Artykuł metodologiczny

Ocena oparta na kulturze bez wykrywalnego wzrostu i profil antyoksydantów świeżego żelu z Aloe vera

88 wyświetleń

DOI:

10.3791/70702

16 czerwca 2026

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje aseptyczne przygotowanie świeżego ekstraktu z żelu wewnętrznego z Aloe vera, pomiar potencjometrycznego pH, ocenę całkowitego zdolności przeciwutlenniającej za pomocą zautomatyzowanego kolorymetrycznego testu opartego na ABTS, ocenę bez wykrywalnego wzrostu na podstawie hodowli w określonych warunkach inkubacji oraz wstępne badanie przeciwdrobnoustrojowe mieszanki testowej 70:30 (v/v) Aloe vera/N-acetylo-L-cysteiny metodą dyfuzji dyskowej i jakościowej dwukrotnej dylukcji w probówce.

Streszczenie

Aloe vera (Aloe barbadensis Miller) jest szeroko stosowany w produktach medycyny topikalnej i uzupełniającej. Jednak standaryzowane przepływy pracy laboratoryjne do jednoczesnej oceny całkowitego zdolności przeciwutleniającej (TAC), zachowania pH, kulturowego statusu bez wykrywalnego wzrostu w określonych warunkach i wstępnego przesiewowego badania przeciwdrobnoustrojowego są ograniczone. Świeży ekstrakt z żelu wewnętrznego Aloe vera został przygotowany aseptycznie i sformułowany w stężeniach 5%, 10%, 15% i 20% (w/v). pH zostało zmierzone potencjometrycznie, a TAC określono za pomocą zautomatyzowanego kolorymetrycznego testu opartego na radykałowym kationie ABTS. Ocena kulturowa bez wykrywalnego wzrostu została przeprowadzona poprzez inokulację ekstraktu na agar krwi, agar eosin-metyleno-niebieski i agar Sabouraud z dekstrozą, po czym nastąpiła inkubacja w warunkach tlenowych i wizualna inspekcja po 24 h, 48 h i 72 h. Przesiewowe badanie przeciwdrobnoustrojowe mieszaniny testowej z 70:30 (v/v) Aloe vera/N-acetylo-L-cysteiny zostało przeprowadzone na standardowych szczepach referencyjnych za pomocą testu dyskowego i jakościowych dwukrotnych rozcieńczeń w probówkach. TAC różnił się istotnie między grupami (Kruskal-Wallis, p = 0,014), przy czym najwyższe wartości obserwowano w 20% formulacji. Podczas 72-godzinnego okresu obserwacji nie zaobserwowano żadnego widocznego wzrostu bakterii ani grzybów w badanych warunkach hodowli. Mieszanka testowa Aloe vera/N-acetylo-L-cysteiny wytworzyła strefy inhibicji w zakresie od 11 mm do 17 mm, przy czym największa strefa została zaobserwowana wobec Pseudomonas aeruginosa. Ten przepływ pracy zapewnia praktyczne podejście laboratoryjne do przygotowywania i wstępnej charakteryzacji świeżych preparatów na bazie Aloe vera dla badań medycyny uzupełniającej na wczesnym etapie.

Wprowadzenie

Aloe vera nadal przyciąga znaczną uwagę naukową ze względu na długotrwałą obecność w medycynie tradycyjnej oraz rosnącą istotność w badaniach farmaceutycznych, biomedycznych, kosmetycznych i żywnościowych1,2,3. Ta roślina lecznicza zawiera różnorodne biologicznie czynne składniki, w tym polisacharydy, związki fenolowe, antrachinony, witaminy, minerały, enzymy oraz inne metabolity o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą przyczyniać się do jej właściwości terapeutycznych i funkcjonalnych1,2,3. Wśród tych składników, acemannan został podkreślony ze względu na jego potencjał jako biomateriału oraz doniesienia o rolach w naprawie tkanek, immunomodulacji i zastosowaniach regeneracyjnych4,5. Równolegle, związki fenolowe i inne aktywne przeciwutleniacze były kojarzone z działaniem przeciwwolnym, ochronnym i biologicznie wspierającym preparatów Aloe vera.2,3.

W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie włączaniem Aloe vera do zaawansowanych systemów formulacyjnych i materiałów bioaktywnych. Hydrożele na bazie Aloe vera, biomateriałowe atramenty, nanokompozyty i trójwymiarowe wydrukowane szkielety były badane w zastosowaniach uzdrawiania ran i wsparcia tkanek ze względu na ich wysoką pojemność hydratacji, biokompatybilność oraz wielofunkcyjne właściwości biologiczne4,6,8,9,10,11. Badania eksperymentalne wykazały, że materiały zawierające Aloe vera mogą wspierać zarządzanie ranami, przyczyniając się do wilgotnego środowiska, poprawiając właściwości fizykochemiczne preparatu i zapewniając wsparcie przeciwutleniające lub przeciwdrobnoustrojowe w wybranych warunkach in vitro, in vivo oraz zależnych od preparatu4,7,8,9,10,11. Ponadto, Aloe vera był eksplorowany w zastosowaniach do zachowania i formułowania żywności, gdzie powłoki żelowe i powiązane systemy były kojarzone z lepszą stabilnością oksydacyjną, lepszą jakością sensoryczną i zwiększoną wydajnością mikrobiologiczną12,13. Te rozwojowe trendy wskazują, że Aloe vera jest coraz bardziej uważany nie tylko za tradycyjny produkt ziołowy, ale także za wielofunkcyjny naturalny materiał o szerokim potencjale formulacyjnym2,3,12,13.

Biologiczna istotność Aloe vera rozciąga się również na zastosowania przeciwdrobnoustrojowe i mikrobiologiczne. Ostatnie badania opisują działanie hamujące Aloe vera lub preparatów zawierających Aloe vera na klinicznie ważne mikroorganizmy, w tym Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, gatunki Candida oraz kliniczne szczepy izolowane z infekcji ran14,15,16,17. Wcześniejsze dowody in vitro również wykazały aktywność wewnętrznego żelu Aloe vera przeciwko odniesieniowym szczepom Helicobacter pylori oraz klinicznym izolatom18. Co więcej, hybrydowe systemy zawierające Aloe vera były opisane jako wykazujące połączone działanie przeciwdrobnoustrojowe, przeciwutleniające i wspierające gojenie ran, co dalece wspiera wielofunkcyjną naturę tego pochodzącego z roślin materiału19. Jednakże, działanie biologiczne Aloe vera jest wpływane przez kilka zmiennych metodologicznych, w tym użyty ułamek rośliny, procedurę ekstrakcji, stężenie, warunki przechowywania, świeżość żelu oraz to, czy badany preparat zawiera tylko wewnętrzny żel czy też zawiera składniki związane z lateksem2,20. Czynniki te są szczególnie ważne, ponieważ wewnętrzny żel i zewnętrzne frakcje liści różnią się zarówno pod względem składu, jak i profilu toksykologicznego20.

Mimo rosnącej liczby publikacji, istnieją ważne luki metodologiczne. W wielu opublikowanych badaniach zachowanie przeciwutleniające, właściwości fizykochemiczne, ocena mikrobiologii oraz działanie przeciwdrobnoustrojowe są często oceniane oddzielnie, zamiast w ramach jednolitego zintegrowanego procesu. Dla badań skoncentrowanych na formułowaniu, te parametry są ściśle powiązane. Preparat może wykazywać korzystne działanie przeciwutleniające, ale nadal wy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie wyciągu z aloesu prawdziwego i serii rozcieńczeń

  1. Zbierz dojrzałe liście rośliny aloesu prawdziwego rosnącej w temperaturze pokojowej i dokładnie spłucz je pod bieżącą wodą, aby usunąć wszelkie resztek.
  2. W szafie bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 (BSL-2) zdezynfekuj powierzchnię liścia 70% etanolem używając sterylnych rękawic. Po nałożeniu 70% etanolu pozostaw powierzchnię liścia do całkowitego osuszenia na powietrzu przez co najmniej 2 min przed aseptycznym nacięciem.
  3. Używając sterylnego skalpela, usuń końcową część i krawędzie liścia, pozwól żółtej wydzielinie lateksowej spłynąć całkowicie przez około 30 min, a następnie odpłaszcz liść wzdłużnie. Ostrożnie oddziel i zbierz tylko przezroczysty wewnętrzny żel, unikając zewnętrznej skórki i pozostałej warstwy lateksowej.
  4. Ostrożnie przenieś wewnętrzny żel Aloe vera do sterylnego pojemnika i homogenizuj poprzez przerywane wirowanie przez około 5-10 min na około 2500 obr./min (lub równoważnym ustawieniu średnio-wysokim wirowania); wykonaj procedurę w temperaturze pokojowej, chyba że kontrola temperatury jest wymagana dla konkretnego urządzenia.
  5. W warunkach aseptycznych przygotuj świeże preparaty wyciągu z wewnętrznego żelu Aloe vera. w stężeniach 5%, 10%, 15% i 20% (w/v) używając sterylnej wody destylowanej; na przykład, przygotuj 5% (w/v) jako 5 g żelu doprowadzonego do ostatecznego objętości 100 mL i dostosuj pozostałe stężenia analogicznie.

2. Pomiar pH

  1. Przeprowadź kalibrację trójpunktową miernika pH używając standardowych buforów pH 4,01, 7,00 i 10,01 z NIST przed każdą serią pomiarów.
  2. Zmierzyć pH dla każdego stężenia w temperaturze pokojowej (20–25 °C); zarejestruj co najmniej trzy powtórki techniczne na każde stężenie.

3. Pomiar całkowitego stężenia przeciutleniacza (TAC)

  1. Wykorzystaj preparaty wyciągu z Aloe vera. przygotowane w kroku 1 (5%, 10%, 15% i 20%) do pomiaru TAC.
  2. Przed analizą doprowadź wszystkie reagenty i próbki do temperatury pokojowej (20–25 °C) w celu zapewnienia spójności analitycznej.
  3. Zkalibruj zautomatyzowany analizator biochemiczny (Rel Assay, Turcja) zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi standardowych procedur roboczych przed rozpoczęciem pomiaru.
  4. Zainstaluj reagenty do całkowitego stężenia przeciutleniacza (TAC) zgodnie z metodą Erela do odpowiednich komór reagentów analizatora.
  5. Przenieś próbki wyciągu z Aloe vera. do odpowiednich kubków próbek lub komór reakcji za pomocą skalibrowanych mikropipet. (Objętość próbki: 5 μL)
  6. Rozpocznij pomiar TAC zgodnie z zaprogramowanym protokołem analizatora dla metody opartej na kationie radykałowym ABTS, stosując się do zaleceń producenta dotyczących objętości reagentów i ustawień inkubacji.
  7. Pozwól reakcji przebiegać automatycznie, podczas której przeciutleniacze obecne w próbce redukują kolorowy kation radykałowy ABTS, co powoduje zmniejszenie absorpcji.
  8. Zmierzyć zmianę absorpcji spektrofotometrycznie na określonej długości fali określonej przez metodę TAC. (Długość fali: 660 nm)
  9. Oblicz wartości całkowitego stężenia przeciutleniacza używając oprogramowania analizatora poprzez porównanie zmian absorpcji próbek do krzywej kalibracyjnej odpowiadającej Troloxowi.
  10. Wyrazić wyniki TAC jako mmol odpowiednika Troloxu / L na jednostkę objętości ekstraktu.
  11. Wykonaj wszystkie pomiary w dwóch powtórzeniach w celu zapewnienia niezawodności analitycznej.

4. Ocena kulturalna braku wykrywalnego wzrostu wewnętrznego żelu Aloe vera.

  1. Zaszczep 10 μL każdego ekstraktu na agar krwisty, agar eosin-metylenobułkowy i agar z dekstrozą Sabourauda używając skalibrowanej pętliczki (10 μL) (metoda liczenia kolonii).
  2. Do oceny kulturalnej braku wykrywalnego wzrostu aseptycznie zalej skalibrowaną mikropipetą standaryzowaną aliquotę 50 μL na agar krwisty, agar eosin-metylenobułkowy i agar z dekstrozą Sabourauda i delikatnie rozprowadź ją za pomocą sterylnej jednorazowej pętliczki (10 μL) (Ocena rozmnażania kulturalnego metodą bezpośredniego kroplowania).
  3. Inkubauj agar krwisty i agar eosin-metylenobułkowy w warunkach aerobowych w 37 °C, a agar z dekstrozą Sabourauda w warunkach aerobowych w 25-28 °C, a następnie wizualnie sprawdź płytki pod kątem wzrostu po 24, 48 i 72 godzinach. Równolegle inkubauj jedną niezaszczepioną płytkę z każdego podłoża jako kontrolę ujemną.

5. Ocena

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wartości pH ekstraktu Aloe Vera w różnych stężeniach

Profil pH wykazywał niemonotoniczny wzorzec w różnych stężeniach. Średnie wartości pH wynosiły 6,47, 6,60, 6,26 i 6,28 dla 5%, 10%, 15% i 20% preparatów, odpowiednio. Ogólne różnice między grupami były istotne statystycznie (p = 0,024). Preparaty 5% i 10% wykazywały stosunkowo wyższe wartości pH, podczas gdy preparaty 15% i 20% grupowały się na niższych wartościach pH (p < 0,05) (Tabela 1 i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badania przedstawiają zintegrowany proces laboratoryjny wstępnego charakteryzowania świeżych formuł dodatków z żelu wewnętrznego z aloesu, łączący pomiar pH, analizę całkowitego działania przeciwutleniającego (TAC), ocenę wzrostu bakterii i grzybów oraz opisową analizę działania przeciwdrobnoustrojowego. Wzrastające stężenia świeżego żelu wewnętrznego z aloesu były związane z wyższymi wartościami TAC, podczas gdy w krótkoterminowym monitorowaniu wzrostu nie obserwowano żadnego widocznego wzrostu bakterii i grzy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów i niezgłaszają żadnego zewnętrznego finansowania.

Podziękowania

Autorzy dziękują personelowi laboratorium za wsparcie techniczne podczas hodowli mikrobiologicznej i analiz biochemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 (-)80 C Deep FreezerThermofisher/USAPrzechowywanie próbekTSX40086A
VortexThermofisher/USAPrzygotowanie próbek88882010
Blood AgarRTA/TurkeyInokulacja kultur2001
Eosine Methilene Blue AgarRTA/TurkeyInokulacja kultur2010
SDA AgarRTA/TurkeyInokulacja kultur2036
Müller Hinton Agar RTA/TurkeyInokulacja kultur2022
Müller Hinton Broth RTA/TurkeyRozcieńczanie kultur1018
PipettesThermofisher/USAPrzygotowanie próbek4642090N
Hanna pH MetersHitachi/JAPANAnaliza próbekHI2211-02
Rel Assay Plate ReaderRel Assay(Turkey)Analiza TAC próbekM201 (Smart Model)
 TAC KitsRel Assay(Turkey)ZestawRL0017

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiew antymikrobialnyagar krwitest ABTSdyfuzja dyskiemrozcie czenia w prob wkachca kowita zdolno przeciwutleniaj capomiar pH

Powiązane artykuły