco’s Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin.
   2. Incubate cultures at 37 °C with 5% CO₂ in a humidified incubator.
2. Maintenance and expansion of parasite lines.
   1. Infect fibroblast monolayers at 80–90% confluence using tachyzoites at a multiplicity of infection of 1–3 parasites per host cell. For a T25 flask containing approximately 1 × 10⁶ fibroblasts, add 1–3 × 10⁶ tachyzoites.
   2. Examine cultures daily using an inverted light microscope at 20× or 40× magnification. Identify host cell lysis by observing widespread monolayer disruption.
      NOTE: Do not use fibroblast cultures beyond passage 20 to avoid culture-related artifacts.
   3. Harvesting of tachyzoites.
      1. Collect cultures when ≤90% host cell lysis is visible.
      2. Centrifuge at 1,300 × g for 10 min at 4 °C.
      3. Resuspend the pellet in 10 mL sterile phosphate-buffered saline by gentle pipetting, and centrifuge again at 1,300 × g for 10 min at 4 °C. Repeat once more.

3. Extraction of genomic DNA and amplicon generation

1. Extract genomic DNA using a silica column-based genomic DNA purification kit⁷. Elute DNA in 50 µL elution buffer.
2. Measure DNA concentration using a microvolume spectrophotometer.
3. Store DNA at 4 °C for short-term or –20 °C for long-term storage.
4. Prepare PCR reactions using a high-fidelity DNA polymerase master mix, locus-specific primers (Supplementary Table 1), and nuclease-free water.
5. Perform PCR amplification using a calibrated thermal cycler under the following cycling conditions: (a) initial denaturation at 98 °C for 30 s, (b) 35 cycles of 98 °C for 10 s; locus-specific annealing: 60 °C for SAG2, 68 °C for SAG3, 30 s; 72 °C for 20 s, (c) Final extension: 72 °C for 2 min.
6. Verify PCR products by electrophoresis on a 1.5% agarose gel.
7. Purify PCR products using a column-based PCR and gel extraction purification system according to the manufacturer’s instructions⁸. Elute DNA in 15–20 µL of elution buffer.
   NOTE: PCR efficiency and yield may be reduced by low DNA template quality, concentration, or suboptimal reaction conditions. If the amplicon yield is low, verify the DNA template integrity using agarose gel electrophoresis and concentration and purity using a spectrophotometer. PCR annealing temperatures and primer concentrations should also be optimized for the primer pairs used, and the PCR cycle number should be increased as necessary.

4. Library preparation for long-read sequencing

1. End-repair and dA-tailing
   1. Thaw all reagents and mix thoroughly by vortex. Dilute the DNA control sample with 10.5 µL of elution buffer during the first use only and keep it on ice.
      NOTE: Always vortex magnetic beads thoroughly before each use.
      ​CAUTION: Do not vortex the End-Prep Enzyme Mix; mix gently by pipetting.
   2. Pipette 200 fmol (~130 ng for a 1 kb fragment) of each DNA sample into 0.2 mL PCR tubes and adjust volume to 11.5 µL with nuclease-free water.
   3. Add 1 µL of diluted DNA control sample per tube and mix by pipetting 10–20 times.
   4. Prepare an end-prep master mix per sample containing 1.75 µL Reaction Buffer and 0.75 µL Enzyme Mix (including 5% excess).
   5. Add 2.5 µL of master mix to each sample, mix gently and spin down briefly.
   6. Incubate in a thermal cycler at 20 °C for 5 min followed by 65 °C for 5 min.
2. Purification of end-prepared DNA
   1. Transfer the 15 µL reaction into a 1.5 mL low DNA-binding microcentrifuge tube.
   2. Add 15 µL resuspended magnetic beads, mix gently and spin briefly.
   3. Incubate samples on a rotator mixer for 5 min at room temperature.
   4. Prepare fresh 80% ethanol for washing.
   5. Place tubes on a magnetic rack until the beads pellet and remove the supernatant carefully.
   6. Wash beads twice with 200 µL of 80% ethanol.
      NOTE: Allow the beads to fully pellet, then carefully remove the ethanol.
   7. Air-dry beads for ~30 s; avoid over-drying to prevent cracking.
   8. Resuspend beads in 10 µL nuclease-free water and incubate for 2 min at room temperature.
   9. Place tubes on a magnetic rack and transfer 10 µL eluate to a clean low DNA-binding microcentrifuge tube.
   10. Measure DNA concentration using 1 µL on a spectrophotometer.
3. Native barcoding
   1. Thaw Blunt/TA Ligase Master Mix, EDTA, Short Fragment Buffer (SFB), and Native Barcodes (NB01–NB24).
   2. Assign individual barcodes to samples 1–24.
   3. Assemble the barcoding reaction with 7.5 µL end-prepped DNA

Wyniki

Genomiczne DNA Toxoplasma gondii zostało pomyślnie amplifikowanie metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ukierunkowanej na dwa markery genetyczne: SAG2 i SAG3 (Rysunek 2). Po oczyszczeniu, produkty PCR dały odrębne pasma o spodziewanych rozmiarach na elektroforezie na żelu agarozy, odpowiadające 639 bp (SAG2) i 1158 bp (SAG3). Jasność i spójność tych pasm potwierdziły pomyślną amplifikację i integralność fragmentów genów do analizy sekwencji....

Dyskusja

To studium demonstruje przydatność długiego sekwencjonowania Oxford Nanopore w połączeniu z ukierunkowanym podejściem wielolokacyjnym do szybkiego i niezawodnego genotypowania Toxoplasma gondii. Skupiając się na dwóch dobrze scharakteryzowanych lokacjach antygenów powierzchniowych, SAG2 i SAG3, stworzyliśmy dowód koncepcji sekwencji wielolokacyjnej opartej na Oxford Nanopore poprzez porównawcze analizy szczepów RH (Typ I) i ME49 (Typ II), wykazując zdolność platformy do rozdzielania genetycznyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose powder	Thermo Fisher Scientific	16500100	Do elektroforezy żelowej
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11995065	Środek do hodowli komórek
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)	Oxford Nanopore Technologies, UK	N/A	Przepływ pracy Nextflow do przetwarzania i analizowania danych sekwencjonowania amplikonów nanopore; wersja 1.2.1 została użyta do reprodukowalnej analizy danych MinION.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)	Oxford Nanopore Technologies, UK	N/A	Przepływ pracy Nextflow do dopasowywania odczytów sekwencjonowania nanopore do sekwencji referencyjnych i zintegrowanej wizualizacji za pomocą IGV; wersja 1.2.3 została użyta do reprodukowalnej analizy danych MinION.
Ethyl alcohol, pure	Merck Life Science	51976-500ML-F	Do czyszczenia na perłach
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	MFCD00132239	Suplement do hodowli komórek
Flow Cell Wash Kit	Oxford Nanopore Technologies	EXP-WSH004	Mycie komórki przepływowej
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)	Thermo Fisher Scientific	SM1331	Potwierdzenie rozmiaru
HFF-1 human foreskin fibroblast cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	SCRC-1041	Ludzkie fibroblasty skóry pochodzące z pępowiny noworodka; używane do propagacji pasożytów
MinION Flow Cell (R10.4.1)	Oxford Nanopore Technologies	FLO-MIN114	Komórka przepływowa do sekwencjonowania
MinION Mk1B Sequencing Device	Oxford Nanopore Technologies, UK	MIN-101B	Sekwencer nanopore; sekwencjonowanie wykonano za pomocą oprogramowania MinKNOW (v25.09.16) do sterowania urządzeniem i wywoływania zasad w czasie rzeczywistym.
MinKNOW Software	Oxford Nanopore Technologies, UK	N/A	Oprogramowanie używane do sterowania urządzeniem MinION Mk1B, sekwencjonowania w czasie rzeczywistym i wywoływania zasad; wersja 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14	Oxford Nanopore Technologies	SQK-NBD114.24	Kodowanie dla próbek wielokrotnych
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	New England Biolabs	M0367	Ligacja DNA
NEBNext Quick Ligation Module	New England Biolabs	E6056	Ligacja adaptera
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)	New England Biolabs	B6058	Stosowane w ligacji DNA
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module	New England Biolabs	E7546	Przygotowanie biblioteki
Nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	R0581	Stopień czystości molekularnej
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609.5	Oczyszczanie produktu PCR
Penicillin–Streptomycin (1%)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140-122	Mieszanka antybiotyków
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Bufor myjący
Q5 High-Fidelity 2× Master Mix	New England Biolabs	M0492S	Polimeraza o wysokiej dokładności
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	69504	Ekstrakcja DNA
Quick T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M2200	Enzym do ligacji adaptera
SYBR Safe DNA Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Barwnik do barwienia DNA
TriTrack DNA Loading Dye (6×)	Thermo Fisher Scientific	R1161	Wczytywanie próbek do żelu
Trypsin–EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	25200056	Do przemieszczania HFF
1× TAE or 1× TBE buffer	—	—	Bufor bieżący
2× PCR premix	—	—	Gotowy mieszanek do PCR