Starzenie związane z neurodegeneracją: jednoczesna ocena aktywności β-gal i barwienia Nissl na sekcjach histologicznych mózgu gryzoni

Podsumowanie

Ten protokół prezentowany jest jako narzędzie do wykrywania aktywności selektywnej do β-galaktozydazy, do wykonywania barwienia Nissl w celu jednoczesnej oceny starzenia i integralności neuronów oraz do badania związków między obciążeniem senescencją a neurodegeneracją.

Streszczenie

Senescencja komórkowa to fizjologiczny proces charakteryzujący się nieodwracalnym zatrzymaniem cyklu komórkowego, które upośledza regenerację tkanek i ich funkcje. Zjawisko to stało się kluczowym czynnikiem neurodegeneracji, napędzane akumulacją senescentnych komórek w centralnym układzie nerwowym (OUN). Komórki senescentne nabywaja pro-zapalny senescentny fenotyp sekrecyjny (SASP), który utrzymuje przewlekłe zapalenie układu nerwowego i zakłóca mikrośrodowisko neuronów. W konsekwencji, takie istotne procesy jak neurogeneza, plastyczność synaptyczna i przeżywalność neuronów są upośledzone. Obszerna literatura łączy senescencję komórkową z kilkoma zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera czy stwardnienie rozsiane, oraz ostrymi uszkodzeniami neuronów, takimi jak niedokrwienie mózgu czy uraz mózgu.

Połączona ocena aktywności senescencji-związanej β-galaktozydazy (SA-β-gal) i barwienia Nissl w sekcjach histologicznych zapewnia kompleksowe podejście do oceny senescencji komórkowej i integralności neuronów jednocześnie w tym samym kontekście tkankowym. Strategia ta umożliwia precyzyjne przestrzenne korelowanie między akumulacją senescentnych komórek w określonych wrażliwych regionach (np. hipokamp czy kora) a utratą neuronów lub uszkodzeniem tkanki. Integrując funkcjonalny marker senescencji z klasycznym wskaźnikiem morfologii i gęstości neuronów, podejście to wzmacnia interpretacyjną solidność analizy. Ponadto, umożliwia bardziej dokładną charakterystykę relacji między obciążeniem senescentnym a zmianami neurodegeneracyjnymi, maksymalizując przy tym wydajność informacji z ograniczonych próbek tkankowych.

Ponadto, protokół ten może określić, jak nagromadzenie senescentnych komórek zachodzi w odpowiedzi na interwencje (farmakologiczne, manipulacja genetyczna itp.) w modelach gryzoni chorób neurodegeneracyjnych, zapewniając tym samym potężne narzędzie do analizy tego wkładu w ich patofizjologię.

Wprowadzenie

Senescencja komórkowa definiowana jest jako zasadniczo nieodwracalne zatrzymanie cyklu komórkowego w towarzystwie rozległych zmian makrocząsteczkowym¹. Co więcej, komórki senescencyjne nabierają hipersekrecyjnego fenotypu (SASP), charakteryzującego się intensywną sekrecją zróżnicowanego spektrum cytokin prozapalnych, czynników wzrostu i proteaz². Łącznie czynniki te przyczyniają się do powstania prozapalnego mikrośrodowiska, które wzmacnia senescencję i wpływa na homeostazę tkankową. W centralnym OUN komórki senescencyjne gromadzą się stopniowo wraz z wiekiem, szczególnie w regionach podatnych na patologię związaną z wiekiem³. Senescencja komórkowa odgrywa znaczącą rolę w funkcjonalnych zmianach związanych z starzeniem i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, przy czym ciężar senescencyjnych komórek zwiększa się stopniowo w trakcie normalnego starzenia się. Wiele typów komórek w OUN jest podatnych na senescencję, w tym astrocyty, mikrogleja, oligodendrocyty, neurony i komórki macierzyste⁴. Gromadzące się dowody implikują senescencję tych populacji komórek OUN w etiopatologii kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona, demencję frontotemporalną, stwardnienie zanikowe boczne i stwardnienie rozsiane⁵. Choroby neurodegeneracyjne zostały powiązane z senescencją komórkową⁶, a senescencyjne komórki wykazano, że gromadzą się w pobliżu płytek amyloidowych i splątków neurofibrylarnych. Wiek-związane zwiększenie aktywności SA-β-gal zostało opisane w mózgach gryzoni (np. 3, 8, 17 i 24 miesiące), przy czym statystycznie istotne wzrosty były najbardziej widoczne w najstarszej populacji (24 miesiące)⁷. 

Różne badania dostarczają ważnych informacji na temat związku między zmianami histologicznymi a wynikami funkcjonalnymi, takimi jak upośledzenie poznawcze i dysregulacja metaboliczna, w patologicznych modelach zwierzęcych, które dotyczą funkcjonalnych lub behawioralnych korelatów uszkodzenia mózgu^8,9.

Mimo rozległych badań, nie ma pojedynczego uniwersalnego markera, któryby niezawodnie identyfikował senescencyjne komórki, jednocześnie odróżniając je od innych stanów nieproliferacyjnych; jednakże, najczęściej stosowany marker senescencji komórkowej to enzym lizosomalny, senescencyjna β-galaktozydaza (SA-β-gal), wykrywana na pH 6, hydrolaza katalizująca hydrolizę β-galaktozydów na monosacharydy. Kluczowym czynnikiem rozróżniającym jest pH. SA-β-gal wykazuje optymalną aktywność na pH 6, w przeciwieństwie do bakteryjnej β-galaktozydazy, która działa na pH 7,4, i endogennej lizosomalnej β-galaktozydazy, która funkcjonuje na wartościach pH kwaśnym w zakresie od 3 do 5^7,10.

Gęstość komórkowa i cytoarchitektura mózgu są fundamentalnymi determinantami organizacji i funkcji neuronów. Przestrzenne rozmieszczenie i obfitość określonych populacji komórek są krytyczne dla funkcji obwodów, a ich dokładna kwantifikacji jest konieczna do badania neuropatologicznych stanów związanych z selektywną podatnością komórek lub ich utratą. Barwienie Nissl, standardowa metoda w neuronauce, jest szeroko stosowaną techniką histologiczną do oceny gęstości neuronów i cytoarchitektury w tkance nerwowej. Poprzez selektywne oznaczenie ciałek Nissl w ciałach komórek neuronów, ta metoda umożliwia niezawodną wizualizację i kwantifikację populacji neuronów w różnych regionach mózgu¹¹. Oprócz swojej trwałości, barwienie Nissl charakteryzuje się prostotą techniczną, niskimi kosztami i stosunkowo krótkim czasem przetwarzania, co czyni je praktycznym i dostępnym narzędziem do rutynowych badań neuroanatomicznych i neurodegeneracyjnych.

Połączona ocena barwienia Nissl i aktywności senescencyjnej β-galaktozydazy (SA-β-gal) w obrębie tej samej sekcji histologicznej zapewnia solidną, przestrzennie rozdzielczną ramę do jednoczesnego badania integralności neuronów i obciążenia senescencyjnymi komórkami. Ten integracyjny podchód umożliwia bezpośrednie zmapowane senescencji na regionowo specyficzne cechy neurodegeneracyjne, w tym utrata neuronów i zakłócenia cytoarchitektury. Połączenie klasycznego wskaźnika strukturalnego z funkcyjnym wskaźnikiem senescencji wzmacnia interpretację danych i ujawnia mechanizmy powiązań między gromadzeniem się senescencyjnych komórek a dysfunkcją tkanki, jednocześnie maksymalizując plon analityczny z ograniczonych próbek.

Co ważne, ta strategia jest szczególnie dobrze przystosowana do badań z ograniczoną dostępnością tkanki, projektów podłużnych lub opartych na interwencji (np. leczenie senolityczne lub senomorficzne) oraz analiz regionowo specyficznych w złożonych strukturach mózgu, gdzie korelowanie senescencji z podatnością neuronów jest kluczowe.

Protokół

Przeprowadzaj wszystkie zabiegi na zwierzętach zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i użytkowania, a także uzyskaj wcześniejszą aprobatę odpowiedniego komitetu etycznego. Niniejszy protokół zgodny jest z aktualnym meksykańskim normą urzędową dotyczącą opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (NOM-062-ZOO-1999(Muñoz, 2001)), wcześniejszą rewizją i aprobatą Komitetu Etykiety i Badań oraz Instytucjonalnego Komitetu Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi i ich Użytkowania (CICUAL) z Wydziału Medycznego, Narodowego Autonomicznego Uniwersytetu Meksykańskiego (FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023). Zwierzęta dostarczono z żywego domu z Unidad de Medicina Experimental, Wydziału Medycznego.

UWAGA: Aby umożliwić jednoczesną ocenę aktywności senescencjalnej β-galaktozydazy (SA-β-gal) i barwienia Nissl w tkankach mózgowych gryzoni, w tym protokole stosuje się 4% paraformaldehydem zafiksowane mózgi gryzoni, które są kriotymkowe w temperaturze -20 ± 1 °C. Wszystkie przekroje początkowo oceniane są pod kątem aktywności SA-β-gal (krok 1), następnie barwione Nissl (krok 2) i następnie montowane z środkiem antyfade (krok 3). Po przetworzeniu, slajdy bada się pod mikroskopem optycznym jasnolądowym, umożliwiając nabywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości obszarów o szczególnym zainteresowaniu dla dalszej analizy.

1. Przygotowanie przekrojów tkanki i wykrywanie aktywności senescencjalnej β-galaktozydazy (SA-β-gal)

1. Przygotowanie przekrojów mózgu
   1. Uzyskaj mózg przez perfuzję przez serce z paraformaldehydem w stężeniu 4% zgodnie z protokołem wcześniej opisanym przez Wu i wsp., 2021¹². Przenieś mózg do roztworu buforowanego fosforanem sodu (PBS) zawierającego 0,01% azydu sodu na długotrwałą przechowywanie w temperaturze 4 °C.
   2. Aby kontynuować protokół, umieść mózg w 30% roztworze sacharozy, poczekaj, aż się opadnie na dno, a następnie przechowuj w temperaturze -20 do -80 °C. Ten protokół można stosować w różnych tkankach mózgów gryzoni (np. u szczurów, myszy, świnki morskiej) i zamrażać w 2-metylobutanie.
   3. Kriotymkowe tkanka w temperaturze -20 ± 1 °C, aby uzyskać jednolite przekroje zatopione w związku o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) (20-40 μm grubości) i zamontowane na szlabanach pokrytych żelatyną.
   4. Załóż przekroje na szlabanach szklanych i przechowuj w chłodnych warunkach do momentu użycia.
2. Wykrywanie aktywności senescencjalnej β-galaktozydazy (SA-β-gal).
   1. Przygotuj roztwór barwnika SA-β-gal świeżo w dniu użycia z roztworów przedstawionych w Tabeli 1.
   2. Dostosuj pH roztworu do 6,0, aby zapewnić specyficzność aktywności SA-β-gal.
      UWAGA: Przygotuj roztwór barwnika SA-β-gal przed użyciem; unikaj wstępnego mieszania w roztworze wodnym.
      5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktozyd (X-Gal) nie jest stabilny w roztworze wodnym.
3. Równoważenie temperatury slajdu tkankowego.
   1. Wyjmij slajdy z chłodnego magazynu.
   2. Umieść slajdy w słoiku Coplina i pozwól im zrównoważyć się w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.
   3. Nawilżaj przekroje, dodając wystarczającą ilość PBS, aby pokryć slajdy w słoiku Coplina.
   4. Umieść slajdy na niskoprężnym mieszaczu orbitalnym przez 5 min w temperaturze RT.
   5. Powtórz płukanie raz.
4. Przygotuj slajdy do barwienia.
   1. Usuń nadmiar PBS delikatnie ze skrajów slajdu za pomocą papieru absorpcyjnego.
   2. Narysuj hydrofobową barierę wokół każdego przekroju za pomocą pióra z wodoodpornym barierą, unikając kontaktu z tkanką.
5. Przeprowadź barwienie SA-β-gal
   1. Umieść slajdy w komorze wilgotności.
   2. Za pomocą mikropipety dodaj około 200 μL roztworu barwnika na sekcję, zapewniając całkowite pokrycie tkanki.
   3. Inkubatoruj w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
   4. Po inkubacji usuń roztwór barwnika za pomocą papieru absorpcyjnego.
   5. Umieść slajdy w słoiku Coplina i dodaj PBS, aby pokryć slajdy, i umieść na niskoprężnym mieszaczu orbitalnym przez 5 min w temperaturze RT.
      UWAGI: Nie używaj inkubatora CO2. Przejdź natychmiast do barwienia Nissl.

2. Barwienie Nissl

1. Przygotuj roztwór roboczy Nissl
   1. Przygotuj roztwory bazowe zgodnie z opisem w Tabeli 2.
   2. Z roztworów bazowych przygotuj roztwór roboczy Nissl, mieszając 15 mL roztworu fioletu krezylowego z 85 mL bufora octanowego.

Wyniki

Połączenie zastosowania barwienia senescent-associated β-galaktozydazy (SA-β-gal) i barwienia Nissl pozwala na jednoczesne uwidocznienie obciążenia komórek senescencyjnych i cytoarchitektur neuronów w tym samym przekroju mózgu.

Po zastosowaniu procedury barwienia SA-β-gal (krok 1), badaj przekroje pod mikroskopem jasnopolowym. Pomyślne zabarwienie jest wskazane przez obecność wyraźnego niebieskiego osadu zlokalizowanych w komórkach wykazujących aktywność β-galaktozydazy (R...

Dyskusja

Obecnie ograniczona dostępność solidnych, specyficznych narzędzi do identyfikacji, izolacji i selektywnego usuwania senescentnych komórek w OUN pozostaje główną przeszkodą dla badań mechanizmowych. Ta metodologiczna luka ogranicza naszą zdolność do rozdzielenia przyczynowych wkładów senescencji komórkowej w neuropatologię od jedynie korelacji z postępem choroby. Prezentowany tu przepływ łączy wykrywanie enzymatyczne SA-β-gal z kontrastaniem Nissl w celu zmapowania domniemanego obciążenia senescentnymi komórkami w określo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-metylbutane	SIGMA	M32631-500ML
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktozyd (X-Gal)	PROMEGA	V394A	Przechowywać w temperaturze od -30 do -10 °C
Kwas cytrynowy	MERCK	251275-5G
Cresyl violet acetate	SIGMA	C5042-10G
Środek montujący DPX do histologii	SIGMA	06522-500ML
Papier filtrowy	Whatman	WHA1001929
Kwas octowy glacjalny	SIGMA	695092-500ML
Hydrofobowe pióro	MERCK	Z672548
Ksyleny klasy histologicznej	SIGMA	534056-500ML
Komora wilgotności	STAINTRAY	25501
Chlorku magnezu bezwodnego	SIGMA	M8266-100G	Dostosować molarność, jeśli stosuje się hydratowany chlorek magnezu.
OCT	SAKURA FINE TEK	4583
Buforowany roztwór fosforanowy (PBS)	SIGMA	P4417-50TAB	Stosowane są tabletki handlowe.
Feryocjanku potasu (heksacyanożelazo(III) potasu)	SIGMA	P8131-100G
Ferocyjanku potasu (heksacyanożelazo(II) potasu trihydrat)	SIGMA	P9387-100G
Bezvodny octan sodu	SIGMA	S2889-250G	Dostosować molarność, jeśli stosuje się hydratowany octan sodu.
Chlorku sodu	SIGMA	S9888-2.5KG
Fosforan sodu (fosforan sodu dwuzasadowy dwunastowodny)	SIGMA	71649-500G