Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muzynna heterotopowa transplantacja serca jest kluczowymi modelem przedklinicznym w badaniach nad transplantacją. Szyjna heterotopowa transplantacja serca u myszy oferuje wyraźne zalety, w tym bezpośrednie wizualne i wyczuwalne monitorowanie żywotności przeszczepu, zmniejszone uszkodzenie chirurgiczne i szybszy okres pooperacyjnej rekonwalescencji. Stała się zatem coraz bardziej wartościową platformą do badań nad immunologią przeszczepów, szczególnie cenną dla zwierząt o słabych warunkach fizjologicznych z powodu modyfikacji genetycznych lub indukcji lekowym, oraz dla eksperymentów wymagających wtórnej lub skomplikowanej transplantacji narządów, region szyjny często staje się jedynym możliwym do przyjęcia miejscem. Konwencjonalne techniki transplantacji szyjnej, czy to z wykorzystaniem szycia końca w końcu czy metod opartych na mankiecie, wymagają trwałego związania wspólnej tętnicy szyjnej i żyły szyjnej zewnętrznej biorcy, co może kompromitację perfuzję mózgu i wprowadzić obce materiały lub zaburzenia hemodynamiczne. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, niniejszy artykuł szczegółowo opisuje wyrafinowaną technikę szyjnej transplantacji serca z wykorzystaniem końcowo-bocznej anastomozy naczyniowej. Metoda ta zachowuje wspólną tętnicę szyjną i żyłę szyjną zewnętrzną biorcy, utrzymując normalną perfuzję mózgu i unikając komplikacji związanych z trwałym związaniem naczyń. Ten protokół szczegółowo opisuje kroki od pozyskania serca dawcy do anastomozy biorcy i opieki pooperacyjnej. Wyniki reprezentatywne wykazują wysoki wskaźnik sukcesu chirurgicznego (96,7%) i skuteczność modelu w badaniu odrzucenia przeszczepu allogenicznego. Ta technika oferuje fizjologicznie istotny i technicznie dostępny model dla badaczy w dziedzinie immunologii przeszczepów.
Wprowadzenie
Przez ostatnie pół wieku immunologii transplantacyjnej nadal koncentruje się na działaniach immunologów i specjalistów od przeszczepów. Obecnie przeszczepianie narządów stałych jest szeroko stosowane i stanowi najskuteczniejsze leczenie chorób końcowego stadium narządów. Jednak odrzucenie przeszczepu nie zostało zasadniczo rozwiązane i nadal stanowi jedno z głównych przeszkód w przeszczepianiu i jest jedną z głównych przyczyn utraty przeszczepu1. W związku z tym, pokonanie lub złagodzenie odrzucenia przy jednoczesnym zmniejszaniu lub uniknięciu ogólnoustrojowego immunosupresyjnego leczenia pozostaje znaczącym wyzwaniem i kluczowym celem badań w tej dziedzinie.
Modele transplantacji zwierzęcych narządów, szczególnie modele mysie, odegrały kluczową rolę w rozwoju immunologii przeszczepów i dostarczyły istotnej naukowej podstawy dla translacji klinicznej2. Na przykład wiele środków immunosupresyjnych stosowanych klinicznie dzisiaj – takich jak cyklosporyna, takrolimus i rapamycyna – zostało po raz pierwszy z powodzeniem zweryfikowanych w mysich modelach przeszczepów3,4.
Mysi model przeszczepu heterotopowego serca (HT) jest jednym z najczęściej stosowanych modeli przedklinicznych, ceniony ze względu na dostępność różnych szczepów genetycznych i reagentów badawczych, a także ze względu na stosunkowo prostą procedurę i łatwe monitorowanie pooperacyjne. Jako taki służy jako kluczowa platforma do badania mechanizmów ostrego odrzucenia, indukowania tolerancji immunologicznej i oceny nowych leków immunosupresyjnych in vivo5,6.
Pierwszy mysi heterotopowy model HT został ustanowiony przez Corry i wsp.7 w 1973 roku. W tym modelu, dawcze serce jest umieszczane w jamie brzusznej odbiorcy, przy czym aorta przeszczepu i tętnica płucna (PA) są zszywane końca w bok do brzusznej aorty odbiorcy i dolnej żyły głównej (IVC) odbiorcy odpowiednio. Ta metoda pozostawała standardową techniką HT brzusznego przez dekady. Napędzana potrzebą zaakceptowania allogennych przeszczepów trzeciej strony w badaniach tolerancji, zbadano drugie miejsce dla HT. Doprowadziło to do opracowania modeli HT szyjnych u myszy, które oferują inne zalety takie jak bezpośrednia ocena wiarygodności przeszczepu, mniejszy uraz chirurgiczny i niższe ryzyko zakażeń pooperacyjnych5,8,9. W 1991 roku Chen i wsp.8 jako pierwsi opisali szyjny heterotopowy model HT u myszy, polegający na końca w bok ręcznej szyciu aorta dawcy i PA do wspólnej tętnicy szyjnej (CCA) odbiorcy i zewnętrznej żyły szyjnej (EJV) odbiorcy odpowiednio. Jednakże ten model nie zyskał szerokiego przyjęcia ze względu na znaczny wyzwanie techniczne stanowione przez poważne niedopasowane aorta dawcy i CCA odbiorcy, co uczyniło połączenie naczyń niezwykle trudnym.
Również w 1991 roku Matsuura i wsp.9 wprowadzili technikę mankietu bez szycia dla połączeń naczyniowych w modelu HT szyjnym. Ta metoda upraszcza procedurę poprzez wyeliminowanie technicznie wymagającego ręcznego szycia naczyniowego, ułatwiając opanowanie. Następnie zgłoszono liczne udoskonalenia techniczne techniki mankietowej10,11. Obecnie metoda mankietowa jest szeroko stosowana w HT szyjnym, szczególnie przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia w mikroszyciu naczyniowym. Jednakże technika mankietowa wprowadza sztuczne materiały, które mogą wywoływać miejscowe zapalenie i zakłócać oceny immunologiczne, a także stanowić wyzwanie techniczne w mało kalibrowych naczyniach5,6. Niedawny propozycja Liao i wsp.12 techniki bezmankietowej w HT szyjnym, w której naczynia dawcy i odbiorcy są bezpośrednio zszywane metodą rękawa. Poprzez unikanie sztucznych materiałów i akomodacje małych naczyń, podejście to oferuje fizjologiczną i powtarzalną platformę dla wtórnego przeszczepu serca.
Niezależnie od tego, zarówno technika szycia końca w końcu, jak i technika mankietowa wymagają trwałego ściśnięcia jednostronnej CCA i EJV odbiorcy. Powoduje to kompromitację jednostronnego dopływu krwi do otoczenia centralnego układu nerwowego, co może prowadzić do powikłań neurologicznych, takich jak zaburzenia kierunku i hemiplegia13,14,15. Co więcej, te podejścia końca w końcu mogą prowadzić do zmienionej hemodynamiki, takiej jak wysokoprężne strugi tętnicze i niosą wyższe ryzyko zakrzepicy i zwężenia, które są szkodliwe dla długotrwałego przeżycia przeszczepu. Co więcej, technika mankietowa ma również wrodzone ryzyko zakrzepicy z powodu obecności mankietu.
Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, przyjęliśmy udoskonaloną technikę ręcznego
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad zwierzętami przeprowadzana była zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone w Instytucie Transplantacji Narządów, Szpitalu Tongji, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Chiny. Zgoda etyczna na badanie została uzyskana od Komitetu Etyki dla Zwierząt Szpitala Tongji (Numer zgody: TJH-202310010). Właściwe instrumenty użyte w badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Wykonaj sterylizację sali operacyjnej za pomocą lampy ultrafioletowej przez 30 min. Dezynfekuj stół operacyjny 70% alkoholem etylowym i poddaj wszystkie instrumenty chirurgiczne autoklawacji (121 °C przez 20 min).
- Wykorzystaj dorosłe samce myszy C57BL/6 i BALB/c (o wadze 20–25 g; 8–10 tygodni życia). W przypadku przeszczepów syngennych, użyj myszy C57BL/6 zarówno jako donorów, jak i odbiorców. W przypadku przeszczepów allogennych, użyj myszy BALB/c jako donorów i myszy C57BL/6 jako odbiorców.
- Podaj odbiorcy myszce przedoperacyjną analgezję poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg) 1 godzinę przed operacją.
UWAGA: Przedoperacyjnej analgezji nie przeprowadza się na myszce-donorze, ponieważ donora eutanazuje się natychmiast po pobraniu serca. - Przygotuj roztwór znieczulający zawierający ketaminę (20 mg/mL) i ksylazynę (2 mg/mL). Znieczulić myszkę poprzez wstrzyknięcie do jamy brzusznej w ilości 5 μL/g masy ciała myszy, co odpowiada 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Po indukcji znieczulenia nałóż na oba oczy maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, obserwując powolne i regularne oddychanie, utrata odruchu prawidłowego ułożenia i brak odruchu stępującego.
- Ogolić futro z klatki piersiowej i brzucha. Umieść myszkę w pozycji leżącej na plecach na podgrzewanym podkładzie, aby utrzymać temperaturę ciała. Dezynfekować miejsce operacji, przemiennie stosując powiden jodu i 70% alkohol etylowy przez trzy cykle. Przedłużyć szyję odbiorcy, odsuwając górny siekacz w górę za pomocą jedwabnego sznurka 6‑0, aby zoptymalizować ekspozycję.
- Zobacz sterylne rękawiczki chirurgiczne. Wykonaj owalne otwory nieco większe niż miejsce nacięcia na sterylnym prześcieradle. Następnie użyj go do zakrycia myszki-odbiorcy.
2. Pobór serca od donora
- Wykonaj środkową nacięcie brzucha, a następnie poprzeczne (krzyżowe) nacięcie, aby w pełni ujawnić jamę otrzewną.
- Delikatnie odstąpić jelito cienkie w lewo za pomocą sterylnego wacika mokrego w fizjologicznym roztworze soli, aby ujawnić aortę brzuszną i żyłę główną dolną.
- Wstrzyknąć 0,3 mL heparinizowanej fizjologicznej wody soli (300 IU/mL) do żyły głównej dolnej i poczekać 1 min na systemową heparynizację. Przeciąć aortę brzuszną i żyłę główną dolną, aby wykrwawić donora.
- Wykonaj nacięcie przepony wraz z przednią ścianą klatki piersiowej, aby uzyskać U-kształtne nacięcie przez żebra za pomocą nożyczek, aby ujawnić jamę klatki piersiowej.
- Wstrzyknąć 2 mL zimnego roztworu fizjologicznego (4 °C) do serca przez wewnątrzklatkowe żyły główne dolne, aby spłukać resztki krwi.
UWAGA: Głównym celem tego kroku jest wywołanie hipotermii i sprawić, aby serce przestało bić szybko. Drugim celem jest dokładne spłukanie krwi z serca, szczególnie z tętnic wieńcowych. - Pokryć serce kawałkiem sterylnej gazy nasączonej zimnym roztworem fizjologicznym (4 °C). Delikatne sianie w dół na tej gazie ułatwia optymalne ujawnięcie aorty i tętnic płucnych. Ponadto gaz nasączony zimnym roztworem fizjologicznym służy do utrzymania hipotermii przeszczepu podczas dalszej dysekcji.
- Zidentyfikować i odizolować żyłę główną dolną wewnątrzklatkowego. Ligaturować ją za pomocą jedwabnej nitki 6-0 i przeciąć poniżej miejsca ligowania za pomocą mikro nożyczek.
- Zidentyfikować i usunąć grasicę, aby ujawnić łuk aorty i tętnicę płucną. Zidentyfikować i odizolować górną żyłę główną. Ligaturować ją za pomocą jedwabnej nitki 6-0. Przeciąć poniżej miejsca ligowania.
- Zidentyfikować i odizolować aortę wstępującą. Przeciąć aortę powyżej tętnicy nieparzystej, aby zmaksymalizować długość naczynia.
- Zidentyfikować i odizolować tętnicę płucną. Przeciąć ją tuż powyżej jej rozgałęzienia. Ligaturować wszystkie naczynia z tyłu serca (żyły płucne) za pomocą nitki jedwabnej 6-0. Ostrożnie wyciąć serce za pomocą mikro nożyczek.
- Delikatnie przenieść serce i zanurzyć je w zimnym roztworze fizjologic
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przy użyciu tego zmodyfikowanego modelu przeprowadzono trzydzieści przypadków; wskaźnik sukcesu operacji wyniósł 96,7% (29/30). Odnotowano tylko jeden przypadek zgonu z powodu krwotoku śródoperacyjnego. Pozostałe 29 przypadków włączono do analizy czasu trwania operacji oraz wyników przeszczepów. U żadnego z biorców po operacji nie zaobserwowano powikłań związanych z niedokrwieniem mózgu. Pobranie serca od dawcy trwało 6,4 ± 0,7 min, a operacja biorcy 28,7 ± 1,2 min. W szczególności przygotowanie naczyń, anastomozę tętnic...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Model HT szyjny z wykorzystaniem techniki połączenia końcowo-bocznego oferuje kilka zalet. W porównaniu z szyciem końców do siebie lub metodą mankietową, to podejście całkowicie zachowuje ciągłość tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) i żyły szyjnej zewnętrznej (EJV), tym samym utrzymując normalną hemodynamiki mózgowej i skutecznie unikając komplikacji związanych z niedokrwieniem mózgu. Połączenie końcowo-boczne również unika trudności technicznych spowodowanych niedopasowaniu średnic naczyń dawcy i biorcy. W porównaniu z HT br...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
Podziękowania
To dzieło zostało wspierane przez Narodową Fundację Nauki Przyrodniczej Chin (81700571).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1mL Syring | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309628 | |
| 11-0 sutures with needles | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | H1101 | Do łączenia naczyń krwionośnych |
| 3mL Syring | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309657 | |
| 5-0 sutures with needles | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | CR537 | Do zamknięcia skóry |
| 6-0 silk suture | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 2650182 | |
| Blood Stop Cautery | Ningbo Shunye Medical Co., Ltd. | BDD-YE-DT-1 | |
| Buprenorphine | Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd | H12020275 | Środek przeciwbólowy |
| Bawełniane tampony | Fuqing Health & Integral Medical | 20230R | |
| Wygięte mikro kleszcze | RWD life Science Co. | F11031-11 | Narzędzie chirurgiczne |
| Wygięte mikro nożyczki | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54108B | Narzędzie chirurgiczne |
| Tampony gazowe | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 | |
| Iniekcja heparyny sodowej | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| Mikro uchwyt do igieł | World Precision Instruments Co., Ltd. | 555408NT | Narzędzie chirurgiczne |
| Mikro zacisk naczyniowy | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5481T | |
| Aplikator mikro zaciskacza naczyniowego | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5480 | |
| Uchwyt do igieł | RWD life Science Co. | F31025-13 | Zamknięcie jamy brzusznej |
| Sola | Zhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd | 716092103 | |
| Proste mikro kleszcze | RWD life Science Co. | F11029-11 | Narzędzie chirurgiczne |
| Mikroskop chirurgiczny | Leica | M650 | |
| Platforma chirurgiczna | Na zamówienie, magnetyczna | ||
| Pęsety do tkanki | RWD life Science Co. | F12002-12 | Narzędzie chirurgiczne |
| Nożyczki do tkanki | RWD life Science Co. | S12003-09 | Narzędzie chirurgiczne |
Bibliografia
- Slepicka, P. F., Yazdanifar, M., Bertaina, A. Harnessing mechanisms of immune tolerance to improve outcomes in solid organ transplantation: a review. Front Immunol. , (2021).
- Cravedi, P., et al. Advancing mouse models for transplantation research. Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg. , (2024).
- McDaid, J., et al. The utility of animal models in developing immunosuppressive agents. Eur J Pharmacol. , (2015).
- Guo, Y., et al. Efficacy of single-agent immunosuppressive regimens in a murine model of vascularized composite allotransplantation. Transpl Int Off J Eur Soc Organ Transplant. , (2020).
- Alegre, M. L., et al. Best practices of heart transplantation in mice. Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg. , (2025).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. , (2013).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. , (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. , (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. , (1991).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular gland-preserving technique for heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. , (2018).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Custom-made clamp facilitating stabilization of cuffs in murine heterotopic cervical heart transplantation. Transplantation. , (2019).
- Liao, M., Liu, K., Riella, L. V., Borges, T. J. Cuff-free suture-based cervical model for secondary heterotopic heart transplantation to evaluate donor-specific immune tolerance in mice. J Vis Exp JoVE. , (2026).
- Comi, A. M., et al. Impact of age and strain on ischemic brain injury and seizures after carotid ligation in immature mice. Int J Dev Neurosci. , (2009).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. J Vis Exp Jove. , (2015).
- Struys, T., et al. In vivo evidence for long-term vascular remodeling resulting from chronic cerebral hypoperfusion in mice. J Cereb Blood Flow Metab Off J Int Soc Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Dun, H., et al. Cervical heterotopic heart transplantation in mice using a novel suture technique. JHLT Open. , (2025).
- Li, W., et al. Mouse heterotopic cervical cardiac transplantation utilizing vascular cuffs. J Vis Exp. , (2022).
- Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast Reconstr Surg. , (2014).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2005).
- Gu, X., et al. Improved cuff technique for cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2007).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
- Li, Y., et al. A highly reproducible cervical cuff technique for rat-to-mouse heterotopic heart xenotransplantation. Xenotransplantation. , (2017).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant Off J Middle East Soc Organ Transplant. , (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
