Komputerowe wspomaganie badań i walidacja leków aktywnych w leczeniu gorączki i kaszlu

Podsumowanie

Tutaj zbudowaliśmy wielowymiarową sieć "komponent-cel-szlak-szlak-choroba", integrując przesiewowe badania farmakologii sieciowej, dokowanie molekularne oraz walidację modeli myszy indukowanych LPS. Poprzez ustalenie jasnych kluczowych parametrów umożliwia efektywną identyfikację aktywnych składników medycyny etnicznej Tong, Lengyuxiao Tang, oraz weryfikację powtarzalnego procesu.

Streszczenie

Systematyczne badanie i weryfikacja aktywnych składników w medycynie etnicznej Dong Lengyuxiao Tang (LYXT; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. oraz Zingiber officinale Roscoe) w leczeniu gorączki i kaszlu, ten schemat utworzył proces metodologiczny integrujący predykcję farmakologii sieciowej i weryfikację eksperymentalną. Po pierwsze, korzystając z bazy danych i analiz systemów medycyny chińskiej (TCMSP), z biodostępnością doustną (OB) ≥ 30% i podobnością do leku (DL) ≥ 0,18 jako kryteriami, przebadane były kluczowe aktywne składniki LYXT, a powiązane cele dotyczące gorączki i kaszlu zebrano z wielu baz chorób. Następnie skonstruowano sieć interakcji "komponent-cel-choroba" i dzięki analizie topologicznej oraz ontologii genów (GO) i wzbogaceniu szlaków szlaków Kioto encyclopedia of gene and genomes (KEGG), zidentyfikowano główne cele działania (CYP3A4, POR) oraz kluczowe szlaki sygnalizacyjne (szlak MAPK). Technologia dokowania molekularnego została wykorzystana do weryfikacji zdolności wiązania kluczowych komponentów z celami rdzeniowymi. Wreszcie model przewlekłego zapalenia oskrzeli u myszy został ustalony poprzez donosową instylację lipopolisacharydu (LPS), a skuteczność przeciwzapalną in vivo przewidywanych głównych aktywnych składników została zweryfikowana. Wyniki wykazały, że składniki takie jak β-karoten i saparenol, przesiewane farmakologią sieci, wykazywały różny stopień działania przeciwzapalnego w eksperymentach na zwierzętach, a ich mechanizmy mogą wiązać się z hamowaniem szlaku sygnalizacyjnego MAPK/p38. Ten schemat stanowi powtarzalny przykład badań przesiewowych i mechanizmów aktywnych składników w tradycyjnych medycynach etnicznych.

Wprowadzenie

Medycyna Dong to system etnomedyczny w ramach Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM), praktykowany przez grupę etniczną Dong w Guizhou, Hunan i Guangxi. Reprezentuje ich skumulowaną wiedzę empiryczną, rozwijaną przez pokolenia. System ten łączy medycynę ziołoleczową, akupunkturę, nastawianie kości, masaż, terapię dietetyczną oraz praktyki duchowe. Jej charakterystyczne cechy wynikają z historycznej izolacji geograficznej i tradycji ustnej, która sprzyjała unikalnej, opartej na praktyce farmakopei dostosowanej do lokalnego środowiska i wierzeń kulturowych.

Uporczywa gorączka, stan rozwijający się, gdy organizm nie jest w stanie kontrolować temperatury, jest oznaką dysfunkcji organizmu i kluczową funkcją samoochrony w ludzkich komórkach¹. Istnieje wiele różnych metod leczenia medycyny grzewczej narodowości Dong. Wśród nich gorączka dzieli się na gorączkę wewnętrzną i zewnętrzną. Gorączka wewnętrzna odnosi się do ciepła wywołanego chorobami wewnętrznymi, a gorączka zewnętrzna to ciepło generowane przez zimno lub traumę². Gorączka egzogenna zwykle wpływa na funkcje przewodu pokarmowego³. Lekarze z kraju Dong stosują zimną terapię przeciwpiretyczną w leczeniu gorączki. Spośród różnych leków Dong, Lengyuxiao Tang (LYXT) to standardowy wywar stosowany na gorączkę i ból, składający się z Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. oraz Zingiber officinale Roscoe, które są stale tłuczone i mieszane^{z wodą.} Jest głównie stosowany w leczeniu gorączki i bólu głowy wywołanego przeziębieniem.

Jednak aktywne składniki LYXT i ich molekularne mechanizmy pozostają słabo poznane. Aby wypełnić tę lukę, niniejsze badanie zastosowało podejście farmakologii sieciowej do przewidywania potencjalnych składników aktywnych i celów. Aby zweryfikować te przewidywania, wybrano dobrze znany myszy model zapalenia płuc indukowany lipopolisacharydem (LPS), który naśladuje kluczowe reakcje zapalne związane z gorączką i kaszlem, w tym infiltrację leukocytów i produkcję cytokin prozapalnych.

W trakcie odkrywania leków różne badania wykazały, że związki mogą oddziaływać z wieloma celami białkowymi. Dlatego paradygmat "jeden lek, jeden cel biologiczny" przechodzi w kierunku farmakologii systemowej. Związek wchodzący w interakcje z kilkoma biologicznymi białkami docelowymi wirusów lub bakterii może zapewnić użyteczne efekty farmakologiczne⁵. Analiza farmakologii sieciowej jest wykonalnym i skutecznym sposobem na ograniczenie kosztownego i długotrwałego procesu odkrywania leków. Może pomóc lepiej zrozumieć interakcje między lekami, przewidzieć mechanizmy wywołujące chorobę, zasugerować alternatywne leki dla zamierzonych efektów farmakologicznych bez skutków ubocznych oraz przewidywać bioaktywność medycyny tradycyjnej. Podejścia chemoinformatyczne, dokowanie molekularne oraz modelowanie oparte na danych zostały z powodzeniem zastosowane do przewidywania bioaktywności i analizy mechanizmów. Metody te ułatwiają szybkie odkrywanie związków przeciwwirusowych i przeciwbakteryjnych o potencjale klinicznym, a także są wykorzystywane do wyjaśniania skuteczności i działań niepożądanych leków⁶. Na przykład mesylan imatynibu, mała cząsteczka, jest inhibitorem czynnika przyczynowego w przewlekłej białaczce szpikowej, białka fuzyjnego Bcr-Abl, ale blokuje także aktywność kilku kinaz tyrozyny, takich jak Abl, Kit i PDGFR⁷. Dlatego badania nad identyfikacją leków i ich celów są nadal kluczowe w potencjalnym leczeniu chorób, co pomaga nam zrozumieć mechanizmy, dzięki którym związki leków działają na poziomie molekularnym. Podejścia modelowania obliczeniowego i analizy sieci mogą dokładnie przesiewać potencjalne leki i cele, a analiza interakcji multiplikatywnych może stanowić podstawę teoretyczną i praktyczne wskazówki do weryfikacji eksperymentalnej. W niniejszym artykule, dzięki wykorzystaniu narzędzia wyszukiwania retrywalu oddziałujących genów/białek (STRING), bazy danych do adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego odkrywania (DAVID) oraz innych baz danych, w połączeniu z analizą ontologii genów dynamicznych (GO) i analizą szlaków, zebrano dane dotyczące składników aktywnych i powiązanych białek działania leku Dong leku LYXT na gorączkę i kaszel, a także zbadano mechanizm leczenia złożonym składnikami aktywnymi, który może stanowić konkretne teoretyczne źródło do dalszych badań nad lekiem Dong LYXT, stanowi powtarzalną strategię badania farmakologicznych mechanizmów formuł etnomedycznych oraz dostarcza wglądu w rozwój nowych środków przeciwzapalnych.

Protokół

Program eksperymentów na zwierzętach został zrecenzowany przez Komitet Etyki Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Lanzhou (D2024-292). Jest zgodny z zasadami ochrony zwierząt, dobrostanu zwierząt i etyki, a także z odpowiednimi przepisami krajowej etyki dobrostanu zwierząt eksperymentalnych.

1. Przygotowanie bazy danych i oprogramowania

1. Przesiewowe badania składników aktywnych i zbieranie docelowych genów
   1. Uzyskaj dostęp do bazy danych farmakologii systemu TCM i analiz (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) i przeprowadź osobne wyszukiwania, używając łacińskich nazw każdego zioła w formulacji LYXT, mianowicie Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. oraz Zingiber officinale Roscoe, jako słów kluczowych, aby uzyskać wszystkie związki chemiczne związane z każdym ziołem.
   2. Należy stosować kryteria przesiewowe do filtrowania pobranych związków dla każdego zioła w następujący sposób: dla Verbena officinalis L. ustaw biodostępność doustną (OB) ≥ 30,1% i podobność do leku (DL) ≥ 0,12; dla Zingiber officinale Roscoe ustawiony OB ≥ 60% i DL ≥ 0,13; dla Semen Pharbitidis, OB ≥ 16,93%, a DL ≥ 0,50. Następnie połącz filtrowane listy związków ze wszystkich trzech ziół i usuń zduplikowane wpisy oparte na unikalnych identyfikatorach TCMSP, aby wygenerować ostateczną listę aktywnych związków w LYXT.
   3. Eksportuj wszystkie białka docelowe powiązane z tymi związkami aktywnymi z bazy danych TCMSP jako tabelę zawierającą identyfikatory związków i nazwy białek docelowych, a następnie importuj tę listę białek docelowych do bazy UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. Użyj narzędzia do mapowania ID UniProtKB, aby przekonwertować wszystkie nazwy docelowych białek na oficjalne ludzkie symbole genów z kierunkiem mapowania z nazwy białka na nazwę genu oraz usunąć wpisy pozbawione ważnego symbolu genu, aby wygenerować ostateczną listę genów docelowych powiązanych z aktywnymi komponentami LYXT.
2. Zbieranie genów docelowych i analiza nakładania się chorób
   1. Pobierz geny związane z gorączką i kaszlem z bazy danych GeneCards (www.genecards.org), wyszukując osobno za pomocą słów kluczowych "gorączka" i "kaszel", zachowaj geny z oceną relewancji ≥ 5 oraz połącz wyniki obu wyszukiwań w bazie danych.
   2. Pobierz geny związane z gorączką i kaszlem z bazy danych terapeutycznych celów (TTD) (db.idrblab.net/ttd), wyszukując osobno za pomocą słów kluczowych "gorączka" i "kaszel", pobierz wszystkie powiązane geny docelowe i połącz wyniki obu wyszukiwań w bazie danych.
   3. Pobierz geny związane z gorączką i kaszlem z bazy danych PharmGkb (www.pharmgkb.org), wyszukując osobno za pomocą słów kluczowych "gorączka" i "kaszel", pobierz wszystkie powiązane geny i połącz wyniki obu wyszukiwań w bazie danych.
   4. Pobierz geny związane z gorączką i kaszlem z bazy danych Online Mendelian Inheritance in Human (OMIM) (www.omim.org), wyszukując osobno za pomocą słów kluczowych "gorączka" i "kaszel", pobierz wszystkie powiązane geny i połącz wyniki obu wyszukiwań w bazie danych.
   5. Pobierz geny związane z gorączką i kaszlem z bazy danych DrugBank (go.drugbank.com)⁸ , wyszukując osobno za pomocą słów kluczowych "gorączka" i "kaszel", pobierz wszystkie powiązane geny i połącz wyniki obu wyszukiwań w bazie danych.
   6. Połącz listy genów uzyskane ze wszystkich pięciu baz danych w jedną, kompleksową listę i usuń zduplikowane symbole genów, aby wygenerować ostateczną listę genów chorób związanych z gorączką i kaszlem.
   7. Porównaj listę celów choroby z kroku 1.2.6 z listą aktywnych komponentów genów docelowych LYXT z etapu 1.1.4, aby wybrać nakładające się geny wspólne dla obu list, i eksportować tę nakładającą się listę genów jako plik CSV.
3. Konwersja ID i analiza przekroju poprzecznego
   1. Załaduj nakładającą się listę genów z kroku 1.2.7 do środowiska R i wejdź na stronę DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Prześlij nakładającą się listę genów do DAVID z gatunkiem ustawionym na Homo sapiens , a typem listy na symbol genu, a następnie wykonaj narzędzie do anotacji funkcjonalnej, aby przeprowadzić analizę przekroju poprzecznego.
   3. Przekonwertuj ID symboli przecinających się białek na identyfikatory zespołu za pomocą funkcji konwersji ID genu w DAVID, ustawiając kierunek konwersji z symbolu genu na identyfikator zespołu.
   4. Eksportuj przekonwertowaną listę identyfikatorów zespołu wraz z oryginalnymi symbolami genów jako plik CSV do analizy wzbogacania w dalszej fazie.

2. Przesiewowe badanie kluczowych składników aktywnych i docelowych białek

1. Konstrukcja sieci złożono-celowa
   1. Załaduj listę przecinających się genów z kroku 1.2.7 oraz listę aktywnych komponentów LYXT z etapu 1.1.4 do środowiska R, a następnie wykonaj analizę porównawczą, aby zidentyfikować związki powiązane zarówno z genami docelowymi, jak i przecinającymi się genami.
   2. Zaimportuj dane o relacjach złożonych z celami do Cytoscape w wersji 3.8.1 i wygeneruj diagram sieci "LYXT-Fever and cough-target", aby zwizualizować interakcje między składnikami aktywnymi a ich powiązanymi celami.
2. Pozyskiwanie danych o interakcjach białko-białko
   1. Zaimportuj plik ID genu dla przecięcia celów składników aktywnych LYXT oraz celów na gorączkę i kaszel uzyskanych w kroku 2.1.1 do bazy danych STRING o https://stringdb.org/, wybierz Homo sapiens jako gatunek, a wiele białek jako metodę przetwarzania danych.
   2. Filtruj interakcje białko-białko, ustawiając próg ufności na ≥ 0,90 i izolując białka o bardzo niskiej korelacji, a następnie generuj plik TSV zawierający filtrowane dane interakcji do dalszej analizy.
3. Potwierdzenie analizy przecięć
   1. Wykorzystaj język R do analizy przecięcia między białkami docelowymi składników aktywnych a białkami gorączki i kaszlu, potwierdzając nakładający się zestaw genów zidentyfikowany w kroku 1.2.7.
   2. Przygotuj ten potwierdzony nakładający się zestaw genów do dalszej analizy sieci interakcji białko-białko (PPI).

3. Przesiewowe badania kluczowych białek docelowych

1. Wizualizacja sieci PPI
   1. Zaimportuj przefiltrowane dane interakcji z kroku 2.2.2 do wersji Cytoscape 3.8.1 i użyj narzędzia do wizualizacji sieci, aby narysować diagram sieci PPI.
   2. Zainstaluj i otwórz wtyczkę CytoNCA w Cytoscape, a następnie użyj tej wtyczki do analizy topologicznej, obliczając następujące parametry dla każdego węzła w sieci: centralność stopnia (DC), centralność pomiędzy (BC), centralność bliskości (CC), centralność wektora własnego (EC), centralność sieci (NC) oraz średnia łączność lokalna (LAC).
2. Identyfikacja kluczowych białek docelowych za pomocą przesiewowego opartego na medianie
   1. Wyeksportuj obliczoną tabelę parametrów topologicznych z CytoNCA jako plik CSV zawierający wszystkie identyfikatory węzłów oraz odpowiadające im wartości DC, BC, CC, EC, NC i LAC.
   2. Oblicz medianę centralności stopni (DC) we wszystkich węzłach sieci i zidentyfikuj wszystkie węzły z DC większą niż dwukrotność mediany.
   3. Oblicz medianę wartości centralności bliskości (CC) i centralności pomiędzy (BC) we wszystkich węzłach sieci, a następnie z węzłów zidentyfikowanych w kroku 3.2.2 zachowaj tylko te węzły, które jednocześnie spełniają CC większą niż mediana i BC większą niż mediana, stosując podejście screeningu opisane przez Kibble'a i ^in.9.
3. Kompilacja docelowych kluczy końcowych
   1. Skompiluj identyfikatory zatrzymanych węzłów z kroku 3.2.3 do listy kluczowych białek docelowych i eksportuj tę listę jako plik CSV.
   2. Stosuj tę regułę selekcji opartą na medianie (DC ponad dwukrotnie medianą, CC większe niż mediana, BC większe niż mediana) jako jedyne kryterium identyfikacji kluczowych celów w całym manuskryptie, zapewniając spójność z jednolitym podejściem selekcyjnym ustanowionym w protokole.

4. Analiza wzbogacenia GO i analiza ścieżki KEGG

1. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego z wykorzystaniem bazy danych DAVID
   1. Zgodnie z metodą opisaną przez Tanabe i ^in.10, prześlij przecinającą się listę genów z kroku 1.3.4 w formacie symbolu genu do bazy danych DAVID o https://david.ncifcrf.gov/, ustaw gatunek na Homo sapiens, a typ listy na symbol genu.
   2. Przeprowadz analizę wzbogacenia GO, wybierając GOTERM_BP_DIRECT dla procesów biologicznych, GOTERM_CC_DIRECT dla komponentu komórkowego oraz GOTERM_MF_DIRECT dla funkcji molekularnej, a także analizę wzbogacenia szlaku KEGG poprzez wybór KEGG_PATHWAY.
   3. Ustaw próg istotności na p < 0,05 i zastosuj korektę Benjamini-Hochberga dotyczącą wskaźnika fałszywego wykrywania (FDR) dla wielu testów, a następnie pobierz wyniki wzbogacania jako pliki CSV zawierające nazwy terminów, liczbę genów, wartości p, wartości p skorygowane przez FDR oraz powiązane geny.
2. Generowanie wykresów bąbelków z wykorzystaniem platformy chmurowej OmicShare
   1. Zaimportuj wyniki wzbogacania GO z kroku 4.1.3 do platformy chmurowej OmicShare o https://www.omicshare.com/tools i wybierz narzędzie do tworzenia wykresów z bąbelkami wzbogacania GO.
   2. Prześlij plik wyników zawierający nazwy terminów, liczbę genów i wartości p, a następnie skonfiguruj narzędzie tak, aby wyświetlało 20 najwyższych terminów o najniższych wartościach p.
   3. Ustaw oś x, aby reprezentowała współczynnik wzbogacenia, oś y do wypisania terminów GO, rozmiar bąbelka do liczby genów, a kolor bąbelka do wartości p.
   4. Wygeneruj wykres bąbelkowy i pobierz go jako plik obrazu wysokiej rozdzielczości.
3. Wizualizacja ścieżek KEGG za pomocą mappera KEGG
   1. Posortuj wyniki wzbogacenia ścieżki KEGG według wartości p w kolejności rosnącej i wybierz 20 najlepszych ścieżek o najmniejszych wartościach p.
   2. Dla każdej wybranej ścieżki uzyskaj dostęp do bazy danych KEGG w https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html, aby uzyskać diagram ścieżek.
   3. Zidentyfikuj białka docelowe z listy przecinającej się genów, które występują w każdej ścieżce, poprzez porównanie z zestawami genów szlaku na podstawie wyników wzbogacenia.
   4. Uzyskij dostęp do narzędzia mapper KEGG o https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, wybierz funkcję Color Pathway , wprowadź listę przecinających się symboli genów oraz identyfikator szlaku KEGG i wygeneruj kolorowy diagram ścieżki z wyróżnionymi białkami docelowymi na czerwono.
   5. Skompiluj wszystkie wyniki analizy wzbogacania, w tym pliki CSV wzbogacania GO dla trzech kategorii: plik CSV wzbogacania ścieżki KEGG, obraz wykresu bąbelkowego oraz kolorowe diagramy ścieżek dla 20 najważniejszych ścieżek, a następnie wyeksportuj te pliki do dalszej analizy.

5. Weryfikacja dokowania molekularnego

1. Pobierz struktury 3D ważnych białek (takich jak CYP3A4 i POR zidentyfikowane jako kluczowe cele w analizie sieci) z bazy danych RCSB PDB w https://www.rcsb.org/, wybierając struktury o rozdzielczości ≤ 2,5 Å z Homo sapiens zawierające współkrystalizowany ligand do zdefiniowania miejsca aktywnego oraz pobierz pliki danych struktur związków aktywnych (w tym beta-karoten, spatulenol oraz beta-sitosterol) z bazy danych PubChem w formacie SDF.
2. Przygotuj struktury białkowe za pomocą AutoDockTools poprzez usunięcie cząsteczek wody i współkrystalizowanego liganda, dodanie wodorów polarnych i przypisanie ładunków Gasteigera, następnie zapisz przygotowane białka w formacie PDBQT, przekonwertuj złożone pliki SDF do formatu PDB za pomocą Open Babel, wykryj wiązania obrotowe dla każdego ligandu w AutoDockTools oraz zapisz ligandy w formacie PDBQT.
3. Zdefiniuj siatkę dokowania o wymiarach 60 × 60 × 60 Å, wycentrowaną wokół współrzędnych miejsca wiązania współkrystalizowanego ligandu, a następnie wykonaj dokowanie molekularne za pomocą AutoDock Vina z wyczerpowaniem ustawionym na 8 i num_modes ustawionym na 10, aby wygenerować 10 pozycji wiązania dla każdej pary ligand-białko.
4. Importuj powstałe pliki dokowania oraz odpowiadające im pliki docelowe do PyMOL, zidentyfikuj i zapisz model dokowania o najniższej energii wiązania (najbardziej ujemnej wartości) jako reprezentatywną pozę.
5. Następnie w https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ przesłać ten model do bazy danych PLIP, aby przeanalizować interakcje między małymi cząsteczkami a białkami, w tym wiązania wodorowe, interakcje hydrofobowe, układanie π oraz mosty solne.
6. Oblicz i skompiluj energie wiązania wszystkich aktywnych składników w LYXT względem białek docelowych związanych z gorączką i kaszlem, a następnie stwórz tabelę podsumowującą nazwy związków, białka docelowe, energie wiązania (kcal/mol) oraz kluczowe typy interakcji do prezentacji w sekcji wyników.
   UWAGA: Skrypt R używany do analizy farmakologii sieciowej jest dostępny w Pliku Uzupełniającym 1.

6. Eksperyment na zwierzętach

1. Harmonogram eksperymentu
   1. Przyzwyczaj zwierzęta przez tydzień, następnie wykonaj LPS lub podanie soli fizjologicznej w dniu 0, codziennie podawaj leki od 7 do 20 dnia przez 2 tygodnie oraz przeprowadz eutanazję z pobraniem próbki w dniu 21.
2. Pozyskanie i grupowanie zwierząt
   1. Kup 60 dorosłych samców C57BL/6 myszy ważących 25 ±± 4 g, karm myszy przez tydzień, a następnie losowo dziel je na grupę z normalną solą fizjologiczną (6 myszy) i grupę zranioną LPS (54 myszy).
   2. Na 7. dzień przed rozpoczęciem leczenia losowo podziel grupę z LPS na siedem podgrup po 6 myszy każda: grupa modelowa, grupa pozytywna (deksametazon, 50 mg·^kg-1·^d-1), grupa leczona LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), grupa beta-karotenowa (50 mg·^kg-1·^d-1), grupa spatulenolowa (50 mg·^kg-1·^d-1), oraz grupę beta-sitosterol (50 mg·^kg-1·^d-1).
      UWAGA: Przeprowadzanie leczenia i ocena wyników były zaślepione.
3. Model zapalenia płuc wywołanego LPS
   1. Podaj 2% pentobarbitalu sodu w dawce 60 mg/kg w celu znieczulenia. Potwierdzić umiarkowanie głębokości znieczulenia poprzez brak reakcji szczypania w ogon. Na koniec, na podstawie zarejestrowanej masy ciała, oblicz wymaganą objętość zastrzyku LPS w stężeniu 10 mg/mL.
   2. Przygotuj się do podania nosa, pobierając precyzyjnie obliczoną objętość roztworu LPS do pipety. Mocno trzymaj mysz, chwytając podstawę ogona prawą ręką, a kciukiem i palcem wskazującym lewej ręki delikatnie zabezpieczaj jej głowę za uszy.
   3. Wydychaj płyn powoli, aż na końcu pipety utworzy się mała kropla (około 2 μL). Ostrożnie przybliż kroplę do prawego nozdrza myszy, aż nawiąże kontakt. Natychmiast i szybko unieś lewą rękę w górę o 30–40 cm, a następnie delikatnie przywróć ją i mysz do pozycji wyjściowej.
      UWAGA: Konieczne jest zwracanie uwagi na nozdrza myszy, aby utrzymać stan uniesiony.
   4. Stosuj tę samą metodę, aby wstrzyknąć małe krople płynu do lewego nozdrza myszy i dodawać je kolejno do lewego i prawego nozdrza, aż infuzja płynu zostanie zakończona.
   5. Następnie puszczam mysz, mocuję mysz na desce taśmą i utrzymuj pozycję z brzuchem uniesionym i głową uniesioną przez ponad 4 godziny. Po przebudzeniu myszy należy ją z powrotem włożyć do klatki do obserwacji, stosując metodę opisaną przez Lorenza i ^in.11.
4. Zbieranie płynu płukającego oskrzelowo-pęcheolowego
   1. Losowo podziel myszy z grupy z LPS na siedem grup: grupę kontrolną z ujemnym urazem, grupę modelową, grupę pozytywną (deksametazon, 50 ^mg.kg-1.d-1), grupę leczoną LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), grupę beta-karotenową (50 ^mg.kg-1.d-1), grupę spatulenolową (50 ^mg.kg-1.d-1) oraz grupę beta-sitosterol (50 ^mg.kg-1.d-1), z sześcioma myszami w każdej grupie.
      UWAGA: Przygotuj LYXT w następujący sposób: Wymieszaj Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. i Zingiber officinale Roscoe w proporcji masowej 5:3:2. Proszek mieszaj z wodą w temperaturze 1:30 (g/mL) i refluks w 80 °C przez 2 godziny. Przefiltruj i koncentruj roztwór (30 °C, 0,01–0,08 MPa) i rozpuszczaj go w wodzie, aby przygotować roztwór o stężeniu 2 g/mL. Beta-karoten, beta-sitosterol i spatulenol były używane jako standardy referencyjne do walidacji eksperymentalnej. Podawaj leki każdej grupie raz dziennie przez 2 tygodnie, zaczynając tydzień po leczeniu LPS. Według Jin i ^in.12, należy uśpić zwierzęta przez przedawkowanie tiopentalu (100 mg/kg).
   2. Intubuj komorę kaniulą nr 23. Następnie powoli wstrzykuj 10 mL PBS do tkanki płucnej pod ciśnieniem 25 cm H₂O i powtórz tę płukanie około 6 razy, aby uzyskać płyn płukający oskrzelowo-pęcheolowy (BALF), zgodnie z metodą opisaną przez Pinheiro i ^in.13.
5. Analiza leukocytów i cytokin w BALF i surowicy
   1. Wirówka zebranego BALF w dawce 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 mL PBS, rozcieńczyć w proporcji 1:10 trypanowym niebieskim i liczyć leukocyty za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym przy 400× powiększeniu.
   2. Pobierz próbki supernatantu BALF i surowicy z punkcji serca.
   3. Mierz stężenia TNF-α, IL-1β i IL-18 za pomocą komercyjnych zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta, mierząc absorpcję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt oraz obliczając stężenia na podstawie standardowych krzywych. Określ stężenie białka w BALF za pomocą testu BCA.
6. Walidacja aktywnych składników za pomocą analizy HE i WB
   1. Aby zidentyfikować aktywne składniki przyczyniające się do skuteczności LYXT, należy ponownie ustanowić model zapalenia płuc wywołany LPS zgodnie z sekcją 6.3.
   2. Kup 60 myszy, aklimatyzuj się przez tydzień i losowo podziel na pięć grup (n = 12 każda): grupa modelowa, grupa LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), grupa beta-karotenu (50 mg·^kg-1·^d-1), grupa spatulenolowa (50 mg·^kg-1·^d-1) oraz grupa kombinowana (po 25 mg·^kg-1·^d-1 każda).
   3. Podawaj LPS w dniu 0, a leczenie od 7 do 20 dnia zgodnie z krokiem 6.3. W dniu 21 pobierz tkankę^{płucną 14}.
7. Analiza histologiczna
   1. Utrwalić górny płat lewego płuca 4% paraformaldehydem na 24 godziny, zagłębić w parafinę, przeciąć sekcje 5 μm i przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną (HE).
   2. Obejrzyj przekroje pod mikroskopem świetlnym z powiększeniami 200× i 400× aby ocenić infiltrację komórek zapalnych oraz pogrubienie ściany pęcherzyka żółtodziejowego. Uchwyć reprezentatywne obrazy.
8. Analiza zachodniej plamy
   1. Homogenizacja tkanki płucnej w buforze radioimmunoprecipitacyjnym (RIPA) za pomocą inhibitorów proteazy i fosfatazy. Wiruj w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i określaj stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
   2. Załaduj 30 μg białka na dołek na żele sodowe dodecylowo-poliakrylamidowe do elektroforezy (SDS-PAGE), przenieś do membran poliwinylidenu fluorku (PVDF) i blokuj mlekiem beztłuszczowym o stężeniu 5%.
   3. Inkubować przeciwciałami pierwotnymi przeciwko p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 i β-aktynie przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie stosować przeciwciała wtórne sprzężone z HRP.
      UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał jest przedstawione w Tabeli Materiałów.
   4. Wizualizuj pasma za pomocą podłoża ECL, rejestruj obrazy i ilościowo określaj intensywności za pomocą ImageJ. Normalizuj ekspresję białek docelowych do β-aktyny, czyli całkowitej wartości p38.

Wyniki

Baza danych TCMSP została wykorzystana do zebrania 409 aktywnych składników LYXT. Wśród nich 58 składników pochodziło z Verbena officinalis L., 86 z Semen Pharbitidis, a 265 składników aktywnych z Zingiber officinale Roscoe. Według indeksu przebadanych było dwadzieścia sześć kluczowych składników aktywnych: OB ≥ 30,1%, DL ≥ 0,12 dla Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, DL ≥ 0,13 dla Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93%, a DL ≥ 0,50 dla Semen Pharbitidis (Tabela 1).

...

Dyskusja

W artykule ten z powodzeniem zidentyfikowano 26 składników aktywnych oraz 207 potencjalnych celów LYXT, tradycyjnego wywaru z leku Dong stosowanego na gorączkę i kaszel. Kluczowe ustalenia obejmują identyfikację CYP3A4 jako kluczowego białka docelowego poprzez analizę topologii sieci oraz eksperymentalną walidację LYXT, beta-karotenu i spatulenolu jako substancji aktywnych o istotnym działaniu przeciwzapalnym w modelu zapalenia płuc wywołanego LPS. Wyniki te osiągnięto dzięki zintegrowanemu podejściu łączącemu farmakolog...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anty-IL-18	Proteintech, Wuhan, Chiny	27095-1-AP	Królik poliklonalny, 1:500
Anty-IL-1β	Proteintech, Wuhan, Chiny	66737-1-Ig	Myszy monoklonalny, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, Chiny	14064-1-AP	Królik poliklonalny, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, Chiny	28796-1-AP	Królik poliklonalny, 1:1000
Anty-TNF-&alfa;	Proteintech, Wuhan, Chiny	80258-6-RR	Królik monoklonalny, 1:500
Anti-β-aktyna	Proteintech, Wuhan, Chiny	66009-1-Ig	Mysz monoklonalna, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Wersja 1.5.6	Oprogramowanie dokujące molekularne
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Wersja 1.5.6	Narzędzie do przygotowania dokowania molekularnego
Zestaw do testowania białek BCA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225	Do określania stężenia białka
Beta-karoten	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Standard wysokiej czystości, >95%
Beta-sitosterol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	83-46-5	Standard wysokiej czystości, >95%
Myszy C57BL/6	Centrum Medycznych Zwierząt Uniwersytetu Lanzhou  	-	Dorosły mężczyzna, 25 lat i plusm; 4 g
Cytoscape	https://cytoscape.org/	Wersja 3.8.1	Oprogramowanie do wizualizacji i analizy sieci
Deksametazon	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D4902	Kontrola dodatnia
Podłoże ECL	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	WBKLS0500	Do wykrywania plam zachodnich
Zestawy ELISA
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/	Wersja 8.0 lub wyższa	Oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów
Hematoksylina i eozyna (H& E) Zestaw do bejcowania	Pekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekin, Chiny	G1120	Do barwienia tkanki płucnej
Histologia
Antymysie sprzężone z HRP	Proteintech, Wuhan, Chiny	SA00001-7G	Przeciwciało wtórne, 1:5000
Antykrólik sprzężony z HRP	Proteintech, Wuhan, Chiny	SA00001-7H	Przeciwciało wtórne, 1:5000
Zestaw IL-18 ELISA	Pekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekin, Chiny	SEKH-0016	Do pomiaru IL-18 w BALF i surowicy
IL-1β Zestaw ELISA	Pekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekin, Chiny	SEKM-0004	Do pomiaru IL-1β w BALF i surowicy
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Wersja 1.53	Oprogramowanie do analizy obrazów
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630	From  Escherichia coli   O111:B4
Surowce LYXT	Uniwersytet Huaihua	-	Mieszanka proszkowa  Pharbitis nil  (L.) Choisy,  Verbena officinalis L., i  Zingiber officinale  Roscoe (5:3:2, św/św/ś)
Inne materiały
Pentobarbital sodowy	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P3761	Roztwór 2% do znieczulenia
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Profiler interakcji białko-ligand
Membrany PVDF	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	IPVH00010	Dla Western blot transfer
PyMOL	https://pymol.org/	Wersja 2.5	Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
R	https://www.r-project.org/	Wersja 4.0 lub wyższa	Oprogramowanie do obliczeń statystycznych i grafiki
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N1205	Standard wysokiej czystości, >95%
STRING	https://stringdb.org/	-	Narzędzie wyszukiwania do wyszukiwania oddziałujących genów/białek
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Baza danych systemów medycyny tradycyjnej chińskiej
Tiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T102	Dla eutanazji
TNF-α Zestaw ELISA	Pekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pekin, Chiny	SEKM-0034	Do pomiaru TNF i alfa; w BALF i surowicy
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Baza danych sekwencji białek i adnotacji