Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Streszczenie

Tuberkuloza (TB) pozostaje jedną z głównych przyczyn śmierci z powodu pojedynczego czynnika zakaźnego na całym świecie, a rosnące wskaźniki oporności na leki sprawiają, że opracowanie nowych leków terapeutycznych jest priorytetem zdrowia publicznego. Ten protokół opisuje podejście do fenotypowego przesiewania w celu zidentyfikowania potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych w trzech zintegrowanych etapach. Po pierwsze, związek z klasy 4-aminochinoliny jest syntetyzowany drogą trójstopniową i w pełni scharakteryzowany za pomocą chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości (HPLC), spektroskopii rezonansu magnetycznego jąder (NMR) oraz spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS). Po drugie, aktywność przeciwdrobnoustrojowa związku jest oceniana wobec Mycobacterium tuberculosis za pomocą kolorymetrycznego testu redukcji resazuryny w płytkach mikrotytrajowych (REMA), który określa minimalne stężenie hamujące (MIC) poprzez prosty wizualny odczyt zmiany koloru. Po trzecie, cytotoksyczność związku jest oceniane w dwóch liniach komórek ssaczy, Vero (afrykański zielony nerkowco gryzoni) i HepG2 (ludzki rak wątrobowokomórkowy), za pomocą testu MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) oraz testu neutralnego czerwienia (NRU). Te dwa uzupełniające się testy mierzą odrębne parametry komórkowe, umożliwiając krzyżową walidację wyników cytotoksyczności. Razem, dane MIC i cytotoksyczności pozwalają na obliczenie indeksu selektywności (SI) w celu oceny potencjału terapeutycznego każdego związku. Ten protokół zapewnia powtarzalny, krokowy szkielet dla wczesnego wykrywania przeciwgruźliczych hitów i oceny przedklinicznej.

Wprowadzenie

Spowodowane przede wszystkim przez pałeczki Mycobacterium tuberculosis (Mtb), gruźlica (TB) jest zakaźną chorobą układu oddechowego u ludzi, która głównie atakuje płuca, choć mogą też wystąpić odmiany pozapłucne. TB rozprzestrzenia się przez powietrze za pomocą wydzielanych przez zakażone osoby prętów Mtb¹. W zależności od postępu choroby, osoba zakażona gruźlicą może natychmiast nabawić czynnej gruźlicy. Zazwyczaj jednak, nowo zakażona osoba rozwija gruźlicę ukrytą, gdzie komórki Mtb o niskiej aktywności metabolicznej przeżywają wewnątrz ziarniniak^1,2. Osoba z ukrytą gruźlicą może ostatecznie rozwinąć czynną formę choroby, manifestując objawy kliniczne³. Obecnie szacuje się, że jedna czwarta populacji świata ma ukrytą infekcję gruźliczą⁴.

Mimo wielu postępów, gruźlica nadal jest poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. Dane z najnowszego Globalnego Raportu o Gruźlicy pokazują, że w 2024 roku chorobę rozwinęło 10,7 miliona ludzi. W tym samym roku, na całym świecie zarejestrowaną liczbę 1,23 miliona zgonów z powodu TB, co czyni gruźlicę główną przyczyną śmierci spowodowane przez pojedynczy czynnik zakaźny⁵. Oprócz patologii i złożonej biologii Mtb, aspekty socjоеkonomiczne takie jak bieda i niedożywienie, wraz z czynnikami zdrowotnymi takimi jak palenie, cukrzyca i współzakażenie HIV, sprawiają, że kontrola choroby jest jeszcze bardziej trudne⁵. To przyczynia się do długotrwałej trwałości gruźlicy jako globalnego problemu zdrowotnego.

Poza tym, obecne leczenie gruźlicy ma ograniczenia, które komplikują walkę z chorobą. W przypadku wrażliwych szczepów Mtb, standardowe leczenie składa się z kombinowanej terapii 4 lekami: izoniazyd (INH), ryfampicyna (RIF), etambutol (EMB) i pyrazynamid (PZA). Te antybiotyki są podawane przez minimum 6 miesięcy, wymagając ścisłego przestrzegania w trakcie leczenia. Ten schemat terapeutyczny, mimo że jest skuteczny w większości przypadków i ma wskaźnik sukcesu około 85%, nadal napotyka wiele wyzwań^5,6. Wśród największych problemów są działania niepożądane i przedłużona czas stosowania, które często prowadzą do przedwczesnego przerwania kuracji przez pacjenta. To przerwanie, wraz z niewłaściwym podawanie antybiotyków, sprzyja selekcji odpornych szczepów Mtb, które wymagają bardziej toksycznych, drogich i rozległych schematów terapeutycznych^7,8.

Mając na uwadze ten scenariusz, rozwój nowych, potężnych leków przeciwgruźliczych jest pilny. Ten protokół opisuje wczesne etapy badań nad nowymi kandydatami do leków za pomocą fenotypowego przesiewania. Aby zilustrować zastosowanie tego protokołu, wybraliśmy pochodną 4-aminochinoliny LABIO-17 do oceny. LABIO-17 zostało wcześniej zidentyfikowane przez naszą grupę badawczą jako inhibitor enoyl-ACP-reduktazy (InhA) enzymu w Mtb, który jest tym samym molekularnym celem jak izoniazyd (INH)^9,10. InhA jest zaangażowany w biosyntezę kwasów mykolowych w M. tuberculosis i jest niezbędny dla przetrwania pałeczki, co podkreśla jego znaczenie jako obiecującego molekularnego celu¹¹

Protokół

1. Synteza chemiczna i charakterystyka

UWAGA: Synteza i charakterystyka związku chemicznego zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁰. Wszystkie kroki od 1.1 do 1.4 należy wykonywać w dobrze wentylowanej dygestorze, używając rękawiczek nitrylowych.

1. Przygotowanie odczynników
   1. Przygotowanie MeOH/CH₃CN (1:1) z 0,1% kwasem mrówkowym
      1. Odmierzyć równe objętości metanolu (MeOH) i acetonitrylu (CH₃CN), aby przygotować mieszaninę 1:1 (v/v) (czystość HPLC).
      2. Połączyć rozpuszczalniki w czystym, suchym naczyniu (np. kolbie miarowej). Dodać kwas mrówkowy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% (v/v) (np. dodać 1 mL kwasu mrówkowego do 1 L mieszaniny rozpuszczalników).
      3. Wymieszać dokładnie poprzez delikatne potrząsanie kołowe lub mieszanie. Przechowywać w szczelnie zamkniętym naczyniu w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
   2. Przygotowanie 1% (v/v) kwasu octowego w wodzie ultrapurej
      1. Opłukać kolbę miarową wodą ultrapureą, a następnie postawić ją na blacie. Dodać do kolby ok. 80% końcowej objętości wody ultrapurej (np. 80 mL dla kolby 100 mL; 800 mL dla kolby 1 L).
      2. Za pomocą skalibrowanej pipety dodać bezwodny kwas octowy, aby uzyskać stężenie 1% (v/v): dla końcowej objętości 100 mL → dodać 1,0 mL kwasu octowego; dla końcowej objętości 1 L → dodać 10,0 mL kwasu octowego.
      3. Wymieszać dokładnie poprzez potrząsanie kołowe lub mieszanie. Dopełnić kolbę wodą ultrapureą do kreski i wymieszać.
      4. Odgazować roztwór poprzez sonikację w myjce ultradźwiękowej (częstotliwość zbiornika ~40 kHz) ustawionej w trybie odgazowywania przez 20 min w temperaturze otoczenia.
      5. Przenieść do oznakowanej butelki bursztynowej (etykieta: zawartość, stężenie, czystość rozpuszczalnika, data, osoba przygotowująca). Przechowywać szczelnie zamkniętą w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotowanie acetonitrylu:metanolu (1:1, v/v), czystości HPLC
      1. Odmierzyć równe objętości acetonitrylu i metanolu: dla końcowej objętości 100 mL → 50,0 mL acetonitrylu + 50,0 mL metanolu; dla końcowej objętości 1 L → 500 mL acetonitrylu + 500 mL metanolu.
      2. Połączyć rozpuszczalniki w czystej kolbie miarowej lub butelce i wymieszać poprzez odwracanie lub mieszanie. Przefiltrować mieszaninę przez filtr 0,45 µm do czystego naczynia w celu usunięcia cząstek stałych.
      3. Odgazować roztwór poprzez sonikację w myjce ultradźwiękowej (częstotliwość zbiornika ~40 kHz) ustawionej w trybie odgazowywania przez 20 min w temperaturze otoczenia.
      4. Przenieść do oznakowanej butelki bursztynowej (etykieta: skład, czystość rozpuszczalnika, data, osoba przygotowująca). Przechowywać szczelnie zamkniętą w temperaturze pokojowej, z dala od ciepła i światła.
   4. Przygotowanie roztworu heksanu/octanu etylu 7:3 (v/v) do chromatografii kolumnowej
      1. Odmierzyć 70% końcowej objętości heksanu. Przykład: dla końcowej objętości 100 mL → 70 mL heksanu.
      2. Odmierzyć 30% końcowej objętości octanu etylu. Przykład: dla końcowej objętości 100 mL → 30 mL octanu etylu.
      3. Połączyć oba rozpuszczalniki w czystym, suchym naczyniu (np. kolbie miarowej lub butelce).
      4. Wymieszać dokładnie poprzez odwracanie lub mieszanie aż do uzyskania homogeniczności. Oznaczyć naczynie składem, datą, czystością rozpuszczalnika oraz osobą przygotowującą.
   5. Przygotowanie roztworu heksanu/octanu etylu 1:1 (v/v) do chromatografii kolumnowej
      1. Odmierzyć 50% końcowej objętości heksanu. Przykład: dla końcowej objętości 100 mL → 50 mL heksanu.
      2. Odmierzyć 50% końcowej objętości octanu etylu. Przykład: dla końcowej objętości 100 mL → 50 mL octanu etylu.
      3. Połączyć oba rozpuszczalniki w czystym, suchym naczyniu (np. kolbie miarowej lub butelce). Wymieszać dokładnie poprzez odwracanie lub mieszanie aż do uzyskania homogeniczności.
      4. Oznaczyć naczynie składem, datą, czystością rozpuszczalnika oraz osobą przygotowującą.
   6. Przygotowanie nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu (NaHCO₃)
      1. Odważyć nadmiar wodorowęglanu sodu (NaHCO₃) (około 15–20 g na każde 100 mL wody).
      2. Dodać wodorowęglan sodu do czystego zlewki zawierającej określoną objętość wody destylowanej (na przykład 100 mL). Mieszać mieszaninę nieprzerwanie w temperaturze pokojowej (20–25 °C) za pomocą mieszadła magnetycznego lub szklanej rurki.
      3. Kontynuować mieszanie, aż do momentu, gdy nie będzie się rozpuszczać więcej ciała stałego i na dnie pozostanie niewielka ilość nierozpuszczonego wodorowęglanu sodu — wskazuje to, że roztwór jest nasycony.
      4. Pozostawić zawiesinę na 10–15 min, aby nierozpuszczone ciało stałe osiadło. Przefiltrować mieszaninę przez filtr papierowy lub lejek z frity szklanej, aby usunąć nadmiar nierozpuszczonego wodorowęglanu.
      5. Zebrać klarowny filtrat, który stanowi nasycony roztwór wodorowęglanu sodu.
      6. Przechowywać roztwór w szczelnie zamkniętej butelce, odpowiednio oznakowanej nazwą związku, stężeniem (nasycony), datą przygotowania i parafą.
      7. Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej i przygotowywać świeżą partię w razie potrzeby, ponieważ CO₂ może powoli uciekać, zmieniając stężenie w czasie.
2. Synteza 6-bromo-2-metylochinolin-4-olu (3)
   1. Przygotować roztwór zawierający 4-bromoanilinę (1,2 g, 7,3 mmol) i bezwodny siarczan magnezu (1,08 g, 9,0 mmol) w etanolu (15 mL).
   2. Dodać do roztworu bezwodny kwas octowy (0,33 mL) oraz acetoacetan etylu (1,8 mL, 14,1 mmol). Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 90 °C przez 16 h.
   3. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez celulozowy papier filtracyjny jakościowy o retencji 11 µm, aby usunąć zawieszony siarczan magnezu.
   4. Odparować etanol za pomocą ewaporatora obrotowego, aby uzyskać produkt pośredni w formie akrylanu.
   5. Podgrzać produkt pośredni w odpowiedniej kąpieli olejowej zawierającej wysokowydajny syntetyczny nośnik ciepła (zob. Tabela Materiałów) (15 mL) w temperaturze 230–250 °C przez 15 min, aby dopełnić reakcję.
   6. Ochłodzić mieszaninę do temperatury pokojowej. Przefiltrować powstały osad i przemyć go heksanem oraz chloroformem.
   7. Skoncentrować produkt końcowy pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą ewaporatora obrotowego, aż do usunięcia wszystkich pozostałości rozpuszczalników (zob. Tabela Materiałów).
3. Synteza 6-bromo-4-chloro-2-metylochinoliny (4)
   1. Przygotować roztwór 6-bromo-2-metylochinolin-4-olu (0,65 g, 2,8 mmol) w toluenie (10 mL). Dodać do roztworu oxychlorek fosforu(V) (0,65 mL, 6,9 mmol).
   2. Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 110 °C przez 2 h. Usunąć nadmiar oxychlorku fosforu(V) za pomocą ewaporatora obrotowego.
   3. Ochłodzić pozostałość w łaźni lodowej. Zneutralizować mieszaninę reakcyjną nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu.
   4. Wyekstrahować produkt octanem etylu (3 x 50 mL). Połączyć fazy organiczne i osuszyć je nad bezwodnym siarczanem sodu.
   5. Odparować rozpuszczalnik za pomocą ewaporatora obrotowego, aby uzyskać ciało stałe. Osuszyć otrzymane ciało stałe za pomocą ewaporatora obrotowego, aby uzyskać produkt surowy.
   6. Oczyścić związek metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym (35–70 mesh), używając mieszaniny heksan:octan etylu (7:3) jako eluentu.
4. Synteza 6-bromo-2-metylo-N-(4-(piperidin-1-ylo)fenylo)chinolin-4-aminy (6)
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą 6-bromo-4-chloro-2-metylochinline (0,53 g, 2 mmol), 4-(piperidin-1-ylo)anilinę (0,57 g, 3 mmol), pirydynę (0,24 mL) i HCl 37% (0,2 mL) w izopropanolu (20 mL).
   2. Mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 85 °C przez 16 h. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą ewaporatora obrotowego.
   3. Potraktować pozostałość nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu.
   4. Przefiltrować otrzymane ciało stałe przez celulozowy papier filtracyjny jakościowy o retencji 11 µm i rozpuścić je w chloroformie (50 mL).
   5. Przemyć roztwór chloroformowy wodą (3 x 15 mL). Osuszyć fazę organiczną nad bezwodnym siarczanem sodu.
   6. Odparować rozpuszczalnik za pomocą ewaporatora obrotowego, aby uzyskać zielone ciało stałe. Oczyścić produkt poprzez sukcesywne przemywanie gorącym heksanem (4 x 10 mL).
   7. Przeprowadzić końcowe oczyszczanie metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym (35–70 mesh), używając mieszaniny heksan:octan etylu (1:1) jako eluentu.
5. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
   1. Monitorować przebieg reakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach Silica gel 60 F254.
   2. Użyć związku wyjściowego 4 jako wzorca do monitorowania reakcji i oceny stopnia jego zużycia.
6. Temperatura topnienia (m.p.)
   1. Dodać niewielką ilość związku (na czubku szpatułki) do aparatury do pomiaru temperatury topnienia. Zapisać zakres temperatury topnienia.
   2. Nie stosować żadnych korekt do zmierzonych wartości. Wykonać eksperyment w trzech powtórzeniach.
7. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
   1. Odważyć 1–2 mg związku 6. Przygotować roztwór stokowy związku o stężeniu 1,0 mg/mL w acetonitrylu/metanolu (1:1, v/v).
   2. Rozcieńczyć roztwór stokowy do stężenia 0,5 mg/mL do analizy. Analizować próbki za pomocą systemu HPLC (zob. Tabela Materiałów) wyposażonego w podwójną pompę, automatyczny injektor i detektor UV.
   3. Pozyskać i przetworzyć dane za pomocą oprogramowania do akwizycji danych chromatograficznych (zob. Tabela Materiałów).
   4. Ustawić warunki chromatograficzne w następujący sposób: użyć kolumny C18 w odwróconej fazie, 5 µm (250 x 4,6 mm) (zob. Tabela Materiałów). Ustawić przepływ na 1,5 mL/min i monitorować detekcję UV przy 254 nm. Utrzymywać fazę ruchomą na poziomie 100% wody (0,1% kwasu octowego) od 0 do 7 min; zastosować gradient liniowy od 100% wody (0,1% kwasu octowego) do 90% acetonitrylu/metanolu (1:1, v/v) od 7 do 15 min; powrócić do 100% wody (0,1% kwasu octowego) w ciągu 5 min i utrzymać przez dodatkowe 10 min.
8. Magnetyczny rezonans jądrowy (¹H, ¹³C)
   1. Odważyć 15–20 mg związku 6 do probówki NMR. Dodać DMSO-d₆ jako rozpuszczalnik.
   2. Pozyskać widma NMR ¹H i ¹³C na spektrometrze NMR (zob. Tabela Materiałów), stosując standardowe sekwencje impulsów.
   3. Ustawić instrument na 400 MHz dla jąder ¹H oraz 100 MHz dla jąder ¹³C. Użyć tetrametylosilanu (TMS) jako wzorca wewnętrznego.
   4. Wyrazić przesunięcia chemiczne (δ) w częściach na milion (ppm). Użyć pliku FID otrzymanego z eksperymentu do wizualizacji i przetwarzania danych NMR.
9. Wysokorozdzielcza spektrometria mas (HRMS)
   1. Odważyć 1–2 mg związku 6. Przygotować próbkę w mieszaninie MeOH/CH₃CN (1:1) zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego.
   2. Przeprowadzić analizę na wysokorozdzielczym spektrometrze mas Orbitrap (zob. Tabela Materiałów), który łączy liniowy spektrometr mas z pułapką jonową z analizatorem masy Orbitrap.
   3. Wprowadzić próbkę poprzez bezpośrednią infuzję przy przepływie 10 µL/min w trybie jonów dodatnich, stosując jonizację przez rozpylanie elektryczne (ESI).
   4. Wyznaczyć skład pierwiastkowy za pomocą narzędzia do analizy składu pierwiastkowego w oprogramowaniu do analizy danych spektrometrii mas (zob. Tabela Materiałów).
10. Chromatografia kolumnowa – Związek 4
    1. Przygotować kolumnę z żelem krzemionkowym, używając żelu krzemionkowego 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 mm). Odpowiednio upakować kolumnę żelem krzemionkowym.
    2. Użyć mieszaniny heksan/octan etylu (7:3, v/v) jako fazy ruchomej. Nanieść surowy związek 4 na kolumnę. Eluować związek i zbierać frakcje.
    3. Monitorować frakcje za pomocą TLC i połączyć te zawierające czysty produkt.
11. Chromatografia kolumnowa – Związek 6
    1. Przygotować kolumnę z żelem krzemionkowym, używając żelu krzemionkowego 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 mm). Odpowiednio upakować kolumnę żelem krzemionkowym.
    2. Użyć mieszaniny heksan/octan etylu (1:1, v/v) jako fazy ruchomej. Nanieść surowy związek 6 na kolumnę. Eluować związek i zbierać frakcje.
    3. Monitorować frakcje za pomocą TLC i połączyć te zawierające czysty produkt.

Rysunek 1. Odczynniki i warunki: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 h; ii = C₁₂H₁₀, C₁₂H₁₀O, 230-250 °C, 15 min; iii = POCl₃, toluen, 110 °C, 2 h; iv = pirydyna, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 h. Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

2. Wyznaczanie minimalnego stężenia hamującego

1. Projekt doświadczenia i układ płytki
   1. Ocenia się zdolność związków do hamowania wzrostu M. tuberculosis za pomocą kolorymetrycznego testu redukcji rezazuryny na płytkach mikrodołkowych (REMA) w celu wyznaczenia minimalnego stężenia hamującego (MIC), zgodnie z wcześniejszymi opisami^11,12,13.
   2. Przeprowadza się trzy niezależne eksperymenty (trzy powtórzenia biologiczne) dla każdego badanego związku, bez powtórzeń technicznych (jeden rząd na związek i jedna płytka na eksperyment).
   3. Związki pełniące rolę kontroli pozytywnych ocenia się wraz ze związkami badanymi, aby upewnić się, że warunki testu umożliwiają hamowanie wzrostu.
   4. W roli kontroli pozytywnych analizuje się izoniazyd (INH) i ryfampicynę (RIF).
   5. Rzędy A i B przypisuje się związkom kontrolnym (odpowiednio INH i RIF).
   6. Kolejne rzędy przypisuje się związkom badanym (związki od A do F na Rysunku 2).
   7. W kolumnach od 1 do 10 przygotowuje się dwukrotne rozcieńczenia szeregowe związków kontrolnych i badanych, tak aby każdy związek zajmował jeden rząd, przy czym najwyższe stężenie znajduje się w kolumnie 10, a najniższe w kolumnie 1.
   8. Kolumnę 11 przygotowuje się jako kontrolę żywotności, zawierającą pożywkę wzrostową i bakterie przy końcowym stężeniu DMSO wynoszącym 2,5%, bez dodawania jakiegokolwiek związku kontrolnego lub badanego.
   9. Kolumnę 12 przygotowuje się jako kontrolę sterylności poprzez dodanie związków kontrolnych lub badanych w najwyższym stężeniu z rozcieńczenia szeregowego (takim samym jak w kolumnie 10) do pożywki wzrostowej bez komórek bakteryjnych.
   10. Reprezentatywny układ płytki do wyznaczania MIC przedstawiono na Rysunku 2.
2. Przygotowanie odczynników
   1. Przygotowanie bulionu Middlebrooka 7H9 uzupełnionego o kwas oleinowy, albuminę, dekstrozę i katalazę (OADC).
      1. Do szklanej butelki o pojemności 200 mL zawierającej 90 mL wody ultraczystej dodaje się 0,47 g proszku 7H9, 0,24 mL 85% glicerolu i 0,5 mL 10% Tween-80.
      2. Pożywkę autoklawuje się przez 10 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 98,07 kPa.
      3. Pozwala się pożywce ostygnąć, aż będzie ciepła w dotyku (ok. 45–50 °C).
      4. Dodaje się 10 mL OADC (stosujemy dostępny komercyjnie OADC; szczegóły w Tabeli Materiałów).
      5. Przechowuje się w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Należy przygotować odpowiednią ilość na eksperyment, uwzględniając proporcje odczynników.
   2. Przygotowanie bulionu Middlebrooka 7H9 z ADC
      1. Do szklanej butelki o pojemności 200 mL zawierającej 90 mL wody ultraczystej dodaje się 0,47 g proszku 7H9. Pożywkę autoklawuje się przez 10 min w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 98,07 kPa.
      2. Pozwala się pożywce ostygnąć, aż będzie ciepła w dotyku (ok. 45–50 °C). Dodaje się 10 mL ADC. Przechowuje się w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Należy przygotować odpowiednią ilość na eksperyment, zachowując proporcje odczynników.
   3. Przygotowanie roztworów zapasowych związków
      1. Przygotowuje się roztwór zapasowy każdego związku o stężeniu 2 mg/mL rozpuszczony w DMSO.
      2. Przechowuje się w temperaturze –20 °C.
         UWAGA: Przed eksperymentem maksymalne stężenie badawcze jest definiowane na podstawie oceny rozpuszczalności. Aby wyznaczyć granicę rozpuszczalności, wizualnie sprawdza się roztwory pod kątem obecności kryształów. Jeśli zaobserwowano kryształy, alikwot rozciecza się do połowy poprzedniego stężenia. Ocenę tę przeprowadza się w 5% DMSO.
   4. Przygotowanie roztworów roboczych związków
      UWAGA: Roztwory robocze powinny być świeżo przygotowywane w dniu eksperymentu poprzez rozcieńczenie związków zapasowych w bulionie 7H9 uzupełnionym o 10% ADC. Końcowe stężenie DMSO w roztworze roboczym powinno wynosić 5%, a stężenie związku powinno być dwukrotnie wyższe od najwyższego zamierzonego stężenia badawczego. Warto zaznaczyć, że końcowe stężenie DMSO, na które narażone są bakterie podczas testu, wynosi 2,5%, ponieważ objętość ulega podwojeniu po dodaniu zawiesiny bakteryjnej (patrz sekcja 2.3, krok 2.3.8).
      UWAGA: Stężenie 2,5% DMSO jest tolerowane przez szczepy bakteryjne używane w naszym laboratorium (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv oraz izolaty kliniczne). W przypadku pracy z innymi szczepami lub innymi gatunkami bakterii należy przeprowadzić wstępny eksperyment MIC, używając DMSO jako związku badanego, aby wyznaczyć najwyższe stężenia DMSO, które można zastosować bez wywoływania hamowania wzrostu.
   5. Przygotowanie roztworu rezazuryny
      1. Przygotowuje się 0,01% roztwór rezazuryny, rozpuszczając 1 mg rezazuryny w 10 mL wody ultraczystej.
      2. Roztwór sterylizuje się za pomocą filtra 0,22 µm.
         UWAGA: Sterylizowana filtrem rezazuryna może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień¹⁴. Niemniej jednak, zgodnie ze standardową praktyką, roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
3. Przygotowanie prątków
   1. Pojedynczą kolonię M. tuberculosis szczepia się do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL zawierającej 10 mL bulionu 7H9 uzupełnionego o 10% OADC, 0,2% glicerolu i 0,05% Tween-80.
   2. Inkubuje się przy stałym mieszaniu (100 rpm) w temperaturze 37 °C, aż kultura osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) od 0,6 do 0,8 (około 3 do 4 tygodni).
      OSTROŻNIE: M. tuberculosis H37Rv jest klasyfikowany jako patogen z grupy ryzyka 3, zdolny do przenoszenia drogą powietrzną i wywoływania potencjalnie śmiertelnej choroby u ludzi. Wszystkie manipulacje należy przeprowadzać w certyfikowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza w laboratorium poziomu bezpieczeństwa 3 (BSL-3), stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI).
   3. Kulturę bakteryjną homogenizuje się za pomocą vortexera z jałowymi szklanymi kuleczkami (1 mm) przez 3 min.
   4. Pozostawia się zawiesinę na 15 min, aby grudki opadły.
   5. Pomiar OD₆₀₀ wykonuje się dla supernatantu, a alikwoty przechowuje w temperaturze −80 °C.
      UWAGA: Do eksperymentów zawiesinę bakteryjną rozciecza się do teoretycznej wartości OD₆₀₀ wynoszącej 0,006 w świeżym bulionie 7H9 uzupełnionym o 10% ADC. Podczas testu do dołków płytek 96-dołkowych dozuje się 100 µL.
4. Przygotowanie płytek 96-dołkowych
   1. Do kolumny 12 dodaje się 100 µL bulionu 7H9 uzupełnionego o 10% ADC.
   2. Do kolumn 11 oraz od 9 do 1 dodaje się 100 µL bulionu 7H9 uzupełnionego o 10% ADC (zawierającego 5% DMSO).
   3. Do kolumny 10 dodaje się 200 µL roztworu związku (przygotowanego w dwukrotności najwyższego stężenia badawczego) (przypisując jeden rząd na związek).
   4. Do kolumny 12 dodaje się 100 µL roztworu związku. Wykonuje się dwukrotne rozcieńczenie szeregowe: przenosi się 100 µL z kolumny 10 do kolumny 9 i dobrze miesza poprzez pipetowanie.
   5. Kontynuuje się rozcieńczenie szeregowe od kolumny 9 aż do kolumny 1. Ostatnie 100 µL z kolumny 1 odrzuca się.
   6. Do kolumn od 11 do 1 dodaje się 100 µL zawiesiny bakteryjnej (teoretyczna OD₆₀₀ wynosząca 0,006).
   7. Płytkę przykrywa się, uszczelnia parafilmem i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
      UWAGA: Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny układ płytki MIC. Należy odwołać się do tego rysunku w celu interpretacji kroków od 2.3.1 do 2.3.9.
5. Dodanie rezazuryny i analiza danych
   1. Do każdego dołka płytki dodaje się 60 µL 0,01% roztworu rezazuryny. Płytkę przykrywa się, uszczelnia parafilmem i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 48 h.
   2. Obserwuje się zmianę koloru z niebieskiego (hamowanie wzrostu) na różowy (wzrost bakterii).
      UWAGA: W niektórych eksperymentach niepełna zmiana koloru skutkuje fioletowym dołkiem. Należy interpretować to jako wzrost bakterii.

Rycina 2. Schematyczne przedstawienie płytki do mikrorozcieńczeń w bulionie stosowanej do oznaczenia minimalnego stężenia hamującego (MIC). Dwukrotne rozcieńczenia seryjne badanych związków rozmieszczono w kolumnach 1–10; kolejne rozcieńczenia wykonano sekwencyjnie od kolumny 10 do kolumny 1, przy czym najwyższe stężenie związku znajduje się w kolumnie 10. Rzędy A i B odpowiadają kontrolom dodatnim zawierającym odpowiednio referencyjne leki: izoniazyd i ryfampicynę. Rzędy C–H odpowiadają badanym związkom. Kolumna 11 stanowi kontrolę żywotności (podłoże zawierające 2,5% DMSO i inokulum bakteryjne), natomiast kolumna 12 odpowiada kontroli sterylności (podłoże zawierające związki w obecności braku inokulum bakteryjnego). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Ocena cytotoksyczności w liniach komórek ssaków

UWAGA: Wszystkie manipulacje z kulturami komórkowymi należy przeprowadzać w warunkach sterylnych, w certyfikowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II.

1. Przygotowanie linii komórkowych ssaków
   1. Hodować linie komórkowe raka wątroby człowieka (HepG2) i nerki zielonej małpy afrykańskiej (Vero) w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
   2. Uzupełnić podłoże o 1,8 g/L wodorowęglanu sodu, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny oraz 0,1% amfoterycyny B (podłoże kompletne).
   3. Inkubować hodowle komórkowe w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z zawartością 5% CO₂.
   4. Zebrać komórki przed osiągnięciem pełnej konfluencji (70%–80%), traktując je 0,25% roztworem trypsyny-EDTA przez 5–10 min.
   5. Zneutralizować trypsynę, dodając równą objętość podłoża kompletnego. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 mL i odwirować z prędkością 200 x g przez 5 min.
   6. Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 10 mL świeżego podłoża kompletnego.
   7. Określić koncentrację i żywotność komórek za pomocą automatycznej licznika komórek lub hemocytometru z użyciem metody wykluczania błękitu trypanowego.
      UWAGA: W celu wykluczania błękitu trypanowego zmieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL 0,4% roztworu błękitu trypanowego i nanieść na hemocytometr (lub szkiełko do liczenia). Komórki martwe lub z uszkodzoną błoną przybierają kolor niebieski, natomiast komórki żywe pozostają niezbarwione. Obliczyć żywotność według wzoru: % żywotności = (komórki niezbarwione / całkowita liczba komórek) x 100. Przystąpić do wysiewania tylko wtedy, gdy żywotność wynosi ≥ 90%.
   8. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do docelowej gęstości wysiewu. Wysiać 100 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka w kolumnach od 2 do 12 na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
      Gęstości wysiewu: 4 000 komórek/dołek dla komórek Vero; 5 000 komórek/dołek dla komórek HepG2.
      UWAGA: Zoptymalizować te gęstości, aby upewnić się, że komórki pozostaną w logarytmicznej fazie wzrostu i nie osiągną 100% konfluencji przed zakończeniem 48-godzinnego testu.
   9. Wypełnić kolumnę 1 ilością 100 µL podłoża kompletnego (bez komórek), aby służyła jako ślepa próba do pomiarów absorbancji.
   10. Przygotować cztery identyczne płytki dla każdej linii komórkowej: dwie do testu MTT i dwie do testu NRU.
   11. Inkubować płytki przez 24 h w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, aby umożliwić przywieranie komórek.
2. Rozcieńczanie związków i traktowanie komórek
   1. Przygotować roztwory stokowe dla każdego badanego związku w soli fizjologicznej DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) lub odpowiednim rozpuszczalniku (np. dimetylosulfoksydzie; DMSO).
      UWAGA: Przed testem sprawdzić, czy związek jest rozpuszczalny w podłożu hodowlanym i czy stężenie rozpuszczalnika nie jest toksyczne (np. <0,1% v/v dla DMSO).
   2. Opracować układ płytki, uwzględniając ślepe próby, odpowiednie kontrole i powtórzenia techniczne. Reprezentatywny układ dla badania do 9 związków w 8 stężeniach przedstawiono na Rysunku 3.
   3. Przygotować rozcieńczenia szeregowe badanego związku (lub związków) w podłożu kompletnym, aby objęły zamierzony zakres stężeń. Zapewnić przygotowanie wystarczającej objętości dla wszystkich powtórzonych płytek.
      UWAGA: W przypadku stosowania rozpuszczalnika (np. DMSO), uzupełnić podłoże do rozcieńczeń tak, aby końcowe stężenie rozpuszczalnika pozostało stałe w całym szeregu rozcieńczeń.
      UWAGA: Dołki traktowane rozpuszczalnikiem (kontrola nośnika) służą jako funkcjonalna kontrola negatywna, definiująca 100% żywotności komórek, względem której normalizuje się dołki traktowane związkami. W celu walidacji testu należy uwzględnić cytotoksyczny związek referencyjny (np. 0,1% Triton X-100 lub 1 mM dodecylu siarczanu sodu) w stężeniu znanym z wywoływania całkowitej śmierci komórek (0% żywotności). Wartości absorbancji w tych dołkach kontroli pozytywnej nie powinny znacząco różnić się od wartości w dołkach ślepych, co potwierdza 0% żywotności.
   4. Po 24-godzinnym okresie przywierania komórek sprawdzić wizualnie płytki pod mikroskopem odwróconym, aby potwierdzić, że komórki przywarły, rozpostarły się i pokrywają około 70%–80% powierzchni dołka z jednorodną konfluencją. Odrzucić płytki wykazujące kontaminację lub niewystarczające przywieranie.
   5. Ostrocygnąć podłoże hodowlane za pomocą końcówki pipety, kierując końcówkę pod kątem do ścianki każdego dołka, aby nie zakłócić monowarstwy komórek. Przetwarzać płytki sekcjami, aby zapobiec wysychaniu.
   6. Niezwłocznie dodać 100 µL odpowiednich rozcieńczeń badanego związku lub podłoży kontrolnych do odpowiadających im dołków.
   7. Inkubować traktowane płytki przez 48 h w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
3. Protokół testu MTT
   1. Przygotować roztwór MTT o stężeniu 0,5 mg/mL w beztłuszczowym podłożu DMEM. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 µm i chronić przed światłem.
   2. Po 48-godzinnym traktowaniu sprawdzić wizualnie komórki, aby potwierdzić oczekiwane efekty działania.
   3. Ostrocygnąć podłoże z płytek MTT. Dodać 50 µL roboczego roztworu MTT 0,5 mg/mL do każdego dołka.
   4. Inkubować przez 3 h w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Choć powszechnie stosuje się czas od 2 do 4 h, 3-godzinna inkubacja jest zazwyczaj wystarczająca dla komórek Vero i HepG2. W razie potrzeby zoptymalizować czas.
   5. Dodać 100 µL 100% DMSO do każdego dołka, aby rozpuścić kryształy formazanu. Umieścić płytki na wstrząsarce orbitalnej przy 100 rpm przez 15 min, chroniąc przed światłem. Sprawdzić dołki kontrolne, aby upewnić się, że kryształy całkowicie się rozpuściły. Odczytać absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Jeśli jest dostępna, ustawić długość fali referencyjnej 630–690 nm.
4. Protokół testu pobierania czerwieni neutralnej (NRU)
   1. Przygotować roztwór czerwieni neutralnej (NR) o stężeniu 40 µg/mL w beztłuszczowym podłożu DMEM i przefiltrować. Przygotować roztwór desorpcyjny NR: 1% (v/v) lodowatego kwasu octowego, 49% (v/v) etanolu i 50% (v/v) ultraczystej wody.
      OSTROŻNIE: Lodowaty kwas octowy jest żrący; należy z nim pracować pod wyciągiem (dygestorium).
   2. Po 48-godzinnym traktowaniu sprawdzić wizualnie komórki. Ostrocygnąć podłoże z płytek NRU.
   3. Dodać 100 µL roboczego roztworu NR 40 µg/mL do każdego dołka. Inkubować przez 2 h w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
      UWAGA: 2-godzinna inkubacja jest wystarczająca dla maksymalnego pobrania barwnika w tych liniach komórkowych.
   4. Odssać roboczy roztwór NR. Delikatnie wypłukać każdy dołek raz, używając 150 µL sterylnego PBS.
   5. Dodać 150 µL roztworu desorpcyjnego NR do każdego dołka. Umieścić na wstrząsarce orbitalnej przy 150 rpm przez 15 min w celu ekstrakcji barwnika.
   6. Sprawdzić dołki kontrolne, aby upewnić się, że barwnik został całkowicie wyekstrahowany. Odczytać absorbancję przy 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
5. Analiza danych
   1. Wykonać odjęcie tła poprzez obliczenie średniej absorbancji kolumn ślepych i odjęcie tej wartości od wszystkich dołków.
   2. Przeprowadzić kontrolę toksyczności rozpuszczalnika, porównując dołki kontroli rozpuszczalnika z kontrolami nietraktowanymi. Jeśli żywotność spadnie poniżej określonego progu (np. 80%), należy uwzględnić cytotoksyczność rozpuszczalnika.
   3. Obliczyć procent żywotności w stosunku do dołków kontroli rozpuszczalnika:
      % żywotności = (absorbancja dołka traktowanego / średnia absorbancja kontroli rozpuszczalnika) x 100.
   4. Wykreślić % żywotności (oś y) względem log₁₀ stężenia związku (oś x). Użyć nieliniowego modelu regresji (sigmoidalna odpowiedź na dawkę, zmienne nachylenie), aby wyznaczyć CC₅₀.
   5. Obliczyć indeks selektywności (SI), dzieląc CC₅₀ przez MIC.

Rycina 3. Przykład projektu płytki do wstępnego przesiewania w teście żywotności komórek MTT/NRU w celu zbadania cytotoksyczności do 9 związków. (A) Schemat projektu płytki. Kolumna 1 jest przypisana jako „blank” (próba ślepa), bez komórek, i wypełniona DPBS lub pożywką kompletną. Kolumny 2 i 12 są zasiane komórkami i traktowane pożywką kompletną („kontrola nieleczona”) lub pożywką kompletną z rozpuszczalnikiem („kontrola rozpuszczalnika”). Kolumny od 3 do 11 są zasiane komórkami i traktowane rozcieńczeniami szeregowymi testowanych związków, do 9 związków z jedną powtórzeniem dla każdego testowanego stężenia na związek. (B) Reprezentatywne fotografie płytki NRU z komórkami Vero (powyżej) oraz płytki MTT z komórkami Vero (poniżej) po 48 h inkubacji i końcowych etapach testu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Synteza pozwoliła na otrzymanie docelowego związku 6 w formie jasnozielonego ciała stałego (0,53 g, wydajność 67%). Związek wykazuje temperaturę topnienia 227–229 °C oraz czystość w UHPLC na poziomie 99% (t_R = 14,11 min) (Rysunek 4). Strukturę chemiczną potwierdzono za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości (HRMS). Widmo ¹H NMR (Rysunek 5) wykazało sygnały odpowiadające fragmentowi piperydynowemu w zakresie od 1,50 do 3,13 ppm. Grupa metylowa w pozycji 2 pojawiła się jako typowy singlet przy 2,38 ppm. Wodór w pozycji 3 pojawił się jako singlet przy 6,56 ppm. Pierścień fenylowy wykazał dwa dublety przy 6,97 i 7,17 ppm, ze stałą sprzężenia 8,9 Hz. Wodory w pozycjach 7 i 8 utworzyły multiplet przy 7,63–7,75 ppm, natomiast wodór w pozycji 5 rdzenia chinolinowego dał dublet przy 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). Wodór grupy aminowej zaobserwowano jako singlet przy 8,66 ppm. Widmo ¹³C NMR (Rysunek 6) wykazało sygnał przy 23,81 ppm przypisany grupie metylowej w pozycji 2, natomiast sygnały między 24,85 a 49,70 ppm odpowiadały fragmentowi piperydynowemu. Węgiel w pozycji 3 pojawił się przy 100,52 ppm. Pozostałe sygnały przesunięte w pole słabsze przypisano węglom rdzenia chinolinowego i pierścienia fenylowego. HRMS potwierdziło wzór cząsteczkowy związku 6, wykazując jon [M+H]⁺ przy m/z 396,1063 (obliczone dla C₂₁H₂₃BrN₃: 396,1070).

Rycina 4. Chromatogram HPLC i widma UV związku 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5. Widma ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) związku 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6. Widma ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6) związku 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Aktywność hamującą związku przeciwko M. tuberculosis oceniano poprzez wyznaczenie MIC, zdefiniowanej jako najniższe stężenie związku, które całkowicie zapobiega widocznemu wzrostowi bakterii. W teście REMA brak zmiany barwy (pozostanie koloru niebieskiego) wskazuje na zahamowanie wzrostu, natomiast zmiana na kolor różowy oznacza wzrost bakterii. W charakterze kontroli leków zastosowano izoniazyd (INH) i rifampicynę (RIF). Wyniki przedstawiono na Ryc. 7. Na każdej płytce znajdowała się kontrola wzrostu (kolumna 11, bez leków) oraz kontrola sterylności (kolumna 12, bez prątków). Związki rozcieczano seryjnie od kolumny 10 (najwyższe stężenie) do kolumny 1 (najniższe stężenie). Jak pokazano na Ryc. 7>, wartość MIC dla związku w rzędzie A (izoniazyd) zaobserwowano w kolumnie 4, natomiast wartości MIC dla związków w rzędach B (rifampicyna) i C (związek syntetyzowany) zaobserwowano w kolumnie 5. W naszych badaniach wartości MIC dla INH wyniosły 0,31 µg/mL dla szczepu H37Rv i 0,16 µg/mL dla H37Ra, natomiast dla RIF otrzymano 0,08 µg/mL dla H37Rv i 0,01 µg/mL dla szczepu H37Ra.

Rycina 7. Oznaczanie minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla Mycobacterium tuberculosis przy użyciu testu z rezazuryną na mikro-płytce (REMA). Rzędy A–C, kolumny 1–10: dwukrotne rozcieńczenia seryjne izoniazydy (rzęd A), ryfampicyny (rzęd B) oraz zsyntezowanego związku (rzęd C). Kolumna 11: kontrola żywotności (podłoże zawierające 2.5% DMSO + bakterie). Kolumna 12: kontrola sterylności (podłoże + związek). Kolor niebieski wskazuje na zahamowanie wzrostu bakterii, natomiast kolor różowy wskazuje na żywotność bakterii wynikającą z redukcji rezazuryny do rezorufiny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Reprezentatywna płytka 96-dołkowa dla obu testów, NRU (Vero, góra) i MTT (Vero, dół), przedstawiona jest na Rysunku 3B. Na płytce MTT widoczny jest wyraźny gradient barwy, zmieniający się od przezroczystego (brak żywych komórek) przy wysokich stężeniach związku do głębokiego fioletu (wysoka żywotność komórek) przy niskich stężeniach. Podobnie, płytka NRU wykazuje gradient od przezroczystego do głębokiego różu, co wskazuje na pobieranie barwnika neutral red do lizosomów żywych komórek.

Mikroskopia zapewnia wizualne potwierdzenie stanu testu po 48 h czasie inkubacji (Rycina 8). Rycina 8A porównuje zdrowe, niepoddane działaniu czynnika komórki kontrolne (Vero i HepG2) z komórkami traktowanymi cytotoksycznym stężeniem związku. Komórki traktowane wydają się zaokrąglone, oddzielone od podłoża i niezdolne do przeżycia. Rycina 8B stanowi kluczowy punkt kontroli wizualnej przed końcowym etapem solubilizacji. Przedstawia ona oczekiwane tworzenie się ciemnofioletowych kryształów formazanu wewnątrz żywych komórek (test MTT) oraz gromadzenie się czerwonego barwnika w lizosomach (test NRU) w obu typach komórek.

Surowe dane absorbancji znormalizowano względem kontroli nośnika i przeanalizowano za pomocą regresji nieliniowej w celu wygenerowania krzywych zależności dawka-odpowiedź, zgodnie ze szczegółami opisanymi w kroku 3.5 protokołu. Dla związku docelowego 6 (pochodnego LABIO-17) analiza ta wykazała wartość CC₅₀ wynoszącą 12,2 µM (Vero) i 18,3 µM (HepG2) w teście NRU oraz CC₅₀ >20 µM dla obu linii komórkowych w teście MTT. Przełożyło się to na indeks selektywności (SI) w zakresie od 30,5 do >50, co zostało zgłoszone we wcześniejszych doniesieniach¹⁰.

Rycina 8. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe z testów cytotoksyczności w komórkach Vero i HepG2. Wszystkie zdjęcia wykonano przy powiększeniu 100x. (A) Porównanie morfologii komórek po 48 h traktowania. Niepoddane działaniu kontrolne studzienki dla komórek Vero (góra) i HepG2 (dół) wykazują zdrową, konfluencyjną monowarstwę. W przeciwieństwie do nich, komórki traktowane cytotoksycznym stężeniem związku wydają się zaokrąglone, skurczone i oderwane od powierzchni płytki. (B) Krytyczne punkty kontrolne wizualne po dodaniu odczynników i przed solubilizacją. W teście MTT (lewe panele dla każdej linii komórkowej) żywe komórki zawierają widoczne ciemnofioletowe kryształy formazanu. W teście NRU (prawe panele dla każdej linii komórkowej) żywe komórki wykazują akumulację czerwonego barwnika w nienaruszonych lizosomach. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Podejście do badania fenotypowskiego, które opiera się na aktywności całej komórki, a nie izolowanych enzymów, jest skuteczną strategią identyfikacji aktywnych związków przeciwko M. tuberculosis. Tutaj opisano wstępne kroki tego podejścia, obejmujące syntezę chemiczną związku kandydackiego, ocenę jego aktywności hamującej poprzez oznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) oraz ocenę jego cytotoksyczności w komórkach ssaczy (Vero i HepG2) za pomocą testów MTT i NRU.

Ścieżka syntezy składała się z trzech głównych kroków (Rysunek 1), która zapewnia docelowy związek o wysokiej czystości przy użyciu operacyjnie prostych transformacji. Kilka kluczowych kroków zostało zidentyfikowanych jako determinant wpływających na reprodukcyjność i efektywność. Wstępna kondensacja wymaga precyzyjnej kontroli stechiometrycznej i utrzymanego refluksu, aby zapewnić pełne utworzenie pośrednich produktów. Niekompletne usunięcie rozpuszczalnika przed termiczną cyklizacją może negatywnie wpłynąć na efektywność zamknięcia pierścienia. Sam krok cyklizacji wymaga ścisłej kontroli temperatury, ponieważ niewystarczające ogrzewanie prowadzi do niekompletnej aromatyzacji, podczas gdy nadmierne lub przedłużone ogrzewanie może prowadzić do tworzenia produktów ubocznych. Podczas chlorowania zaleca się ostrożną kontrolę temperatury reakcji i stopniowe dodawanie chlorku fosforyla, aby zminimalizować reakcje uboczne i zapewnić selektywną aktywację w pozycji 4. Podczas optymalizacji metody, drobne korekty proceduralne poprawiły trwałość. W przypadkach niekompletnej precipitacji po cyklizacji, stopniowe chłodzenie zamiast szybkiego gaszenia poprawiło odzyskiwanie substancji stałych. Jeśli zaobserwowano obniżone plony w etapie substytucji nukleofilowej, przedłużenie czasu reakcji lub weryfikacja czystości aminy okazały się korzystne.

Główne ograniczenia metody to potrzeba cyklizacji w wysokiej temperaturze i skorodowanych środków chlorujących, takich jak chlorek fosforyla, wymagających specyficznej infrastruktury laboratorium i bezpieczeństwa. Efekty elektronowe substytuentów mogą wymagać ponownej optymalizacji dla różnych anilin lub amin, ograniczając szerokie zróżnicowanie szkieletu bez adaptacji. Jednak podejście Conrad-Limpach jest operacyjnie prostsze niż syntezy typu Skraup (surowe utleniacze) lub protokoły katalizowane metalami przejściowymi (specjalistyczne katalizatory/inertne atmosfery). Ta bezprzetworowa strategia wydajnie daje funkcjonalizowane pośrednie chinoliny dla chemii medycznej.

Protokół użyty do określenia MIC to test kolorymetryczny, który opiera się na wizualnej inspekcji. Potencjalnym wyzwaniem związanym z tą metodą jest niekompletna zmiana koloru, co skutkuje fioletowym puchem zamiast wyraźnego błękitu (hamowanie) lub różu (wzrost). Jeśli tak się stanie, należy to interpretować jako niepowodzenie w hamowaniu wzrostu prątków. Ponadto, ponieważ związek jest oceniany poprzez seryjne rozcieńczenia, maksymalne testowalne stężenie jest dyktowanie przez rozpuszczalność związku. W rezultacie, w niektórych przypadkach, wynik może być niejasny, jeśli nie zaobserwuje się żadnego hamowania w maksymalnym rozpuszczalnym stężeniu. Co więcej, ważne jest, aby uznać, że inne laboratoria mogą dostosowywać niektóre kroki protokołu do swoich szczególnych warunków, co może prowadzić do różnic w uzyskanych wynikach. Aby zwiększyć wydajność, ten protokół można przystosować do automatyzacji. Zastosowanie systemów do obsługi płynów do przygotowania płytek 96-dołkowych zmniejszyłoby błędy pipetowania, poprawiając dokładność i reprodukcyjność.

Protokół oceny cytotoksyczności wykorzystuje dwie różne linie komórek ssaczy (Vero i HepG2) oraz dwa uzupełniające się testy wydolności (MTT i NRU). Kilka kroków w obrębie tego protokołu jest kluczowych dla zapewnienia reprodukcyjności i dokładności danych, a każde laboratorium powinno przeprowadzić własną weryfikację. Na przykład, początkowa gęstość siewu komórek musi być starannie zoptymalizowana, ponieważ przepełnienie może prowadzić do hamowania kontaktowego i zmienionych stanów metabolicznych, co może zmieszać wyniki, podczas gdy niedostateczne zasiewanie może sprawić, że komórki będą bardziej podatne na drobne obrażenia, potencjalnie nadszacowując toksyczność¹⁵. Ponadto, najwyższe testowane stężenie jest często ograniczone przez rozpuszczalność związku, a precipitacja może prowadzić do niedokładnych wyników. Również, sugerowana układ płytki (Rysunek 3A) jest zaprojektowana do pierwotnego przesiewania, maksymalizując liczbę testowanych związków, rezygnując z powtórzeń technicznych i ignorując efekty krawędzi na rzecz weryfikacji poprzez niezależne powtórzenia biologiczne.

Kluczową zaletą tego protokołu jest równoległe zastosowanie zarówno testów MTT, jak i NRU. Podczas gdy oba są dobrze ugruntowane, mierzą one różne parametry komórkowe. Test MTT ocenia aktywność metaboliczną dehydrogenaz mitochondrialnych, która ogólnie koreluje z wydolnością komórek¹⁶. Jednakże, ten test jest podatny na interferencje ze strony związków o właściwościach redukujących lub utleniających lub tych, które zakłócają oddychanie mitochondrialne, prowadząc do potencjalnych fałszywych wyników

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LiniA KOMóREK
HepG2 (ludzki rak wątrobowokomórkowy)	ATCC	HB-8065	Linia komórek ludzkiego raka wątroby
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (nerkowa małpy zielonej afrykańskiej)	ATCC	CCL-81	Pierwotna linia komórek nabłonkowych nerki
CHEMIA – SYNTEZA
4-(Piperydyn-1-yl)anilina	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Prekursor aminy dla związku 5/6
4-Bromoanilina	Sigma-Aldrich	108-67-8	Materiał wyjściowy do syntezy chinoliny
Kwas octowy (lodowato-krzemienny)	Sigma-Aldrich	695092	Reagent w syntezie i przygotowaniu fazy ruchomej
Acetonitryl (stopień HPLC)	Sigma-Aldrich	34967	Składnik fazy ruchomej HPLC i rozpuszczalnik NMR
Clorofform	Sigma-Aldrich	C2432	Rozpuszczalnik do ekstrakcji produktu
DMSO-d6 (zdeuterowany)	Sigma-Aldrich	175641	Rozpuszczalnik NMR
Dowtherm A (ciecz przenosząca ciepło)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Wysokowrzący rozpuszczalnik do cyklizacji termicznej (230–250 °C); wcześniej wymieniany jako Dowtherm® A
Etanol (absolutny)	Sigma-Aldrich	459836	Rozpuszczalnik reakcji dla kroku Conrad–Limpach
Octan etylu (stopień HPLC)	Sigma-Aldrich	270989	Składnik eluentu kolumny
Acetooctan etylu	Sigma-Aldrich	E12806	β-ketoestrynowy reagent dla formowania pierścienia chinoliny
Kwas mrówkowy (stopień HPLC)	Sigma-Aldrich	F0507	0.1% dodatek w fazie ruchomej dla HPLC i HRMS
Szklane kulki (1 mm, sterylne)	Sigma-Aldrich	G8772	Do homogenizacji kultury M. tuberculosis
HCl (kwas solny, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Kwasowy katalizator w substytucji nukleofilowej
Heksan (stopień HPLC)	Sigma-Aldrich	34859	Niepolarny eluent do chromatografii kolumnowej
Izopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Rozpuszczalnik reakcji do syntezy związku 6
Siarczan magnezu (MgSO4, bezwodny)	Sigma-Aldrich	M7506	Środek suszący i katalizator reakcji
Metanol (stopień HPLC)	Sigma-Aldrich	34860	Faza ruchoma HPLC i składnik rozpuszczalnika NMR
Trójchlorek fosforu (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Reagent chlorujący dla pośredniego związku 4
Pirydyna	Sigma-Aldrich	270970	Bazowy katalizator w substytucji nukleofilowej
Żel krzemionkowy (35–70 siatki) do chromatografii błyskawicznej	Macherey-Nagel	815349	Faza stacjonarną do etapów chromatografii błyskawicznej
Żel krzemionkowy 60 Å (70–230 siatki) do chromatografii kolumnowej	Macherey-Nagel	815381	Faza stacjonarną do chromatografii kolumnowej
Siarczan sodu (Na2SO4, bezwodny)	Sigma-Aldrich	239313	Środek suszący do fazy organicznej
Płytki TLC z żelem krzemionkowym 60 F254	Merck	1.05554	Monitorowanie chromatografii warstwowej
Toluen	Sigma-Aldrich	244511	Rozpuszczalnik do etapie chlorowania
Ultraczysta woda	Millipore / odpowiednik	N/A	Używane w przygotowaniu fazy ruchomej; wcześniej odnoszono się do niej jako woda Milli-Q w tekście
SPRZĘT & INSTRUMENTY
Filtr strzykawki 0.22 μm	Millipore / każdy	SLGP033RS	Sterylizacja roztworu reazuryny (2.1.4); filtracja roztworu roboczego MTT (3.3); filtracja roztworu roboczego Czerwieni Neutralnej (3.4)
Filtr strzykawki 0.45 μm	Millipore / każdy	SLHA033SS	Filtracja roztworów fazy ruchomej
15 mL stożkowa tuba (sterylna)	Falcon / każdy	352097 lub odpowiednik	Zbieranie i wirowanie zawiesiny komórek po trypsynizacji
Płytka 96-dołkowa (płaska dno, traktowana tkankowo)	Corning / każdy	3596	Do testów cytotoksyczności i MIC
Okładzina aluminiowa	Każdy	—	Ochrona przed światłem płytek podczas inkubacji MTT i NRU oraz etapów wibracji
Autoklaw	Każdy	—	Sterylizacja medium (121 °C, 98.07 kPa, 10 min)
Szafa bezpieczeństwa biologicznego (Klasa II, certyfikowana)	Każdy (Certyfikowany BSL-3)	—	Wymagany dla manipulacji M. tuberculosis (BSL-3)
Licznik komórek (zautomatyzowany) lub hemocytometr	np. Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Do wyznaczania stężenia komórek i wiabiliności
Wirówka (zdolna do 200 × g)	Każdy	—	Etap pelletingu komórek
Inkubator CO2 (37 °C, 5% CO2