Ten protokół ustanawia dynamiczny system współkultury płuca na chipie, łączący ludzkie pierwotne komórki nabłonkowe dróg oddechowych i płucne komórki śródbłonka mikrokrążenia dla dwóch modeli: zdrowego i modelu POChP. System odtwarza interakcje dróg oddechowych i naczyń pod powierzchnią powietrze-płyn i przepływem oraz zapewnia ocenę bariery, fenotypizację komórek i analizę RNA.
Artykuł metodologiczny
Ustanowienie współkultury nabłonkowo-śródbłonkowej płuca na chipie do badań w warunkach zdrowych i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (COPD)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dwa dynamiczne modele płuca-na-włóknie z kokulturą zostały opracowane w celu odtworzenia interfejsu przewodu-naczyniowego przez włączenie pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych i komórek śródbłonka naczyń krwionośnych płuc. Jeden model wykorzystuje komórki dostępne na rynku od zdrowych dawców, podczas gdy drugi zawiera komórki pochodzące od pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP), umożliwiając bezpośrednie porównanie stanu zdrowego i chorego w identycznych warunkach kultury. Oba modele wspierają różnicowanie nabłonka w warunkach ciągłej perfuzyj i interfejsu powietrze-ciecz (ALI), co skutkuje fizjologicznie istotną barierą nabłonkową wspierana przez podstawową warstwę śródbłonka. Proces pracy obejmuje powłokę macierzy pozakomórkowej, sadzenie komórek, ustanawianie ALI, ocenę funkcji bariery, fenotypizację komórek i wyodrębnianie RNA specyficzne dla typu komórki. Testy przepuszczalności wykazały solidną integralność bariery w obu systemach, podczas gdy immunofluorescencja potwierdziła ciągłą lokalizację Zonula Occludens-1 (ZO-1) i cadheryny śródbłonkowej naczyń krwionośnych (VE-cadherin) w stykach komórkowych. Różnicowanie nabłonka potwierdzono za pomocą barwienia α-tubuliny IV i wizualnej obserwacji bicia rzęsek. Wysokiej jakości RNA zostało uzyskane osobno z każdego przedziału, co wspiera analizy molekularne specyficzne dla typu komórek. Model POChP odtworzył kluczowe cechy choroby, zwłaszcza zwiększoną produkcję śluzu, bez kompromisu dla funkcji bariery lub żywotności komórek. Zastosowanie komórek nabłonkowych i śródbłonkowych pochodzących od pacjentów zachowuje indywidualne cechy patologiczne, umożliwiając badanie mechanizmów międzykomórkowych w POChP. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotną alternatywę dla statycznych modeli in vitro i zwierzęcych i wspiera badania przedkliniczne leków wdychalnych, ekspozycji na patogeny i interakcji nabłonek-śródbłonek. Co ważne, zdrowe i POChP modele płuca-na-włóknie mogą być używane zarówno w połączeniu do bezpośrednich badań porównawczych, jak i niezależnie do badań mechanyzmu działania, testowania terapeutycznego i odkrywania leków. System można również dostosować do innych chorób układu oddechowego związanych ze zmienionymi nabłonkami lub śródbłonkami, oferując wszechstronną i translacyjną platformę dla badań nad układem oddechowym.
Wprowadzenie
Interakcja między komórkami nabłonka dróg oddechowych a komórkami śródbłonka mikrokrążenia płucnego jest niezbędna do utrzymania homeostazy płuc i koordynowania reakcji na uszkodzenia, infekcje i stany zapalne. Razem te typy komórek tworzą funkcjonalną barierę, która reguluje wymianę gazów, nadzór immunologiczny i przepuszczalność naczyń krwionośnych. Ich dynamiczna komunikacja obejmuje sygnalizację parakrynową, bezpośrednie interakcje komórka-komórka i reakcje na bodźce mechaniczne, które są wszystkie kluczowe dla funkcji płuc i integralności strukturalnej1.
W przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP), postępującym zaburzeniu płuc charakteryzującym się przewlekłym stanem zapalnym, remodelacją dróg oddechowych i zniszczeniem stref kontaktu między pęcherzykami płucnymi a naczyniami włosowatymi, funkcja barierowa zarówno nabłonka dróg oddechowych, jak i śródbłonka naczyń płucnych jest osłabiona i towarzyszy jej nieprawidłowe uwalnianie cytokin i dysregulacja mechanizmów naprawy tkankowej2,3. Jednakże, współzależność między nabłonkiem dróg oddechowych a komórkami śródbłonka mikrokrążenia płucnego pozostaje słabo poznana. Ta ograniczoność wynika częściowo z niedociągnięć istniejących modeli in vitro i in vivo . Chociaż modele zwierzęce dostarczyły ważnych informacji dotyczących fizjologii i patologii układu oddechowego, ich istotność jest ograniczona przez międzygatunkowe różnice w funkcji układu odpornościowego, strukturze płuc, sygnalizacji komórkowej i metabolizmie leków, co może utrudniać przełożenie na biologię ludzką.
Konwencjonalne systemy in vitro , takie jak dwuwymiarowe (2D) kultury unieszlachetnionych linii komórek nabłonka dróg oddechowych, nie odzwierciedlają kluczowych cech nabłonka dróg oddechowych, w tym właściwej różnicowania i odpowiedzi biomechanicznej. Chociaż trójwymiarowe (3D) monokultury komórek nabłonka dróg oddechowych na powietrzu–płynie (ALI) poprawiają istotność fizjologiczną, pozostają statyczne i nie mają interakcji z innymi typami komórek i bodźcami mechanicznymi4. Płuco jest dynamicznym narządem ciągle narażonym na przepływ powietrza, stres ścinający, sztywność macierzy pozakomórkowej i cykliczne rozciąganie generowane przez oddychanie. Czynniki te silnie wpływają na zachowanie komórek i remodelację tkanki5. Dlatego też statyczne modele są niewystarczające do replikacji procesów takich jak adhezyjność leukocytów, przemieszczanie się komórek immunologicznych i reakcje w czasie rzeczywistym na narażenie na leki.
Aby zaadresować te ograniczenia, platformy organ-on-a-chip pojawiły się jako zaawansowane systemy do modelowania złożonych interakcji komórkowych. Modele płuco-na-czypie integrują technologię mikrofluidyczną z ludzkimi pochodzeniami komórek, aby odtworzyć kluczowe strukturalne i mechaniczne cechy mikrośrodowiska płuc. Platformy te umożliwiają współhodowlę komórek nabłonka dróg oddechowych i komórek śródbłonka naczyń płucnych w dynamicznym, trójwymiarowym środowisku, które lepiej naśladuje warunki in vivo 6. Włączenie fizjologicznych ruchów oddechowych, przepływu płynów i monitorowania w czasie rzeczywistym poprawia badanie komunikacji nabłonka-śródbłonka zarówno w normalnych, jak i chorobowych warunkach7–9.
Mimo tych postępów, większość istniejących systemów płuco-na-czypie opiera się na komórkach pochodzących od zdrowych donorów10, ograniczając ich zdolność do modelowania interakcji specyficznych dla chorób. Ponadto wiele platform brakuje elastyczności włączenia komórek pochodzących od pacjentów lub odtworzenia złożonego mikrośrodowiska POChP. Co więcej, szczegółowe protokoły współhodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych i komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego—czy to od źródeł komercyjnych, czy od pacjentów z POChP—z użyciem powłok macierzy pozakomórkowej (ECM) specyficznych dla typu komórek, pozostają ograniczone.
W niniejszym badaniu zastosowano komercyjnie dostępną platformę dwukanałową mikrofluidyczną płuco-na-czypie do utworzenia dwóch modeli współhodowli obejmujących pierwotne komórki nabłonka dróg oddechowych i komórki śródbłonka mikrokrążenia płucnego. Zdrowy model został stworzony przy użyciu komercyjnie dostępnych komórek pochodzących od różnych donorów, podczas gdy model POChP został utworzony przy użyciu komórek nabłonka dróg oddechowych i śródbłonka uzyskanych od tego samego pacjenta. Oba modele wykorzystują powłokę ECM specyficzną dla typu komórek, aby lepiej naśladować mikrośrodowisko płuc in vivo. Systemy te umożliwiają badanie interakcji nabłonka-śródbłonka w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Modele zdrowe i POChP mogą być stosowane zarówno łącznie do bezpośrednich badań porównawczych, jak i niezależnie do bad
Protokół
Wszelkie zastosowania ludzkich komórek pierwotnych zostało zatwierdzone przez Lokalny Komitet Etyczny Badań UZ Leuven (S51577/S57114/S70453). Komercyjnie dostępne pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBEC) i komórki śródbłonka drobnych naczyń płucnych (HPMEC) uzyskano od dwóch niepalących dawczyń (Tabele uzupełniające 1, 2). Komórki pierwotne do modelu POChP zostały izolowane z przeszczepowanego tkanki płucnej trzech pacjentów z POChP z historią palenia tytoniu (Tabela uzupełniająca 3), zgodnie z udokumentowanym protokołem (zatwierdzenie etyczne S51577) i przechowywane w biobanku BREATHE. Zarówno HBEC, jak i HPMEC zostały uzyskane od tej samej pacjentki z POChP.
Aby utworzyć zdrowy model płuca na chipie, zastosowano komercyjne HBEC i HPMEC. W przypadku modelu POChP, pierwotne komórki nabłonka oskrzeli i śródbłonka drobnych naczyń płucnych zostały izolowane z przeszczepowanego tkanki płucnej uzyskanej od tej samej pacjentki po przeszczepie płuc. System płuca na chipie zastosowany w tym badaniu to mikrofluidyczna platforma dwukanałowa obejmująca równoległe mikrokanały oskrzelowe (góra) i naczyniowe (dół) oddzielone porowatą membraną pokrytą pozakomórkową matrycą (Rysunek 1). Do zbudowania zarówno zdrowego, jak i modelu POChP zastosowano ten sam protokół. Substancje chemiczne, odczynniki i zestawy użyte w protokole są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Ustanowienie współkulturowych modeli płuca na chipie w warunkach przepływu laminarnego
- Przygotowanie chipu
- Umieść uchwyt chipu w 120-mm kwadratowej miseczce do hodowli komórek, z rogami skierowanymi w górę, aby zapewnić prawidłową orientację, a następnie umieść chipy w uchwycie. Upewnij się, że wszystkie chipy zostały prawidłowo umieszczone przed krokiem aktywacji (Rysunek 2).
- Przygotuj roztwór aktywacyjny, rozpuszczając proszek środka aktywacyjnego w odpowiednim buforze dostarczonym przez producenta, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mg/mL.
- Aktywuj wewnętrzne powierzchnie kanałów chipu, aby promować przyleganie do pozakomórkowej matrycy (ECM) przez ostrożne wprowadzanie około 35 μL roztworu aktywacyjnego przez dolny wlot kanału. Pipetuj, aż roztwór zacznie wypływać z dolnego wylotu kanału. Powtórz procedurę, wprowadzając około 50 μL roztworu do górnego wlotu kanału.
UWAGA: Proszek środka aktywacyjnego jest światłoczuły. Przygotuj roztwór aktywacyjny bezpośrednio przed użyciem i wyrzuć pozostałą roztwór 1 h po odtworzeniu. - Usuń nadmiar środka aktywacyjnego z powierzchni chipu delikatnym aspiracją. Upewnij się, że usuwasz tylko środek aktywacyjny z powierzchni chipu - nie aspiruj go z kanałów.
UWAGA: Przed aktywacją UV sprawdź kanały pod mikroskopem, aby wykryć pęcherzyki. Jeśli są obecne, usuń je delikatnym przemywaniem środkiem aktywacyjnym, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. - Nawiąż chipy na 10 min do lampy UV, a następnie przemyj każdy kanał dwa razy 200 μL odpowiedniego buforu.
- Pipetuj świeży roztwór aktywacyjny do obu kanałów, jak opisano powyżej, i nawiąż chipy na UV przez kolejne 5 min.
- Całkowicie aspiratuj roztwór z obu kanałów, przemyj każdy kanał dwa razy 200 μL odpowiedniego buforu, a następnie przemyj każdy kanał raz 200 μL sterylnego zimnego buforu fosforanowego bez jonów Ca2+ i Mg2+ (DPBS -/-).
- Przygotuj roztwór powłoki ECM w DPBS (-/-) zawierający ludzką kolagen typu I (100 μg/mL), ludzką fibronektynę (50 μg/mL) i ludzką laminię (50 μg/mL). Użyj 100 μL roztworu jako objętości odniesienia na chip.
- Dodaj 50 μL do górnego kanału i 35 μL do dolnego kanału, jednocześnie aspiratując odpływ przez porty wylotowe.
UWAGA: Sprawdź kanały pod mikroskopem, aby wykryć pęcherzyki. Jeśli są obecne, przemyj je delikatnie roztworem ECM, aby je usunąć. - Zostaw małe kropelki roztworu ECM na obu wlotach i wylotach kanałów, aby zapobiec parowaniu podczas inkubacji przez noc (ON).
- Inkubatoruj chipy przez całą noc w 37 °C z 5% CO2. Następnego dnia aspiratuj roztwór ECM i przemyj oba kanały 200 μL przegrzanego DPBS (-/-) w 37 °C.
- Hodowla komórek i zanurzona kultura
Rozwijaj HBEC w kolbkach T25 cm2 pokrytych ludzkim kolagem typem IV (150 μg/mL w DPBS (-/-)) za pomocą pożywki do rozwoju komórek nabłonka oskrzeli, aż osiągnie się 60-70% konfluencji.
Równolegle, rozwijaj HPMEC w kolbkach T75 cm2 pokrytych żelatyną (2 mg/mL w DPBS (-/-)) za pomocą pożywki do wzrostu komórek
Wyniki
Ustanowienie modeli współkultury płuca na chipie
Wizerunki brightfield ujawniły przyleganie i wzrost komórek w czasie w systemie współkultury płuca na chipie. Komórki nabłonka dróg oddechowych rozmnażały się w kulturze zanurzonej na interfejsie płyn–płyn (LLI), tworząc jednolitą warstwę wzdłuż górnego kanału (Rysunek 6A), podczas gdy komórki śródbłonka naczyń płucnych ekspandowały, aby pokryć cały dolny kanał, tworząc konfluencyjną monowarstwę (Rysunek 6B).
Po ustanowieniu współkultury, komórki śródbłonka były monitorowane w regionach wejściowych i wyjściowych dolnego kanału, które są jedynymi obszarami dostępnymi do inspekcji mikroskopowej. Jak pokazano na Rysunku 7, komórki śródbłonka pozostały żywotne i wykazywały wydłużoną morfologię wyrównaną z kierunkiem przepływu. Po 14 dniach kultury ALI, warstwa nabłonka zarówno w zdrowych, jak i w modelach COPD wykazywała widoczne bicie rzęsek (Dodatkowe wideo). Zgodnie z oczekiwaniami, model COPD wykazywał znacznie większą produkcję śluzu w porównaniu z modelem zdrowym (Rysunek 8), odwzorowując kluczowe cechy patologii COPD.
Rysunek 6: Współkultura komórek nabłonka dróg oddechowych i śródbłonka w urządzeniu mikrofluidycznym.
Reprezentatywne obrazy pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli na górnej powierzchni (A) i pierwotnych komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego na dolnej powierzchni (B) membrany porowatej w warunkach interfejsu płyn–płyn (LLI). Skala: 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Komórki śródbłonka w dolnym kanale mikrofluidycznym podczas interfejsu powietrze–płyn.
Reprezentatywne obrazy brightfield przedstawiające komórki śródbłonka mikrokrążenia płucnego na wejściu (góra) i wyjściu (dół) dolnego kanału podczas interfejsu powietrze–płyn (ALI). Skala: 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 8: Akumulacja śluzu w kanale dróg oddechowych.
Reprezentatywne obrazy pokazujące produkcję śluzu po 14 dniach interfejsu powietrze–płyn (ALI) w zdrowym (A) i modelu COPD (B). Brązowa warstwa w komorze dróg oddechowych reprezentuje nagromadzony śluz. Skala: 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Ilościowa ocena integralności bariery
Funkcjonalna ocena integralności bariery wykazała niższą wskaźnik permeabilności (Papp) w modelach zarówno zdrowych, jak i COPD w porównaniu do kontroli dodatniej (chip powłoczony ECM bez komórek) (Rysunek 9).
W przypadku braku komórek, wysokie wartości Papp wskazywały na minimalne tworzenie bariery. Natomiast w obecności warstw nabłonka i śródbłonka, fluorescencyjny śledzik dekstranu nie przekraczał ECM, co skutkowało znacznie zmniejszoną przepuszczalnością i wskazywało na silną barierę. Efekt ten obserwowano zarówno przed ALI, jak i po 10 dniach ALI, co pokazuje, że funkcja bariery jest ustanawiana wcześnie podczas różnicowania.
Jak pokazano na Rysunku 10, w modelu zdrowego, średnie wartości Papp przed ALI były już poniżej progu wskazującego na mocną integralność bariery (1 × 106 cm/s) i zmniejszyły się jeszcze bardziej podczas kultury ALI. W modelu COPD, średnie wartości Papp były również w zakresie silnej bariery przed ALI i, choć nieznacznie zwiększyły się po 10 dniach ALI, integralność bariery pozostała mocna.
Rysunek 9: Ocena funkcji bariery w modelu płuca na chipie.
Dyskusja
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół do ustanowienia układu współkultury płuco na chipie w celu stworzenia zarówno zdrowego modelu, wykorzystując komórki nabłonkowe oskrzeli i komórki endotelialne mikrokrążenia płucnego dostępne komercyjnie, jak i modela COPD za pomocą komórek pochodzących od pacjenta z wyeksplantowanych płuc. W obu modelach dwa typy komórek są oddzielone porowatą, rozciągliwą membraną pokrytą specyficzną dla typu komórek macierzą pozakomórkową (ECM), umożliwiającą mikrośrodowisko, które bardziej przypomina in vivo płuca. Protokół zawiera również metody oceny integralności bariery, fenotypu komórek i ekstrakcji RNA z każdego kompartmentu. Oba modele były skutecznie utrzymywane w warunkach dynamicznej perfuzji i interfejsu powietrze-ciecz (ALI), co skutkowało fizjologicznie odpowiednim barierą nabłonkowo-endotelialną z w pełni zróżnicowaną pseudowarstwową epitelią oskrzeli. Komórki endotelialne wyrównane były z kierunkiem przepływu, jak obserwowano in vivo, a wysokiej jakości RNA został uzyskany z obu kompartmentów.
Kilka kluczowych kroków jest niezbędnych do udanego ustanowienia tego układu współkultury. Dokładne wysiew komórek nabłonkowych jest wymagany, aby osiągnąć jednolite pokrycie, ponieważ nierównomierna dystrybucja może prowadzić do niekompletnego pokrycia powierzchni i osłabionej formacji bariery. W takich przypadkach, górny kompartment powinien być delikatnie zasysany, a komórki nabłonkowe ponownie wysiane. Ustanowienie ALI powinno być wykonane dopiero wtedy, gdy zarówno warstwa nabłonkowa, jak i endotelialna tworzą ciągłe monowarstwy, ponieważ przedwczesne narażenie na ALI może prowadzić do wycieku medium naczyniowego do przestrzeni oskrzelowej i upośledzonej różnicowania. Jeśli nie osiągnięto konfluencji, ustanowienie ALI powinno być opóźnione.
Niedostateczne usunięcie medium górnego kanału lub niekonsekwentne narażenie na ALI może prowadzić do niejednolitej dojrzewania nabłonka. Resztkowe medium w górnym kanale można usunąć przez zwiększenie szybkości przepływu do 600 μL/h przez 3-4 min. Tworzenie się bąbelków, które zakłócają perfuzję i wpływają na żywotność komórek, może wystąpić z powodu niewystarczającego zrównoważenia. Bąbelki można usunąć przez tymczasowe zwiększenie szybkości przepływu do 600 μL/h przez 3-4 min lub, jeśli są trwałe, przez odłączenie chipu i ręczne usunięcie ich za pomocą pipety. W modelu COPD nadmierny wydzielanie śluzu może zablokować kanał oskrzelowy i upośledzić perfuzję; w takich przypadkach zalecane jest delikatne przepłukanie DPBS i ponowne ustanowienie ALI.
Większość istniejących układów współkultur łączących nabłonek oskrzeli i komórki endotelialne płuc opiera się na komórkach pierwotnych dostępnych komercyjnie i generycznych powłokach ECM, takich jak kolagen czy fibronektyna10,12. Podczas gdy wspierają one adhezję, tylko częściowo odtwarzają właściwości biochemiczne i mechaniczne interfejsu oskrzeli-naczyń. W przeciwieństwie do tego, opisany system stosuje specyficzne dla typu komórek powłoki ECM, zapewniając mikrośrodowisko, które bardziej przypomina ludzkie tkanki płucne13.
Funkcję bariery zwykle ocenia się za pomocą transepitelialnego/transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER), choć ta metoda może być wpłynięta przez organizację wielowarstwową nabłonka14. W niniejszym badaniu permeowalność dekstrany została wykorzystana do oceny integralności funkcjonalnej. Obserwowane wartości Papp były poniżej progu dla silnej integralności bariery (1 × 10-6 cm/s), co wskazuje na mocny interfejs nabłonkowo-endotelialny. Epitel oskrzeli wykazywał cechy różnicowania, w tym bicie rzęsek i produkcję śluzu, wraz z ciągłym lokalizowaniem ZO-1 i VE-kadheryna na stykach komórek. Ponadto, wysokiej jakości RNA był konsekwentnie uzyskiwany z obu kompartmentów, umożliwiając specyficzne dla typu komórek analizy poniżej.
Kluczowym osiągnięciem tej pracy jest opracowanie modelu płuco na chipie w COPD, w którym zarówno komórki nabłonkowe, jak i endotelialne pochodzą od tego samego pacjenta. Według obecnej wiedzy, taka dopasowana do pacjenta współkultura nie była wcześniej raportowana. Wcześniejsze badania uwzględniały nabłonek pochodzący od pacjentów z COPD7,8, ale opierały się na komórkach endotelialnych dostarczonych komercyjnie, co ograniczyło badanie chorobowych interakcji nabłonek-endotelium. Obecny model przezwycięża tę ograniczność, zachowując interakcje komórkowe specyficzne dla pacjenta.
Model COPD odtworzył kluczowe cechy choroby, w tym zwiększone wydzielanie śluzu3, zachowując jednocześnie wyrównanie endotelialne i integralność styków pod wpływem przepływu. Co ważne, współkultura komórek nabłonkowych i endotelialnych pochodzących od pacjenta nie kompromituowała funkcji bariery ani żywotności, mimo zwięks
Oświadczenia
Żadni autorzy nie mają żadnych sporów interesów.
Podziękowania
To dzieło zostało sfinansowane dzięki dotacji badawczej (G065221N) od Fundacji Badawczej Flandrii.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsyn-EDTA (1X) (dla komórek endotelialnych) | Gibco | 25200-056 | Stosowane do enzymatycznego oderwania komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego. |
| 120 mm x 120 mm kwadratowa patelnia do hodowli komórek | VWR | 688161 | Używane do utrzymania podstawy mikroczipów podczas przygotowania i manipulacji. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939A | Stosowane do oceny jakości i integralności RNA. |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | Stosowane do opadania RNA podczas ekstrakcji. |
| 4′,6-diamidino-2-fenyloindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Stosowane do barwienia jąder komórek podczas immunofluorescencji. |
| 50 mL stożkowe probówki | Cellstar | 227261 | Stosowane do pobierania komórek, wirowania i przygotowywania zawiesin komórek. |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Stosowane do analizy jakości RNA za pomocą Bioanalyzer. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Stosowane do zapobiegania zakażeniom grzybiczymi podczas hodowli komórek. |
| Automatyczny licznik komórek | NanoEntek | EVE PLUS | Stosowane do określania stężenia komórek i ich żywotności przed posadzeniem. |
| Patelnie wielodołkowe do hodowli komórek, 48 dołków, sterylne | Falcon | 353078 | Stosowane do utrzymania przekrojów podczas procedur barwienia. |
| Wirówka | Hettich | 320R | Stosowane do osiadania komórek przed posadzeniem. |
| Podstawa mikroczipów | Emulate | support@emulatebio.com | Stosowane do podtrzymywania i utrzymywania mikroczipów podczas aktywacji powierzchni, powlekania i sadzenia komórek. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | Stosowane do separacji faz podczas ekstrakcji RNA. |
| Moduł spinning disk Cicero | CrestOptics S.p.A. | Stosowane do wykonywania szybkiej konfokalnej fluorescencyjnej mikroskopii. | |
| Okrągłe szkła pokrywne | Epredia | BB02400600AC13MNZ0 | Stosowane do podtrzymywania mikroczipów podczas konfokalnej mikroskopii. Opis: 24 x 60 mm, #1.5 |
| Kriostat | Thermo Fisher Scientific | NX70 | Stosowane do cięcia próbek osadzonej w OCT. |
| Moduł kulturowy (Zoë-CM) | Emulate | support@emulatebio.com | Stosowane do kontroli warunków środowiskowych dla hodowli komórek w mikroczypie. |
| Define trypsin inhibitor (DTI) | Thermo Fisher | R007100 | Stosowane do neutralizacji aktywności trypsyny po oderwaniu komórek nabłonkowych. |
| Dextran Cascade Blue 3KDa | Thermo Fisher | D7132 | Stosowane jako fluorescencyjny śledzik do oceny przepuszczalności bariery. |
| Endothelial cells Growth Medium MV2 kit | PromoCell | C-22022 | Stosowane do utrzymywania i rozmnażania komórek śródbłonka mikrokrążenia płucnego. |
| ER-1 środek do aktywacji powierzchni (światłoczuły proszek do aktywacji) | Emulate | support@emulatebio.com | Stosowane do aktywacji powierzchni mikroczipów przed powlekaniem. |
| ER-2 środek do aktywacji powierzchni (bufor) | Emulate | support@emulatebio.com | Stosowane jako bufor podczas aktywacji powierzchni mikroczipa. |
| Etanol bezwzględny | Thermo Fisher Scientific | 437433T | Stosowane do płukania pelletów RNA podczas ekstrakcji. |
| Fluorescencyjny czytnik płytek | Agilent | BioTek Sinergy H1 microplate reader | Stosowane do pomiaru intensywności fluorescencji w badaniach przepuszczalności. |
| Żelatiny z tkanki skóry wołowej | Sigma-Aldrich | G9391 | Stosowane do powlekania powierzchni hodowlania, aby promować przyleganie komórek śródbłonkowych. |
| Kozara Anti-Mysz Alexa Fluor 488 (dla ZO-1 i β-tubuliny IV) | Thermo Fisher | A11001 | Stosowane do wykrywania pierwotnych przeciwciał mysich z zieloną fluorescencją. |
| Kozara Anti-Mysz Alexa Fluor 594 (dla CD31) | Thermo Fisher | A11005 | Stosowane do wykrywania pierwotnych przeciwciał mysich z czerwoną fluorescencją. |
| Kozara Anti-Królik Alexa Fluor 555 (dla VE-kaderyna) | Thermo Fisher | A21429 | Stosowane do wykrywania pierwotnych przeciwciał króliczych z pomarańczowo-czerwoną fluorescencją. |
| Moduł łączący (Orb-HM) | Emulate | support@emulatebio.com | Stosowane do dostarczania gazu i energii do modułu kulturowego. |
| Komórki nabłonkowe oskrzeli ludzkiego (HBEC) | Lonza | CC-2540S | Stosowane jako komórki nabłonkowe oskrzeli do utworzenia zdrowego modelu współkultury. |
| Kolagen ludzki IV | Sigma | C5533 | Stosowane do powlekania kolb T25, aby promować przyleganie komórek nabłonkowych. |
| Kolagen ludzki typu I | Advanced Biomatrix | 5007 | Stosowane jako składnik roztworu macierzy pozakomórkowej do powlekania mikroczipów. |
| Fibronektyna ludzka | Sigma-Aldrich | F0895 | Stosowane jako składnik roztworu macierzy pozakomórkowej do powlekania mikroczipów. |
| Laminin ludzki | Sigma -Aldrich | L4544 | Stosowane jako składnik roztworu macierzy pozakomórkowej do powlekania mikroczipów. |
Bibliografia
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immun Inflamm Dis. , (2017).
- Sakao, S., Voelkel, N. F., Tatsumi, K. The vascular bed in COPD: pulmonary hypertension and pulmonary vascular alterations. Eur Respir Rev. , (2014).
- Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease: smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. , (2014).
- Blume, C., Davies, D. E. In vitro and ex vivo models of human asthma. Eur J Pharm Biopharm. , (2013).
- Lin, C., et al. Mechanotransduction regulates the interplays between alveolar epithelial and vascular endothelial cells in lung. Front Physiol. , (2022).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Crit Rev Biotechnol. , (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Methods. , (2016).
- Benam, K. H., et al. Matched-comparative modeling of normal and diseased human airway responses using a microengineered breathing lung chip. Cell Syst. , (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. J Cyst Fibros. , (2022).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. , (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. , (2006).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab Chip. , (2015).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung. Eur Respir J. , (2017).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. , (2015).
- Fang, Y., Wu, D., Birukov, K. G. Mechanosensing and mechanoregulation of endothelial cell functions. Compr Physiol. , (2019).
- Santus, P., et al. The airways' mechanical stress in lung disease: implications for COPD pathophysiology and treatment evaluation. Can Respir J. , (2019).