Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Javier Estrada Toro; Scott A. Tenenbaum; Melinda Larsen; Thomas J. Begley; J. Andres Melendez

doi:10.3791/70684

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

282 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70684

⸱

17 lipca 2026

Javier Estrada Toro¹ , Scott A. Tenenbaum¹^,² , Melinda Larsen²^,³ , Thomas J. Begley²^,³ , J. Andres Melendez¹^,²

¹Department of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, ²The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, ³Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w fibroblastach ludzkich IMR-90.

Streszczenie

Senescencja komórkowa to stabilny stan zatrzymania cyklu komórkowego związany z charakterystycznymi fenotypami, w tym powiększoną morfologią komórek, zmienionymi sygnałami sekrecyjnymi i wyraźną przebudową lizosomu. Komórki senescencyjne zwykle wykazują rozszerzenie kwaśnego przedziału endo-lizosomalnego, któremu towarzyszą zmiany w kwasowości światła i zdolności degradacyjnej, co stwarza możliwość prostych pomiarów żywych komórek związanych z przebudową organelli związaną z senescencją. Praca opisuje protokół obrazowania żywych komórek, który wykorzystuje LysoTracker Deep Red, kwasowy fluorescujący barwnik, aby zapewnić pośredni, zależny od pH zastępczy wskaźnik kwaśnego przedziału organelli jako korelat obciążenia senescencją. Metoda jest demonstrowana na ludzkich fibroblastach płucnych IMR-90 przechodzących replikacyjną senescencję w trakcie kolejnych przeszczepów. Protokół szczegółowo opisuje hodowlę komórek i śledzenie przeszczepów, barwienie LysoTracker, obrazowanie fluorescencyjne i oparte na obrazie pomiary intensywności sygnału lizosomalnego oraz obszaru sygnału dodatniego na komórkę. Barwienie senescencyjnej β-galaktozydazy (SA-β-Gal) na równoległych kulturach jest dołączone jako opcjonalny marker potwierdzający, a nie jako standard odniesienia. Przedstawione wyniki pokazują wyższy sygnał kwasowego fluorescującego barwnika i większe regiony lizosomu dodatnie w kulturach późnego przeszczepu niż w kontrolach wczesnego przeszczepu, co jest zgodne z rozszerzeniem kwaśnego przedziału organelli podczas senescencji. Ponieważ odczyt zależy od objętości przedziału, gradientu protonów i dostępności barwnika, najlepiej interpretować go jako pośredni korelat przebudowy lizosomu, a nie bezpośrednie miara liczby lub biogenezy lizosomu. Protokół jest prosty w adaptacji i może być dostosowany do innych typów komórek lub stresów indukujących senescencję, zapewniając praktyczną, ilościową alternatywę dla konwencjonalnych testów końcowych.

Wprowadzenie

Senescencja komórkowa to trwały program zatrzymania cyklu komórkowego aktywowany przez różne stresy i czynniki związane ze starzeniem¹^,²^,³^,⁴. Komórki senescencyjne są klasycznie identyfikowane przez konstelację markerów, ponieważ żaden pojedynczy marker nie jest całkowicie specyficzny. Charakterystyczne cechy to powiększona, spłaszczona morfologia komórek, senescencyjno-związana aktywność β-galaktozydazy (SA-β-Gal), tworzenie ognisk uszkodzeń DNA i pro-zapalny profil sekrecyjny (SASP)²^,⁴^,⁵. Wśród tych cech, przebudowa lizosomu wyłoniła się jako wybitna i funkcjonalnie znacząca cecha senescencji⁶^,⁷. Komórki senescencyjne wykazują głębokie zmiany lizosomalne, w tym dramatyczną ekspansję wielkości i liczby lizosomu wraz ze zmienioną funkcją (często z uwzględnieniem częściowej neutralizacji pH lizosomalnego i akumulacji niszczerzałego materiału)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Ta lizosomalna ekspansja przyczynia się do zwiększonej aktywności SA-β-Gal, ustanowionego markera senescencji, który odzwierciedla podwyższoną aktywność β-galaktozydazy lizosomalnej w komórkach senescencyjnych¹⁰^,¹¹^,¹². Rzeczywiście, barwienie SA-β-Gal wykorzystuje to zjawisko poprzez stosowanie inkubacji o suboptymalnym pH (6,0), aby selektywnie wykrystalizować barwnik w lizosomach komórek senescencyjnych, które zgromadziły enzym i wykazują wyższe pH niż komórki młode¹⁰^,¹²^,¹³.

Lizosomy odgrywają centralne role w obrocie białek i sygnalizacji, a ich dysregulacja jest obecnie uważana za charakterystyczną cechę starzenia się i senescencji¹^,²^,⁴^,⁶. Komórki senescencyjne często wykazują dysfunkcję lizosomalną, co widać na podstawie podwyższonego pH luminalnego, zmienionej aktywności enzymatycznej i akumulacji lipofuscyny (autofluorescencyjny pigment utlenionych makrocząsteczek)⁶^,¹⁴. Biogeneza lizosomalna jest często zwiększona lub zmieniona poprzez skoordynowaną ekspresję i regulację lizosomalną (CLEAR) pod kontrolą czynnika transkrypcyjnego EB (TFEB) i powiązanych czynników⁶^,⁷^,¹⁵. Ten proces może zwiększyć masę lizosomalną w komórkach senescencyjnych, gdy adaptują się do stresu poprzez zwiększenie komponentu degradacyjnego⁶^,⁷^,¹⁰. Z drugiej strony, komórki senescencyjne mogą również doświadczać obniżenia funkcji lizosomalnej (np. zmniejszona kwasowość), co może wpływać na procesy takie jak autofagioza i sprawiać oporność na pewne stresy, w tym ferroptotyczną śmierć komórki⁶^,⁸. Dlatego pomiar zawartości i funkcji lizosomalnej jest kluczowy dla zrozumienia i identyfikacji senescencji⁶^,¹⁶.

LysoTracker Deep Red to przenikający błony fluoryscencyjny probnik, który selektywnie gromadzi się w kwaśnych organellach poprzez protonowo napędzane uwięzienie przez błonę lizosomalną¹⁶^,¹⁷. Powstały sygnał odbija połączoną objętość kwaśnego komponentu, siłę gradientu protonowego i lokalną dostępność barwnika, a nie masę lizosomalną, i może się zmieniać wraz ze zmianami pH lizosomalnego lub stanu błony, które występują niezależnie od łącznej liczby lizosomu⁶^,¹⁶. W kontekście senescencji komórkowej, komórki wykazują rozszerzone i bardziej intensywnie oznakowane przedziały LysoTracker-dodatnie w porównaniu z przed-senescencyjnymi odpowiednikami⁹, zgodnie z ekspansją kwaśnego komponentu organelli i zwiększoną biogenezą lizosomalną zgłoszoną przez badania biochemiczne i ultrastrukturalne⁶^,⁷^,¹⁰. To podejście do żywych komórek oferuje kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym końcowym barwieniem SA-β-Gal: umożliwia ilościową i przestrzennie rozdzielczną analizę pojedynczych komórek, może być łączone z innymi fluoryscencyjnymi reporterami, nie wymaga fiksacji i rejestruje różnorodność poprzez raportowanie ciągłych cech, a nie binarnego punktu końcowego⁶^,¹⁶. Przez cały ten protokół, sygnał LysoTracker jest używany jako odczyt komponentu kwaśnego organelli w żywych komórkach, a zmiany zależne od warunków są interpretowane odpowiednio, a nie trakt