Przedstawiamy tutaj protokół służący do szybkiego identyfikowania i genotypowania szczepów Toxoplasma gondii za pomocą przenośnego sekwencjonowania nanoporami wybranych markerów genetycznych, umożliwiając skalowalną, ukierunkowaną identyfikację szczepów w izolatów hodowanych w laboratorium z potencjalnym przyszłym zastosowaniem w ustawieniach nadzorczych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Toxoplasma gondii to pasożytniczy pierwotniak rozprzestrzeniony na całym świecie, charakteryzujący się znaczną różnorodnością genetyczną, co wymaga dokładnych metod molekularnych w celu rozróżnienia szczepów. Celem tego protokołu jest ustanowienie reproduktybilnego przepływu pracy dla ukierunkowanej wielolokacyjnej genotypizacji hodowli izolacji T. gondii. Procedura obejmuje in vitro propagację reprezentatywnych szczepów typu I (RH) i typu II (ME49), ekstrakcję DNA genomowego, lokus-specyficzną amplifikację genów SAG2 i SAG3 oraz analizy oparte na sekwencjonowaniu w celu wykrycia polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) i zdarzeń wstawiania/delecji (INDEL). Dane sekwencjonowania są przetwarzane w celu wygenerowania konsensusowych sekwencji o wysokiej pewności oraz przeprowadzenia porównawczej alinacji w celu identyfikacji polimorfizmów specyficznych dla szczepu. Zastosowanie tego przepływu pracy do archetypowych szczepów wykazało wysoką efektywność mapowania, jednolitą głębokość odczytów na całym obszarze docelowych lokusa oraz dokładne odzyskiwanie oczekiwanych rozmiarów amplikonów, potwierdzając wiarygodne wykrywanie różnorodności genetycznej na poziomie lokusa. Chociaż pełne przypisywanie genotypu wymaga włączenia dodatkowych standaryzowanych markerów, ten protokół zapewnia skalowalny i reproduktybilny rama dla ukierunkowanej charakteryzacji genetycznej izolacji T. gondii utrzymywanych w laboratorium i wspiera spójną wielolokacyjną analizę sekwencji.
Wprowadzenie
Toxoplasma gondii to globalnie rozpowszechniony pasożyt z grupy apikompleksów i główne ryzyko zoonozy przenoszonej przez żywność i wodę, zdolny do infekcji praktycznie wszystkich ciepłokrwistych zwierząt, przy czym kotowate pełnią rolę ostatecznych gospodarzy1. Zakażenie u ludzi i zwierząt najczęściej następuje poprzez połknięcie cyst tkankowych lub oocyst sporulowanych, a zdolność pasożyta do przechodzenia między etapami tachyzoitu i bradyzoitu umożliwia długotrwałą persystencję w tkankach nerwowych i mięśniowych, przyczyniając się zarówno do przenoszenia przez mięso, jak i do transmisji środowiskowej2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To the best of our knowledge, this is the first study to use nanopore long-read sequencing to genotype T. gondii from fibroblast cell cultures.
NOTE: This protocol describes the use of T. gondii RH strain genomic DNA as an example. This protocol can be applied to other strains, but the primers used in the PCR amplification step must be adjusted accordingly.
NOTE: To ensure high-quality results, it is important to optimize the protocol at every step. Here, we provide a general protocol, but researchers may need to make adjustments to suit their specific experimental setups.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Genomiczne DNA Toxoplasma gondii zostało pomyślnie amplifikowanie metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ukierunkowanej na dwa markery genetyczne: SAG2 i SAG3 (Rysunek 2). Po oczyszczeniu, produkty PCR dały odrębne pasma o spodziewanych rozmiarach na elektroforezie na żelu agarozy, odpowiadające 639 bp (SAG2) i 1158 bp (SAG3). Jasność i spójność tych pasm potwierdziły pomyślną amplifikację i integralność fragmentów genów do analizy sekwencji........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
To studium demonstruje przydatność długiego sekwencjonowania Oxford Nanopore w połączeniu z ukierunkowanym podejściem wielolokacyjnym do szybkiego i niezawodnego genotypowania Toxoplasma gondii. Skupiając się na dwóch dobrze scharakteryzowanych lokacjach antygenów powierzchniowych, SAG2 i SAG3, stworzyliśmy dowód koncepcji sekwencji wielolokacyjnej opartej na Oxford Nanopore poprzez porównawcze analizy szczepów RH (Typ I) i ME49 (Typ II), wykazując zdolność platformy do rozdzielania genetycznyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych Egiptu & Biuro Kultury i Spraw Edukacyjnych Egiptu w Londynie oraz UKRI MRC (MR/X502947/1). Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose powder | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | Do elektroforezy żelowej |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | Środek do hodowli komórek |
| epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1) | Oxford Nanopore Technologies, UK | N/A | Przepływ pracy Nextflow do przetwarzania i analizowania danych sekwencjonowania amplikonów nanopore; wersja 1.2.1 została użyta do reprodukowalnej analizy danych MinION. |
| epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3) | Oxford Nanopore Technologies, UK | N/A | Przepływ pracy Nextflow do dopasowywania odczytów sekwencjonowania nanopore do sekwencji referencyjnych i zintegrowanej wizualizacji za pomocą IGV; wersja 1.2.3 została użyta do reprodukowalnej analizy danych MinION. |
| Ethyl alcohol, pure | Merck Life Science | 51976-500ML-F | Do czyszczenia na perłach |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | MFCD00132239 | Suplement do hodowli komórek |
| Flow Cell Wash Kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH004 | Mycie komórki przepływowej |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb) | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | Potwierdzenie rozmiaru |
| HFF-1 human foreskin fibroblast cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1041 | Ludzkie fibroblasty skóry pochodzące z pępowiny noworodka; używane do propagacji pasożytów |
| MinION Flow Cell (R10.4.1) | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN114 | Komórka przepływowa do sekwencjonowania |
| MinION Mk1B Sequencing Device | Oxford Nanopore Technologies, UK | MIN-101B | Sekwencer nanopore; sekwencjonowanie wykonano za pomocą oprogramowania MinKNOW (v25.09.16) do sterowania urządzeniem i wywoływania zasad w czasie rzeczywistym. |
| MinKNOW Software | Oxford Nanopore Technologies, UK | N/A | Oprogramowanie używane do sterowania urządzeniem MinION Mk1B, sekwencjonowania w czasie rzeczywistym i wywoływania zasad; wersja 25.09.16. |
| Native Barcoding Kit 24 V14 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-NBD114.24 | Kodowanie dla próbek wielokrotnych |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England Biolabs | M0367 | Ligacja DNA |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056 | Ligacja adaptera |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×) | New England Biolabs | B6058 | Stosowane w ligacji DNA |
| NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module | New England Biolabs | E7546 | Przygotowanie biblioteki |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | R0581 | Stopień czystości molekularnej |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.5 | Oczyszczanie produktu PCR |
| Penicillin–Streptomycin (1%) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15140-122 | Mieszanka antybiotyków |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | Bufor myjący |
| Q5 High-Fidelity 2× Master Mix | New England Biolabs | M0492S | Polimeraza o wysokiej dokładności |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 69504 | Ekstrakcja DNA |
| Quick T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M2200 | Enzym do ligacji adaptera |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Barwnik do barwienia DNA |
| TriTrack DNA Loading Dye (6×) | Thermo Fisher Scientific | R1161 | Wczytywanie próbek do żelu |
| Trypsin–EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 25200056 | Do przemieszczania HFF |
| 1× TAE or 1× TBE buffer | — | — | Bufor bieżący |
| 2× PCR premix | — | — | Gotowy mieszanek do PCR |
Bibliografia
- Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
- Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
