Agregaty Pseudomonas aeruginosa wykazują zwiększoną tolerancję na antybiotyki i komórki odpornościowe. Rola integralności błony w przeżywalności agregatu jest obecnie niedostatecznie zbadana. Badanie to demonstruje metodę ilościowego określania zmian dynamiki błon komórkowych w agregatach P. aeruginosa, aby zrozumieć, jak integralność komórkowa może wpływać na ogólną żywotność agregatów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi na stres wywołany przez gospodarza w agregatach Pseudomonas aeruginosa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przewlekłe infekcje, takie jak mukowiscydozy (CF), są podtrzymywane przez małe, bardzo tolerancyjne agregaty Pseudomonas aeruginosa , które utrzymują się mimo presji immunologicznej i terapeutycznej. W przeciwieństwie do klasycznych biofilmów, te agregaty stanowią odrębną jednostkę patogenną – mikroskalowe, przestrzennie zorganizowane społeczności, które zachowują integralność strukturalną i fizjologiczną homeostazę pod wpływem stresu wywołanego przez gospodarza. Jednak mechanizmy umożliwiające pozostanie agregatów nienaruszonych w tych warunkach oraz czy procesy homeostatyczne mogą być selektywnie zakłócane, pozostają słabo zdefiniowane. Kluczową barierą w wypełnieniu tej luki był brak narzędzi zdolnych do uchwycenia dynamicznych, przestrzennie rozdzielonych procesów łączących napięcia fizjologiczne ze stabilnością strukturalną i zapadaniem się w czasie rzeczywistym. Badanie to przedstawia zintegrowany proces obrazowania i analityki do ilościowego określenia zbiorczych reakcji na stresory związane z gospodarzem. Za pomocą barwnika wrażliwego na napięcie DiBAC4(5) monitorowano depolaryzację błony jako wczesny wskaźnik zaburzenia fizjologicznego w agregatach powstałych w syntetycznym nośniku plwociny mukowiscydozy (SCFM2). Wysokorozdzielcza mikroskopia konfokalna poklatkowa umożliwia wizualizację agregatów zarówno w stanach stabilnych, jak i stresowych, podczas gdy segmentacja obrazów i analiza wokselowa zapewniają ilościowe mapowanie heterogeniczności przestrzennej w integralności błony oraz rozkładu agregatów w rozdzielczości pojedynczych komórek. Ten workflow tworzy powtarzalną i adaptowalną platformę łączącą stres fizjologiczny z efektami strukturalnymi w wielokomórkowych agregatach bakteryjnych. Umożliwiając ilościową analizę procesów, które zachowują – lub kompromitują – integralność agregatów, podejście to stanowi kluczową podstawę do identyfikacji i ukierunkowania na mechanizmy homeostatyczne leżące u podstaw odporności agregatów, rozwijając nowe strategie zakłócania tego klinicznie istotnego sposobu utrzymywania się bakterii.
Wprowadzenie
Przewlekłe infekcje bakteryjne często są podtrzymywane nie przez duże, przymocowane do powierzchni biofilmy, lecz przez małe, wielokomórkowe agregaty tworzące się w środowiskach związanych z gospodarzem. W mukowiscydozie (CF) i innych przewlekłych chorobach dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa najczęściej występuje jako zawieszone agregaty osadzone w śluzie lub plwocinie, a nie jako klasyczne biofilmy przyczepione do powierzchni nabłonka. Agregaty te reprezentują odrębny sposób wzrostu, charakteryzujący się mikroskalową organizacją przestrzenną, wyraźną heterogenicznością fizjologiczną oraz wyjątkową tolerancją na stresory immunologiczne i przeciwbakteryjne 1,2,3,4. Pomimo ich znaczenia klinicznego, mechanizmy rządzące stabilnością agregatu, które w tym protokole definiowane są jako zdolność do utrzymania integralności błony i organizacji przestrzennej pod takimi stresorami, pozostają słabo poznane, a wcześniejsze badania koncentrowały się bardziej na komponentach macierzy wspierających powstawanie biofilmu przymocowanego do powierzchni 5,6.
Główną przeszkodą w badaniu zdarzeń przyczyniających się do destabilizacji agregatów, takich jak zmiany w depolaryzacji membran i architekturze agregatu, jest brak eksperymentalnych procesów rejestrujących dynamiczne zmiany fizjologiczne i strukturalne w czasie rzeczywistym 7,8. Tradycyjne testy masowe i podejścia obrazowania końcowego nie są w stanie wyjaśnić, jak reakcje stresowe pojawiają się w agregatach, jak te odpowiedzi są rozłożone przestrzennie ani jak osłabienie fizjologiczne, takie jak depolaryzacja błon i utrata homeostazy jonów, przekłada się na wczesne oznaki stresu komórkowego i ostatecznego fizycznego upadku. Chociaż mikroskopia konfokalna była szeroko stosowana w biofilmach przymocowanych do powierzchni, coraz mniej podejść integruje obrazowanie czasowe z analizą ilościową, która bezpośrednio łączy fizjologię komórkową z architekturą agregatów i aktywnością błony.
Zmiany w potencjale błon bakteryjnych stanowią wczesny i wrażliwy wskaźnik stresu komórkowego i utraty homeostazy. Barwniki wrażliwe na napięcie, takie jak bis-(1,3-dibutylbarbiturowy kwas), pentametaninowy oksonol (DiBAC4(5)) kumulują się w komórkach depolaryzowanych i zapewniają nieniszczący, fluorescencyjny odczyt integralności błony. Chociaż barwniki DiBAC były stosowane do oceny depolaryzacji błon w kulturach planktonowych i biofilmach przymocowanych na powierzchni 9,10, ich zastosowanie do agregatów wielokomórkowych, szczególnie w warunkach fizjologicznie istotnych wzrostu i obrazowaniu poklatkowym, było ograniczone.
Przedstawiamy tutaj zintegrowany proces obrazowania i analizy, który umożliwia wizualizację i ilościową identyfikację depolaryzacji błon oraz uszkodzeń strukturalnych w agregatach P. aeruginosa w czasie rzeczywistym. Agregaty powstają w syntetycznym ośrodku plwociny mukowiscydozy (SCFM2), chemicznie zdefiniowanym medium, które odtwarza kluczowe cechy odżywcze i jonowe dróg oddechowych CF oraz wspiera spontaniczne powstawanie agregatów bez narzucania powierzchni czy przepływu11,12. W tych warunkach P. aeruginosa tworzy zawieszone agregaty o rozmiarach i heterogeniczności strukturalnej porównywalnej z tymi obserwowanymi w próbkach plwociny i dróg oddechowych CF, co stanowi fizjologicznie istotną platformę do badania zachowań agregatów13.
Korzystając z konfokalnej mikroskopii laserowej skanującej poklatkowej w kontrolowanej temperaturze i wilgotności, ten proces rejestruje zarówno stabilne stany agregatu, jak i stany wywołane stresem, charakteryzujące się zwiększoną depolaryzacją błon i utratą homeostazy komórkowej w dłuższych okresach obrazowania. Łącząc raportowanie potencjału błonowego oparte na DiBAC z obrazowaniem z-stack o wysokiej rozdzielczości, metoda ta umożliwia ilościową identyfikację fluorescencji DiBAC₄(5) na poziomie pojedynczych komórek, z mapowaniem i analizą wartości w kontekście przestrzennym poszczególnych agregatów. Segmentacja obrazów w dalszej części oraz analiza powierzchni oparta na wokselach pozwalają na równoległe kwantyfikowanie zmian w architekturze agregatów i depolaryzacji membran.
Co ważne, choć protokół ten jest demonstrowany przy użyciu agregatów P. aeruginosa utworzonych w SCFM2, workflow jest szeroko uogólnialny. Strategia obrazowania, odczyt fizjologiczny oparty na barwnikach oraz ramy analityczne mogą być łatwo dostosowane do innych gatunków bakterii, mediów promujących agregaty oraz czynników stresowych, w tym środków przeciwdrobnoustrojowych, efektorów odpornościowych czy zakłóceń środowiskowych. W związku z tym takie podejście zapewnia przenośną i powtarzalną platformę do badania stabilności społeczności bakteryjnych w różnych kontekstach eksperymentalnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Cała praca z P. aeruginosa musi być prowadzona w odpowiednich warunkach izolacji BSL-2 oraz w uzyskaniu instytucjonalnych zatwierdzeń biobezpieczeństwa. Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Generowanie agregatów Pseudomonas aeruginosa w syntetycznym podłożu wybliwiny mukowiscydozy (SCFM2)
UWAGA: Ten etap opisuje przygotowanie hodowli P. aeruginosa oraz tworzenie zawieszonych wielokomórkowych agregatów w warunkach fizjologicznie istotnych, które naśladują środowisko dróg oddechowych CF.
- Przygotowanie hodowli bakteryjnych
- Dzień przed eksperymentem inokuluj dziki typ Pseudomonas aeruginosa PAO1 przenoszący plazmid pMRP9-1 (GFP)14 z zamrożonych zapasów glicerolu do bulionu lizogenicznego o pojemności 5 mL (LB).
- Dodaj karbenicylinę (300 μg/mL), aby utrzymać selekcję plazmidów.
- Uprawiaj kultury przez noc w temperaturze 37 °C z potrząskami przy 200 obr./min.
- Rozcieńczenie zwrotne i przygotowanie do powstawania kruszywa
- W dniu eksperymentu hodowle rozcieńcza się nocne hodowle w stosunku 1:5 (1 mL przez noc: 4 mL LB). Na tym etapie antybiotyki nie są ponownie dodawane; pozostałość jest minimalna i nie wpływa na wzrost).
- Hodować hodowle przez ~2 godziny w 37 °C z potrząskami (200 obr./min), aby osiągnąć fazę logarytmiczną.
UWAGA: Komórki zazwyczaj znajdują się we wczesnej fazie wykładniczej po ~2 godzinach w tych warunkach. Dodatkowo komórki są następnie płukane przed zaszczepieniem do SCFM2, aby zminimalizować pozostałości antybiotyku.
- Przygotowanie i równowaga SCFM2
- Około 30 minut przed końcem okresu rozcieńczania wstecznego, aliquot przygotowany wcześniej SCFM2 do jałowych rurek i podgrzewający do 37 °C.
- Do obrazowania w czterodołowej szklanej matce optycznej należy przydzielić 500 μL SCFM2 na wgłębienie. Przygotuj nadmiar objętości, aby uwzględnić błąd pipetowania.
UWAGA: SCFM2 przechowywany jest w temperaturze 4 °C. Wstępne nagrzewanie minimalizuje szok termiczny i poprawia powtarzalność powstawania kruszywa.
- Płukanie i standaryzacja inokulum
- Hodowla pelletów przez wirowanie w 4200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Jeśli wymagane są obliczenia do obrotów, promień wirnika obrotowego wirnika kubełkowego wynosi 172 mm. - Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellety w 3 mL jałowego PBS (pH 7,0).
- Powtórz kroki mycia jeszcze dwa razy (łącznie trzy mycia).
- Zmierz OD₆₀₀ i oblicz objętość potrzebną do zaszczepienia SCFM2 do początkowego OD₆₀₀ 0,05.
- Krótko zawiruj w celu ujednolicenia komórek i inokuluj każdą studnię zawierającą 500 μL SCFM2.
- Hodowla pelletów przez wirowanie w 4200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
- Powstawanie kruszyw w warunkach statycznych
- Inkubowany szczepionik SCFM2 statycznie w 37 °C przez 4 godziny, aby umożliwić powstawanie kruszywa.
UWAGA: 4-godzinna inkubacja powtarzalnie daje zawieszone agregaty o rozmiarach i niejednorodności porównywalnych z tymi obserwowanymi w próbkach plwociny i dróg oddechowych CF, minimalizując jednocześnie późniejsze stadium dojrzewania biofilmu 1,15.
- Inkubowany szczepionik SCFM2 statycznie w 37 °C przez 4 godziny, aby umożliwić powstawanie kruszywa.
2. Przygotowanie stresora immunologicznego (ludzka elastaza neutrofilowa)
UWAGA: Ten etap opisuje przygotowanie stresora pochodzącego od gospodarza, używanego do wywołania stresu komórkowego i destabilizacji agregatów bakteryjnych.
- Odbudowa i magazynowanie ludzkiej elastazy neutrofylowej (HNE)
- Rekonfunduj ludzką elastazę neutrotylową zgodnie z zaleceniami producenta, używając 50 mM octana sodu, 200 mM NaCl i sterylnej wody.
- Przygotuj roztwór wywarowy o pojemności 50 μg/l i sterylizuj filtrem 0,2 μm.
- Należy zastosować w objętościach 50 mL i przechowywać w temperaturze −20 °C.
- Noc przed użyciem rozmroz aliquot w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Alicytowanie minimalizuje cykle zamrożenia i rozmrażania, co może zmniejszyć aktywność enzymatyczną i wprowadzać zmienność. Aliquoty są stabilne w temperaturze 4 °C przez około 1 miesiąc.
3. Przygotowanie i zastosowanie DiBAC4(5) do raportowania depolaryzacji błonowej
UWAGA: Ten etap opisuje przygotowanie i użycie barwnika wrażliwego na napięcie do wizualizacji depolaryzacji błony w agregatach.
- Przygotowanie i przechowywanie DiBAC4(5)
- Zacznij od przygotowania roztworu zapasowego DiBAC4(5). Rekonstytuować proszek DiBAC4(5) w bezwodnem DMSO do 1 mg/mL.
UWAGA: Rekonstrukcja DiBAC4(5) w DMSO jest zgodna ze standardowymi zaleceniami producenta. - Należy je wyłożyć do objętości 100 μL i przechowywać w temperaturze −20 °C, chronionej przed światłem.
- Używaj każdego aliquota nie więcej niż dwa razy.
UWAGA: DiBAC4(5) jest funkcjonalnie równoważny DiBAC4(3), ale tutaj wybrany, aby odpowiadać widmom wzbudzenia/emisji GFP. W tym protokole DiBAC4(3) jest używany tylko do dodatkowego barwienia omówionego w sekcji wyników. Głównym barwnikiem stosowanym w tym protokole jest DiBAC4(5).
- Zacznij od przygotowania roztworu zapasowego DiBAC4(5). Rekonstytuować proszek DiBAC4(5) w bezwodnem DMSO do 1 mg/mL.
4. Konfokalne obrazowanie czasowo-poklatkowe depolaryzacji błon w agregatach P. aeruginosa
UWAGA: Ten etap opisuje pozyskiwanie wysokorozdzielczych, czasowo rozdzielonych obrazów konfokalnych w celu uchwycenia dynamicznych zmian fizjologicznych i strukturalnych w agregatach.
- Przygotowanie mikroskopu i komory środowiskowej
- Zamontuj podgrzewaną wkładkę mikropłytową lub komorę środowiskową na stole mikroskopu konfokalnego.
- Włącz kontrolę temperatury i wilgotności co najmniej godzinę przed zdjęciami i ustaw na 37 °C.
- W zakładce Akwizycja znajdź zakładkę Laser i około godzinę przed użyciem włącz wymagane lasery, aby umożliwić odpowiednie rozgrzewanie (laser argonowy dla GFP; DPSS 561-10 dla DiBAC4(5)) (Rysunek uzupełniający 1A).
UWAGA: Stabilna kontrola środowiskowa zmniejsza dryf ostrości i zachowuje integralność agregatu podczas eksperymentów z długim poklatkowym czasem.
- Zastosowanie stresora odpornościowego
- Po 4 godzinach formowania kruszywa dodaj HNE do studni eksperymentalnych do końcowego stężenia 20 μg/L16.
- Nie lecz dołków kontrolnych.
- Przenieś czterodołkowy talerz na stopień mikroskopu.
UWAGA: HNE przygotowywano w stężeniach fizjologicznie istotnych (μg/L), na podstawie zgłoszonych poziomów w wywołanej plwocinie, a nie jako skoncentrowany zapas. Stężenia użyte w tym badaniu można znaleźć u McGarvey i in.16 w IS (indukowana plwocina), NE-AAT (kompleks NE/a1-antytrypsyna), HV (zdrowy dobrowolnik).
- Identyfikacja łącznych regionów zainteresowania
- Korzystając z zakładki Locate i obiektywu 20×, włącz Światło przepuszczone , aby zidentyfikować obszary bogate w agregaty za pomocą obrazowania w jasnym polu (Ilustracja uzupełniająca 1B).
- Wciąż korzystając z obrazowania w świetle jasnym, przejdź do zakładki Akwizycja i zapisz współrzędne x, y i z za pomocą modułu Pozycji (Rysunek Uzupełniający 1C).
- Powtarzaj to dla wielu technicznych replikacji na odwiert.
- Wysokorozdzielczość stosu z-stack i pozyskiwanie szeregów czasowych
- Przesuń się na zapisaną pozycję i przełącz na cel z olejem 63× zanurzenia.
- Przed ustawieniem naczynia nałóż olej do zanurzenia.
- W zakładce Akwizycja konfiguruj kanały za pomocą Smart Setup (Ilustracja uzupełniająca 1D): GFP (488/509 nm) – przypisz zielony, DiBAC4(5) (591/615 nm) – przypisz czerwony.
- Przejdź do widoku na żywo , następnie za pomocą modułu Z-stack zidentyfikuj dolną część pokrywy pokrywy, regulując precyzyjne ostrzenie, a następnie ustaw ją jako pierwszą pozycję z-position klikając Set First (Ilustracja Uzupełniająca 1E).
- Przesuwaj się w górę, aż zakres pokaże 60 μm, a następnie ustaw ostatnią pozycję z, klikając Set Last (Ilustracja Uzupełniająca 1E).
- Wyłącz widok na żywo i aktywuj Definite Focus. Wybierz Znajdź powierzchnię, a następnie Zapisz Skupienie dopiero wtedy, gdy status wskazuje na Odruch Znaleziono (Ilustracja uzupełniająca 1F).
- Powtarzaj kalibrację ostrości dla każdej zapisanej pozycji, używając modułów Z-stack i Definite Focus .
- Konfiguruj akwizycję szeregów czasowych tak, aby obrazować każdą pozycję co 3 minuty przez 6 godzin (Ilustracja Uzupełniająca 1G).
UWAGA: Protokół można tu wstrzymać w celu rozmrażenia, dodania i inkubacji barwnika DiBAC4(5), a po upływie okresu inkubacji można go wznowić. - Wybierz Start Eksperyment.
UWAGA: Interwały trzyminutowe równoważą rozdzielczość czasową z uwzględnieniem fototoksyczności i fotobieleniem.
- Dodawanie i inkubacja DiBAC4(5)
- Dodaj DiBAC4(5) do każdego odwiertu do końcowego stężenia 5 μg/mL9.
- Inkubuj w ciemności przez 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania poklatkowego.
UWAGA: Ta inkubacja pozwala na wyrównanie równowagi barwnika przy jednoczesnym minimalizowaniu fluorescencji tła.
5. Ilościowa analiza obrazów struktury agregatu i współlokalizacja DiBAC4(5)
UWAGA: Ten krok opisuje ilościowy workflow łączący depolaryzację membran z architekturą agregatów i destabilizacją.
- Import obrazu i rozdzielanie kanałów
- Przesyłaj pliki obrazów (.czi lub odpowiednik) do oprogramowania Imaris x64 w wersji 10.2.0 lub wyższej.
- Zweryfikowaj kalibrację woksela, sprawdzając, czy wymiary pikseli x, y i z (rozmiar wokselu) w metadanych obrazu dokładnie odzwierciedlają parametry akwizycji konfokalnej (obiektyw, powiększenie, rozmiar kroku z). Nieprawidłowa kalibracja prowadzi do błędów w pomiarach przestrzennych i objętościowych.
- Powierzchniowe renderowanie agregatów bakteryjnych i sygnału DiBAC4(5)
- Użyj modułu Surfaces do renderowania agregatów P. aeruginosa :
- W sekcji Segmentation Setup wybierz kanał GFP (Ilustracja uzupełniająca 2A).
- Wybierz opcję Włącz Podzielenie Obiektów Dotykających (Region Growing) i dostosuj próg intensywności, aby w pełni uchwycić agregaty (Ilustracja Uzupełniająca 2B).
- W module Filter Seed Points zmień typ filtra na Liczbę Voxels Img = 1 i ustaw na 90% (Ilustracja uzupełniająca 2C).
- Po przetworzeniu renderowania ustaw powierzchnie na 100% (Ilustracja uzupełniająca 2D).
- Zakończ renderowanie i przypisz zielone zabarwienie powierzchniom bakterii (Rysunek uzupełniający 2E).
- Powtórz renderowanie dla kanałuDiBAC 4(5) i przypisz kolor czerwony.
- Użyj modułu Surfaces do renderowania agregatów P. aeruginosa :
- Kolokalizacja i ilościowość oparta na objętości
- Wybierz renderowanie powierzchni DiBAC4(5) (Rysunek uzupełniający 3A) i określ, w którym punkcie czasowym zostanie wykonana analiza współlokalizacji.
- Przejdź do Statystyki > zakładce Szczegóły > Wartości Konkretne (Rysunek Dodatkowy 3B).
- Zdefiniuj współlokalizację poprzez wybór obiektów o najkrótszej odległości do powierzchni bakterii wynoszącej 0,00 (Ilustracja uzupełniająca 3B).
- Znajdź Edituj, a następnie zduplikuj te obiekty, aby wygenerować powierzchnię nakładającą się na komórki DiBAC (Ilustracja uzupełniająca 3C). Upewnij się, że ta powierzchnia zmienia nazwę, aby podkreślić jej nakładające się właściwości.
- W zakładce Szczegóły w sekcji Wartości Średnie zapisz sumę wartości objętości w każdym wybranym punkcie czasowym dla: (1) sygnału Total DiBAC4(5) (Ilustracja uzupełniająca 3D); (2) Współlokalizowany sygnał DiBAC4(5) (Rysunek uzupełniający 3E).
- Oblicz procentowe nakładanie się jako:
UWAGA: Procentowe nakładanie odzwierciedla proporcję sygnału DiBAC₄(5) związanego z komórką w agregatach, co odzwierciedla depolaryzację błony w danym momencie czasu.
UWAGA: Chociaż wykazano to przy użyciu agregatów P. aeruginosa w SCFM2 i jest obciążone HNE, ten proces jest szeroko adaptowalny do innych gatunków bakterii, mediów promujących agregaty, fluorescencyjnych reporterów oraz stresorów, w tym środków przeciwdrobnoustrojowych lub zakłóceń środowiskowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W opisanym powyżej protokole przewidziana jest metoda śledzenia zmian w dynamice błon agregatów P. aeruginosa modelowanej w środowisku mukowiscydozy płuc (Rysunek 1). Używając dzikiego szczepu PAO1 niosącego plazmid pMRP9-1 (GFP) (Rysunek 1A), HNE do symulacji stresu immunologicznego oraz barwnika błonowego DiBAC4(5) (Rysunek 1C), zidentyfikowano zmiany w depolaryzacji błony, odzwierciedlające za...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Potencjał błonowy służy jako wrażliwy, wczesny odczyt stresu komórkowego i zaburzonej homeostazy. W wielokomórkowych agregatach bakteryjnych te zmiany fizjologiczne zachodzą przed i mogą powodować późniejszą destabilizację strukturalną. Przedstawiamy tutaj proces oparty na obrazowaniu, który wykorzystuje powolną reakcję, potencjalnie wrażliwy barwnik bis-(1,3-dibutylbarbiturowy) pentametany-oksonol (DiBAC4(5)) do śledzenia depolaryzacji w agregatach Pseudomonas aeruginosa narażonych na stres pochodząc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
S.E.D jest wspierany przez fundusze początkowe zapewnione przez Department of Molecular Medicine Uniwersytetu Południowej Florydy oraz granty badawcze od Cystic Fibrosis Foundation (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,3-dibutylbarbiturowy kwas pentametynowy oksonol (DiBAC4(3)) | AAT Bioquest | 21411 | lipofilowe, anionowe cząsteczki |
| 1,3-dibutylbarbiturowy kwas pentametynowy oksonol (DiBAC4(5)) | AAT Bioquest | 21410 | lipofilowe, anionowe cząsteczki |
| Karabenicylina | Produkty badawcze międzynarodowe | C46000-5.0 | używany do selekcji GFP wyrażających szczepy PAO1 |
| Cellvis 4-komorowa szklana płytka dna 35mm | Fisher | NC0600518 | Szklana miska z dnem pozwala na utrzymanie zawieszonych kruszyw w podłożu wzrostu podczas obrazowania |
| Wirówka | Beckman Coulter Life Sciences | B06320 | w połączeniu z obrotowym wirnikem łybek Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (nr części B01425) |
| Konfokalny mikroskop laserowy skanujący (CLSM) | Zeiss | LSM 880 | model CLSM używany w eksperymentach opisanych w tym protokole nie jest już dostępny, ale LSM 900 jest zaktualizowaną opcją równoważną |
| Rurki hodowli | Genesee | 21-130 | sterylny; polipropylen |
| DAPI | Thermo Fisher | 62248 | Stosowany w proponowanych przyszłych zastosowaniach barwienia neutrofilów DiBAC4(5) |
| Jednorazowe kuwety | Brand Tech | 759086D | 1,5 mL, półmikro |
| DMSO | Millipore-Sigma | 276855-100ML | używany do odtworzenia DiBAC4(3,5) |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 65-0880-92 | Stosowany w proponowanych przyszłych zastosowaniach barwienia neutrofilów DiBAC4(3) |
| Izba Środowiskowa dla CLSM | PECON | LSM 880 | system ten został stworzony wyłącznie dla produktów Zeiss i powszechnie nazywany jest "Systemem Inkubacji S", a wszystkie komponenty można zamówić przez Zeissa jako uzupełnienie systemu LSM 880 (lub podobnego) |
| siarczan gentamycyny | Fisher | BP918-1 | używany do wyboru RFP wyrażających szczepy PA1633 |
| Glicerol & nbsp; | Genesee | 18-205 | stosowany do zamrażania szczepów do długotrwałego przechowywania w stężeniu -80 ° C |
| Ludzka elastaza neutrotylowa (HNE) | Millipore-Sigma | 324681-50UG | po odtworzeniu pozostaje stabilny przez 1 miesiąc na poziomie 4 ° C lub 1 rok na 20 ° C |
| Oprogramowanie Imaris x64 | Oxford Instruments | Wersja 10.2.0 | |
| Olej immersyjny | Mikroskopia elektronowa Scienes | 16919-12 | niesuszący; standaryzowane na 37 ° C |
| Inkubator | Benchmark Scientific | H1001-M | zdolny do drżenia |
| Bulion lizogenetyczny (LB) | Genesee | 11-118 | Miller Mix |
| mCherry plasmid | uzyskane od współpracownika | ||
| PA1633 transpozon mutantny szczep | uzyskane od współpracownika | ||
| Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS) | Thermo Fisher | 3002 | pH 7,0 |
| Octan sodu | Thermo Fisher | AM9740 | 3M; pH 5,5; RNase free |
| Chlorek sodu | Fisher | S271-500 | wykorzystywany do rekonstrukcji HNE |
| Spektrofotometr | VWR | 634-0882 | używany do pomiaru gęstości komórek w celu inokulacji PAO1/PA1633 do SCFM2 |
| Sterylny .22µ Filtr m | Genesee | 25-244 | Używany do oczyszczania odtworzonego HNE |
| Rurki sterylnej mikrowirówki | Genesee | 24-272LR | 0,6 mL |
| Sterylna strzykawka | Fisher | 14955459 | Używany do oczyszczania odtworzonego HNE |
| SX4400 kołyszący się rotor kubełowy | Beckman Coulter Life Sciences | B01425 | w połączeniu z wirówką Beckman Coulter Life Sciences (część nr B06320) |
| Syntetyczne medium plwociny z mukowiscydozą (SCFM2) | SyntheBiome | 10002-500 | Partia #: 001-CF2-0724 |
| Ultra czysta woda | Genesee | 18-195 | wykorzystany do odbudowy HNE |
| Dziki typ Pseudomonas aeruginosa PAO1 z plazmidem pMRP9-1 | Ten plazmid pMRP9-1 zawiera GFP i wykazuje oporność na karbenicylinę | ||
| ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging software | Zeiss | kompatybilny z LSM 880 |
Bibliografia
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
- Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
- Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
- Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
- Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
- Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
- Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
- Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
- Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
- Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
- Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
- Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
- Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
- Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
- Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
- Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
- Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.