Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w fibroblastach ludzkich IMR-90.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Senescencja komórkowa to stabilny stan zatrzymania cyklu komórkowego związany z charakterystycznymi fenotypami, w tym powiększoną morfologią komórek, zmienionymi sygnałami sekrecyjnymi i wyraźną przebudową lizosomu. Komórki senescencyjne zwykle wykazują rozszerzenie kwaśnego przedziału endo-lizosomalnego, któremu towarzyszą zmiany w kwasowości światła i zdolności degradacyjnej, co stwarza możliwość prostych pomiarów żywych komórek związanych z przebudową organelli związaną z senescencją. Praca opisuje protokół obrazowania żywych komórek, który wykorzystuje LysoTracker Deep Red, kwasowy fluorescujący barwnik, aby zapewnić pośredni, zależny od pH zastępczy wskaźnik kwaśnego przedziału organelli jako korelat obciążenia senescencją. Metoda jest demonstrowana na ludzkich fibroblastach płucnych IMR-90 przechodzących replikacyjną senescencję w trakcie kolejnych przeszczepów. Protokół szczegółowo opisuje hodowlę komórek i śledzenie przeszczepów, barwienie LysoTracker, obrazowanie fluorescencyjne i oparte na obrazie pomiary intensywności sygnału lizosomalnego oraz obszaru sygnału dodatniego na komórkę. Barwienie senescencyjnej β-galaktozydazy (SA-β-Gal) na równoległych kulturach jest dołączone jako opcjonalny marker potwierdzający, a nie jako standard odniesienia. Przedstawione wyniki pokazują wyższy sygnał kwasowego fluorescującego barwnika i większe regiony lizosomu dodatnie w kulturach późnego przeszczepu niż w kontrolach wczesnego przeszczepu, co jest zgodne z rozszerzeniem kwaśnego przedziału organelli podczas senescencji. Ponieważ odczyt zależy od objętości przedziału, gradientu protonów i dostępności barwnika, najlepiej interpretować go jako pośredni korelat przebudowy lizosomu, a nie bezpośrednie miara liczby lub biogenezy lizosomu. Protokół jest prosty w adaptacji i może być dostosowany do innych typów komórek lub stresów indukujących senescencję, zapewniając praktyczną, ilościową alternatywę dla konwencjonalnych testów końcowych.
Wprowadzenie
Senescencja komórkowa to trwały program zatrzymania cyklu komórkowego aktywowany przez różne stresy i czynniki związane ze starzeniem1,2,3,4. Komórki senescencyjne są klasycznie identyfikowane przez konstelację markerów, ponieważ żaden pojedynczy marker nie jest całkowicie specyficzny. Charakterystyczne cechy to powiększona, spłaszczona morfologia komórek, senescencyjno-związana aktywność β-galaktozydazy (SA-β-Gal), tworzenie ognisk uszkodzeń DNA i pro-zapalny profil sekrecyjny (SASP)2,4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komórki IMR-90 to uznaną linię komórek fibroblastów ludzkich i nie stanowią badań na ludzkich podmiotach. Nie wymagano zgody etycznej ani zgody na udział w badaniu. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego Uniwersytetu w Albany, Państwowego Uniwersytetu Nowego Jorku, dotyczącymi pracy z liniami komórek pochodzenia ludzkiego w warunkach Biosafety Level 2 (BSL-2).
1. Ogólne przygotowanie i przegląd przepływu pracy
- Zdefiniuj cel eksperymentu jako analizę profilowania lizosomałów w żywych komórkach za pomocą barwienia LysoTracker Deep Red i żywego barwnika jądrowego w celu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zastosowanie tego protokołu do fibroblastów IMR-90 w warunkach niskiego i wysokiego starzenia się przynosi ilościowe wyniki czynności lizosomowe, które można podsumować na poziomie pojedynczej komórki, a w razie potrzeby również na poziomie całego pola.
Przedstawione zestawy danych pochodzi z pojedynczego eksperymentu biologicznego, porównującego kultury IMR-90 w przebiegu 13 (P13; niska starczność, ~PDL 26) i przebiegu 23 (P23; wysoka starczność, ~PDL 46). Dwa dołki dla każdego warunku został.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy protokół opisuje przepływ pracy do obrazowania komórek in vivo, który mierzy starzenie się komórek poprzez przebudowę lizosomu i daje ilościowe wyniki obciążenia starzeniowym na poziomie pojedynczej komórki i dołka. Kilka kroków jest szczególnie istotnych dla uzyskania wiarygodnego testu. Po pierwsze, sam model biologiczny musi być dobrze kontrolowany. Indukcja starzenia się replikacyjnego w fibroblastach IMR-90 wymaga starannego śledzenia podwójnych populacji i równoległego utrzymywania kultur wczesnych przejś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do ujawnięcia.
Podziękowania
Badanie zostało sfinansowane przez granty NIH R15CA274603 dla JAM i TJB, R56DE033253 dla ML, ST i JAM oraz R01GM125870, 1R41AG081123 dla ST i JAM. Schematyczne ilustracje zostały stworzone za pomocą BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated) | CellTreat Scientific Products | 229124 | Każda przezroczysta multi-wellowa płytka kulturalna z dnem, kompatybilna z fluorescencyjnym obrazowaniem żywych komórek (np. 6-, 12- lub 24-wellowe płytki polistyrenowe; płytki szklano-denne mogą być preferowane dla wyższej rozdzielczości obrazu). |
| Beta-galaktozydaza zestaw barwienia (senescencja assay) | Cell Signaling Technology | 9860 | Każdy komercyjny SA-β-galaktozydaza zestaw z zweryfikowanym buforem barwiącym przy pH 6.0. Dla odniesienia, roztwór fiksujący zawiera 2% formaldehydu i 0,2% glutaraldehydu w PBS, a roztwór barwiący zawiera 1 mg/mL X-gal w DMF, 40 mM cytrynian/fosforan pH 6.0, 5 mM potasu ferrocyjanku, 5 mM potasu ferrycyjanku, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2. |
| BioRender (oprogramowanie do naukowych ilustracji) | BioRender | N/A — aplikacja internetowa | Służy do tworzenia schematycznych rysunków (Rysunki 1–3). https://www.biorender.com |
| Dwutlenek węgla (CO2), skompresowany cylinder | Airgas (lub podobny dostawca) | N/A | CO2 medycznej klasy używany do utrzymania 5% atmosfery w inkubatorze do hodowli komórkowej i komorze do obrazowania na scenie. |
| Surowica bydlęca płodowa (FBS), wyłączona termicznie | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10082147 | Każda surowica bydlęca płodowa o klasie kultury komórkowej, wyłączona termicznie w 56 °C; używana w 10% v/v w pełnym medium kulturowym. |
| Mikroskop fluorescencyjny z funkcją żywych komórek | Thermo Fisher Scientific | AMF7000 | Każdy szerokopolowy lub konfokalny mikroskopek fluorescencyjny z kontrolą temperatury i CO2 dla żywych komórek, zestawy filtrów dla daleko-czerwonych (ekscytacja ~647 nm / emisja ~670 nm) i DAPI/Hoechst (ekscytacja ~405 nm / emisja ~460 nm) kanałów oraz obiektyw 20×-40× z wystarczającym NA do rozdzielania cech lizosomalnych. W tym badaniu użyto Systemu Obrazowania EVOS M7000. |
| Hoechst 33342 barwnik jądrowy | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Komórkoprzenikalny barwnik DNA do barwienia jądra żywych komórek (niebieska fluorescencja, ekscytacja ~405 nm). Nie może być zamieniany z DAPI, która nie przenika przez komórkę w warunkach fizjologicznych. |
| Oprogramowanie do analizy obrazów | Python Software Foundation | N/A | Każde środowisko obliczeniowe naukowe wspierające segmentację jądra, rozszerzenie regionu komórka-jądro, progowanie intensywności i podstawową statystykę obrazu (np. Python z scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). SenTrack pipeline (patrz Plik Suplementarny S1) został opracowany na potrzeby tego badania. |
| IMR-90 ludzkie fibroblasty płucne (linia komórkowa) | ATCC | CCL-186 | Normalna linia komórkowa fibroblastów płodowych ludzkich diploidalnych używana do modelowania senescencji replikacyjnej; można zastąpić dowolną podobnie scharakteryzowaną linią fibroblastów ludzkich. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | L12492 | Acydotropowy fluorescencyjny barwnik do barwienia żywych komórek kwaśnych organelli; dostarczany jako 1 mM stock w DMSO. Koncentracja robocza wynosi 75nM w przygotowanej kulturze komórkowej. Emisja daleko-czerwona (ex 647 nm / em 668 nm) minimalizuje nakładanie się z autofluorescencja lipofuscyny, ale jej nie eliminuje. |
| Minimalne środowisko Essential Medium (MEM) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 11-095-080 | Podstawowe środowisko kultury dla fibroblastów IMR-90; uzupełnione o 10% FBS i 1% penicylinę-streptomycynę. Można zastąpić dowolną standardową formułę Eagle's Minimalnego Essential Medium z solami Earle's i L-glutaminą. |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny (100×) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15140122 | Dodatek antybiotyczny do pełnego medium kultury; stosuje się w 1% v/v (końcowe stężenie 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny). Można zastąpić dowolnym standardowym roztworem pen-strep. |
| Środowisko do obrazowania bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | A1896701 | Środowisko DMEM lub HBSS bez czerwieni fenolowej używane do obrazowania żywych komórek w celu zmniejszenia fluorescencji tła podczas akwizycji. FluoroBrite DMEM jest jedną z powszechnie używanych opcji; można zastąpić dowolnym środowiskiem do obrazowania bez czerwieni fenolowej, uzupełnionym o 10% FBS. |
| Phosphat buffered saline (PBS), pH 7.4 (1×) | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 10010023 | Bufor izotoniczny do płukania komórek i rozcieńczania reagentów; można zastąpić dowolnym sterylnym 1× PBS o pH 7.4. |
| SenTrackLite v0.5.0 (oprogramowanie) | Open-Source (Estrada / Melendez Lab) | v0.5.0 | Otwartoźródłowa jednoplikowa aplikacja Python / Tkinter do analizy obrazów senescencji lizosomalnej. Dystrybuowana jako Plik Suplementarny S1. Archiwizowana na Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licencja MIT. Źródło: https://github.com/gold |
Przedruki i uprawnienia
