Opracowanie modelu fuzji międzycieleskowej ogona szczura: Pilotażowe badanie wykonalności

Podsumowanie

Badanie to wykazało techniczną wykonalność pilotażowego modelu zespolenia kręgosłupa u szczurów z użyciem tylnego koszyka i fiksacji płytki. Analiza histomorphometryczna po 12 tygodniach potwierdziła ciągłe łączenie kości i wyraźne wzorce dojrzewania kości wewnątrz koszyka. Ten techniczny model służy jako wstępna podstawa dla przyszłych dużych badań.

Streszczenie

Kręgi ogonowe szczurów są szeroko stosowane w badaniach nad regeneracją kości i fuzją kręgosłupa jako wygodne miejsca do testowania materiałów na transplantaty kostne i implantów. Wcześniejsze modele łączenia ogonów szczurów osiągnęły łączenie międzykręgowe poprzez usunięcie krążka i przeszczepienie kości, lub za pomocą zewnętrznych urządzeń do fiksacji. Mimo to, żaden taki model na małych zwierzętach nie został opracowany, który wykorzystywał klatki do fuzji międzykręgowej analogiczne do tych stosowanych klinicznie. Założono, że można ustanowić oceniane środowisko fuzji kości bez powikłań neurologicznych poprzez wykonanie tylnego wstawienia klatki naśladującego procedury kliniczne, uzupełnione fiksacją płytkową, w kręgach ogonowych szczurów. Ta wstępna pilotażowa studia (n = 1) została zaprojektowana w celu oceny wykonalności technicznej. Opracowano podejście chirurgiczne, w którym miniaturyzowana tytanowa klatka została precyzyjnie włożona do przestrzeni krążkowej między sąsiednimi kręgami ogonowymi, co ściśle naśladuje ludzką procedurę chirurgiczną. Tytan został wybrany dla klatki ze względu na jej szerokie zastosowanie kliniczne i biokompatybilność. Wstępne wyniki wykazały techniczną wykonalność tego podejścia. Wszczepiona klatka utrzymywała wysokość krążka i wyprostowanie kręgosłupa. Obserwowano progresywne wrastania kości przez klatkę, co zakończyło się potwierdzonym ciągłym połączeniem kostnym przez przestrzeń międzykręgową w 12 tygodni po operacji. Obecność ciągłej struktury łącznotkankowej oraz brak przesłoniętego tkanki włóknistej zostały potwierdzone radiologicznie i histologicznie. Ogólnie rzecz biorąc, ten oparty na klatce model łączenia ogona szczura zapewnia obiecującą platformę do oceny nowych biomateriałów i badania mechanizmów fuzji kości międzykręgowych. Jednak brak grupy kontrolnej i analizy statystycznej, z powodu jednoosobowego projektu, ogranicza ogólność tych wyników i wymaga dalszej weryfikacji.

Wprowadzenie

Fusja międzykręgowa jest uznanym leczeniem chirurgicznym dla różnych zaburzeń kręgosłupa, w tym niestabilności, spondylolistozy i chorób zwyrodnieniowych; szczególnie, ewoluowała przez około 70 lat jako standardowa procedura^1,2. Zabieg polega na usunięciu krążka międzykręgowego i włożeniu klatki lub przeszczepu kości, aby promować solidną fuzję między sąsiednimi kręgami^3,4. Co więcej, dodanie tylnego instrumentarium z klatką zmniejsza wskaźniki psuenartrozy i rozszerza jego wskazania kliniczne⁵. Niemniej jednak, powikłania takie jak psuenartroza i osiadanie klatki pozostają znaczącymi wyzwaniami klinicznymi, które wymagają niezawodnego opracowania modelu przedklinicznego do oceny nowych materiałów i czynników promujących fuzję^6,7.

Węże były szeroko stosowane w badaniach nad fuzją kręgosłupa ze względu na ich ekonomiczną opłacalność, szybkie rozmnażanie, szybkie gojenie i łatwość obsługi^8,9. Niemniej jednak, istniejące modele fuzji międzykręgowej u szczurów wykazują znaczne ograniczenia. W szczególności, przedni dostęp międzykręgowy lędźwiowy (ALIF) u szczurów wymaga poważnej manipulacji naczyń i narządów brzusznych, co skutkuje dużą inwazyjnością chirurgiczną i znacznym ryzykiem powikłań^10,11. Przedni dostęp międzykręgowy lędźwiowy (PLIF) wiąże się z nieunikniony ryzykiem uszkodzenia neurologicznego z powodu niezwykle małych kanałów kręgowych i elementów nerwowych, co sprawia, że odprowadzenie nerwu jest prawie niemożliwe¹². W rezultacie, większość badań na szczurach ograniczała się do fuzji tylno-bocznej (PLF), która strukturalnie nie pozwala na badanie mechanizmów fuzji kości w klatce, co jest krytycznym aspektem w warunkach klinicznych¹³. Co więcej, choć istnieją modele ogonowe, brakuje im systemu oceny, który integruje kliniczna klatka międzykręgowa z tyłowym mocowaniem płytki.

Ogon kręgosłupa u szczurów oferuje unikalne zalety dla badań nad fuzją międzykręgową. Dyski ogonowe wykazują silne podobieństwa geometryczne, składowe i mechaniczne do ludzkich krążków lędźwiowych, co sprawia, że są coraz bardziej popularne w badaniach nad krążkami^14,15. Ponadto, chirurgia ogonowa zapewnia łatwy dostęp chirurgiczny, opłacalność i szybki pooperacyjny okres rekonwalescencji w porównaniu z podejściami lędźwiowymi¹⁶. Jednak do tej pory, żadne badania nie zgłosiły udanego włożenia klatki tylnej w szczurzym ogonie z szczegółową oceną histologiczną formowania kości wewnątrz i wokół klatki.

Ocena histologiczna, szczególnie dotycząca niedekalizacji histmorfometrii kości, pozostaje złotym standardem w ocenie osseointegracji i fuzji kostnej^17,18. W szczególności, umożliwia ilościową analizę krytycznych parametrów formowania kości, w tym objętość kości/objętość tkanki (BV/TV), liczbę belkową i grubość belki, umożliwiając jednocześnie jakościową ocenę dojrzałości kości poprzez rozróżnienie kości węglanowej i warstwownej^19,20. Taka szczegółowa ocena histmorfometryczna może ujawnić przestrzenne i czasowe wzorce osteokondukcji w klatce i na granicach klatka-kręg^21,22. Niemniej jednak, kompleksowa ocena histmorfometryczna osteokondukcji klatki w modelach na szczurach jest niedostateczna.

Celem niniejszego badania było opracowanie pilotażowego modelu fuzji międzykręgowej ogona u szczurów z wykorzystaniem włożenia klatki tylnej i uzupełniającego mocowania płytki, aby wykazać jego techniczną wykonalność. W badaniu przedstawiono szczegółową technikę chirurgiczną i kompleksową ocenę histologiczną formowania kości wewnątrz klatki i na granicach końcówki kręgu. Zakładano, że można ustanowić oceniające środowisko fuzji kości bez powikłań neurologicznych poprzez wykonanie włożenia klatki tylnej naśladującego procedury kliniczne, uzupełnione mocowem płytki, w kłębuszach ogonowych szczura. Ten model zapewnia wydajną platformę do oceny materiałów fuzji międzykręgowej i, w istniejącej literaturze, reprezentuje początkowe techniczne zbadanie pomyślnego umieszczenia klatki tylnej za pomocą oceny osteokondukcji histmorfometrycznej w modelu na szczurach.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użycia Uniwersytetu Jikei (numer zgody 2023–034C1). Niniejsze badanie zostało zaprojektowane jako pilotażowe studium wykonalności. Aby ocenić techniczną wykonalność tej wyjątkowo delikatnej i nowatorskiej operacji wstawienia klatki tylnej w ogonowym odcinku kręgosłupa szczura przed rozpoczęciem weryfikacji na dużą skalę, zgodnie z zaleceniami etycznymi, do pierwszej oceny technicznej użyto jednego zwierzęcia (n = 1), aby zminimalizować użycie zwierząt podczas wstępnej oceny technicznej. Na standardową odmianę do badań nad łączeniem kręgosłupa wybrano samców szczurów Sprague-Dawley (SD). Kryteriami włączenia były zdrowi samce w wieku 8–10 tygodni, o wadze między 200–250 g, aby upewnić się, że wysokość międzykręgowa (1,8–2,2 mm) jest kompatybilna z 2 mm klatką. Zwierzęta wykazujące > 10% utratę masy ciała podczas okresu przyzwyczajania, zmniejszoną aktywność lub widoczne deformacje ogona zostały wyłączone. Do niniejszego badania wykorzystano szczura Sprague-Dawley (8 tygodni, waga 221,8 g; Japan SLC, Shizuoka, Japonia). Zwierzę było trzymane w kontrolowanym środowisku o temperaturze 25°C i wilgotności względnej 50% (dopuszczalny zakres 30–70%) z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność i miało dostęp ad libitum do wody i standardowej diety dla gryzoni. Szczury były trzymane w klatkach z twardym dnem, wyposażonych w materiały do gniazdowania i patyki do żucia w celu stymulacji środowiska. Przed zabiegiem chirurgicznym zastosowano 3-dniowy okres przyzwyczajania. Aby zapobiec przygryzaniu implantów ogonowych przez koleżankę z klatki, szczur był trzymany w pojedynczej klatce przez całe badanie, co było krytycznym czynnikiem w tym eksperymencie.

Przygotowanie śrub i płyt

Materiały do wewnętrznej fiksacji przygotowano przed zabiegiem chirurgicznym. Dostępne na rynku śruby ze stali nierdzewnej (oryginalny średnica: 1,2 mm, długość: 14 mm) zostały przycięte do dokładnej długości 6 mm za pomocą ściągacza do drutu (Rysunek 1A). Śruby zostały sterylizowane za pomocą standardowego sterylizatora parowego w temperaturze 121 °C przez 20 min. W wewnętrznej płycie fiksacji z polioksymetylenu (POM) (18 mm długości, 3 mm szerokości, 1 mm grubości) wywiercono otwory na śruby o średnicy 1,2 mm w odstępach 12 mm za pomocą ręcznej wiertnicy (Rysunek 1B–D). Następnie, narożniki płyt POM zostały zaokrąglone za pomocą ściągacza do drutu w celu minimalizacji podrażnienia otaczających tkanek miękkich (Rysunek 1E). Płyty były sterylizowane za pomocą gazu tlenu etylenu (EtO) lub gazowego plazmy nadtlenku wodoru, biorąc pod uwagę termiczną wrażliwość polimeru. Klatka tytanowa posiada połączoną strukturę kratownicową z podłużnymi kanałami o średnicy 300–500 μm. Jej powierzchnię przygotowano za pomocą technologii Lamellar 3D Titanium, aby osiągnąć mikropowierzchniową chropowatość 3–5 μm, co ułatwia bezpośrednie wzrost kości.

Znieczulenie i zabieg chirurgiczny

Nie przeprowadzano przedoperacyjnego postu, aby uniknąć niepotrzebnego stresu metabolicznego. Znieczulenie indukowano za pomocą potrójnej mieszanki znieczulającej składającej się z medetomidyny (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) i butorfanolu (2,5 mg/kg), która była wstrzykiwana podskórnie na grzbiet używając igły 25-gauge²³. Odpowiedni poziom znieczulenia chirurgicznego oceniono co 15 min poprzez potwierdzenie braku odruchu wycofania łapki (szczypięcie palca), utrzymanie różowych błon śluzowych i monitorowanie częstości oddechów (70–110 oddechów/min). Następnie przeprowadzono zabieg chirurgiczny fuzji międzykręgowej ogona. Zwierzę umieszczono w pozycji brzusznej (Rysunek 2A), a cały ogon został zdezynfekowany według trzyrundowego protokołu naprzemiennego ścierania (70% etanol, sterylny alkohol jodowy i 70% etanol), aby zapewnić sterylne pole. Aby zidentyfikować docelowe kręgi, przeprowadzono manualne badanie palpacyjne począwszy od kości krzyżowej. Pierwsze ruchome staw zostało zidentyfikowane jako złącze kości krzyżowej-Co1, a odcinek bezpośrednio dystalny został oznaczony jako Co2, co definiuje miejsce docelowe Co2–Co3. Na grzbietowej stronie wykonano podłużny nacięcie o długości około 2 cm, rozciągające się od drugiego do trzeciego kręgu ogona (Co2–Co3) (Rysunek 2B), aby odsłonić tylną powierzchnię każdego kręgu. Podczas ekspozycji należało zachować ostro

Wyniki

Waga ciała (Tabela 1)

Waga ciała była mierzona przez 12 tygodni pooperacyjnie, wykazując stały wzrost (z 221,8 g do 346,8 g), co wskazuje na fizjologiczną homeostazę i pośrednio potwierdza brak poważnych przewlekłych dolegliwości. Potwierdziły to codzienne oceny multimodalne potwierdzające normalną aktywność i nieskomplikowane gojenie się ran.

Rana (Rysunek 3)

Dyskusja

Tu, nowy model fuzji międzykręgowej ogona szczura został stworzony. Model ten polega na włożeniu klatki tytanowej drogą tylną wzmocnionej mocowaniem płytą i śrubą. Następnie ocena formowania kości wewnątrklatkowo została przeprowadzona za pomocą szczegółowej analizy histomorphometrycznej. Wyróżniające się cechy tego modelu to trzy: 1) ściśle naśladuje kliniczne procedury fuzji międzykręgowej lędźwiowej tylnej lub fuzji międzykręgowej lędźwiowej przezotworowej łącząc klatkę międzykręgową z instrumentacją tylną; 2) wykorzy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Bright-field microscope	Keyence. (Osaka, Japan)	BZ-X800
Butorphanol	FUJIFILM	021-19001
Calcein	FUJIFILM	76082
Carprofen	FUJIFILM	037-19761
Cefalexin	FUJIFILM	036-11051
Computerized image analyzer	System Supply Co. (Nagano, Japan)	Histometry RT CSS-840
Confocal laser-scanning microscope for fluorescence merging	Carl Zeiss. (Jena, Germany)	LSM 980
Curette	Natsume	E-8-00
Diamond saw microtome	Leica. (Wetzlar, Germany)	SP1600
Electric drill	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A9% E3%83%95%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%AB% E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%8F%E3% 82%BA-%E3%83%8E-42-%E9%9B %BB%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3 %83%87%E3%82%A3%E3 %83%AA%E3%83%A5%E3 %E3%83%BC%E3%82% BF%E3%83%BC-%E3% 83%91%E3%83%A9%E3 %83%A2%E3%83%87%E3 %83%AB%E7%94%A8%E5% %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%BF%E3%83%9F%E3 %83%A4+%E9%9B%BB%E5% 8B%95%E3%83%8F%E3%83% B3%E3%83%87%E3%82%A3% E3%83%89%E3%83%AC%E3% 83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
hand drill	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
Medetomidine	FUJIFILM	135-17473
Midazolam	FUJIFILM	135-13791
Pin vise	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%E3%83%8D%E3%83%83%E3% 82%AF%E3%82%B9-ANEX-%E3% 83%A9%E3%83%90%E3%83%BC %E3%82%B0%E3%