Pięcio-smakowita Sophora flavescens Kapsułki o powłoce ochronnej łagodzą doświadczalne zapalenie jelita grubego i zmiany związane z ferroptozą

Podsumowanie

W modelu mysiej choroby Crohna, pięcioaromatyczne Sophora flavescens kapsułki o powłoce enterorozpuszczalnej łagodziły uszkodzenia jelita grubego i poprawiały stres oksydacyjny, nierównowagę cytokin zapalnych, sygnalizację JAK2/STAT3 oraz zmiany w markerach związanych z ferroptozą.

Streszczenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego nadal jest trudne do opanowania, ponieważ skuteczne i ukierunkowane opcje terapeutyczne są ograniczone, a stres oksydacyjny, sygnalizacja zapalna i regulowane szlaki śmierci komórkowej mogą przyczyniać się do uszkodzenia błony śluzowej. Badanie to oceniło, czy pięcioaromatykowe Sophora flavescens kapsułki enterozolujące (FSEC) łagodzą doświadczalne zapalenie jelita grubego i zbadano związane z tym zmiany w stresie oksydacyjnym, stanie zapalnym i markerach ferroptozy. Ustanowiono model myszy z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego poprzez cykliczne narażenie na 2,5% siarczan dekstrany sodowej, w połączeniu z wyzwaniem czynnikiem nekrozującym guzów alfa. Myszy były leczone niską, średnią lub wysoką dawką FSEC lub antagonistą TLR4 CRX-526 jako pozytywne interwencje kontrolne. Histopatologia jelita grubego była ocenianą za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną. Stężenie nadtlenoczynnika dysmutazy, katalazy, glutationu, mieloperoksydazy i Fe²⁺ poziomów we krwi osoczu mierzono za pomocą metod biochemicznych. Cytokiny tkanki jelita grubego były ilościowo określane metodą ELISA, ekspresję JAK2 i STAT3 oceniono immunohistochemicznie, a ekspresję GPX4, FTH1 i ACSL4 analizowano za pomocą western blottingu. Leczenie FSEC zmniejszyło uszkodzenie błony śluzowej jelita grubego i infiltrację komórek zapalnych, zwiększyło wskaźniki przeciwutleniaczy i zmniejszyło poziomy mieloperoksydazy. FSEC również obniżył poziom TNF-α i IL-1β, częściowo przywrócił poziom IL-13 i był związany ze słabszym barwieniem immunologicznym JAK2 i STAT3. Równolegle FSEC poprawił zmiany związane z markerami ferroptozy, w tym zmniejszone poziomy Fe²⁺ i ACSL4 oraz zwiększone wyrażenie GPX4 i FTH1. Te wyniki sugerują, że FSEC łagodzi doświadczalne wrzodziejące zapalenie jelita grubego u myszy, przynajmniej częściowo poprzez poprawę stanu stresu oksydacyjnego, łagodzenie sygnalizacji zapalnej i przywracanie profili markerów związanych z ferroptozą.

Wprowadzenie

Zespół wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC) jest przewlekłym stanem zapalnym, który głównie dotyka śluzówkę jelita grubego i odbytnicy i charakteryzuje się nawracającymi epizodami stanu zapalnego śluzówki, owrzodzeń i upośledzonej funkcji bariery^1,2,3. Mimo że wskazano na genetyczną podatność, czynniki środowiskowe, dysfunkcję bariery nabłonkowej i dysregulację odporności w patogenezie UC, mechanizmy leżące u podstaw przewlekłych uszkodzeń śluzówki pozostają niedostatecznie poznane. Obecne leki farmakologiczne, w tym aminosalicylany, kortykosteroidy, immunosupresanty i środki biologiczne, mogą zmniejszać aktywność choroby u wielu pacjentów; jednak ich kliniczne zastosowanie może być ograniczone przez nawrót po przerwaniu leczenia, działania niepożądane, wysoki koszt i niepełne reakcje terapeutyczne³.

Ferroptoza, żelazozależna forma regulowanej śmierci komórkowej charakteryzująca się peroksydacja lipidów i zaburzonym metabolizmem żelaza, coraz częściej jest wskazywana jako czynnik zapalenia jelit i uszkodzenia nabłonka związanego z UC^4,5,6,7,8. Równolegle, tradycyjne chińske formuły lecznicze przyciągają coraz większą uwagę jako uzupełniające podejścia w leczeniu UC ze względu na ich wielotargetowe potencjały terapeutyczne⁹.

Pięciokorzeniowe kapsułki o powłoce enterosorbentowej Sophora flavescens (FSEC) są stosowane klinicznie w leczeniu łagodnego do umiarkowanego aktywnego UC w praktyce tradycyjnej medycyny chińskiej. Poprzednie badania sugerują, że FSEC może poprawiać objawy UC poprzez wieloskładnikowe i wielotargetowe mechanizmy¹⁰. Jednakże, wpływ FSEC na stres oksydacyjny, sygnał zapalny, aktywność JAK2/STAT3 i zmiany związane z ferroptozą w eksperymentalnym UC pozostają niedostatecznie scharakteryzowane.

Stres oksydacyjny i sygnał zapalny są ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do uszkodzeń śluzówki jelitowej w UC. Nadmierne wytwarzanie czynników reaktywnego tlenu może zakłócić integralność nabłonka, promować infiltrację komórek zapalnych i upośledzać systemy ochrony przeciwutleniającej. Ścieżki pośredniczące cytokinami, takie jak sygnał JAK2/STAT3, przyczyniają się do wzmocnienia stanu zapalnego i uszkodzeń tkanek^{11,12,13,14,15}. Ponadto, stres oksydacyjny i ferroptoza są ściśle powiązane poprzez zmiany w obronie przeciwutleniającej, metabolizmie żelaza i peroksydacji lipidów^{16,17,18,19,20}. Dlatego równoczesna ocena wskaźników stresu oksydacyjnego, cytokin zapalnych, sygnału JAK2/STAT3 i markerów związanych z ferroptozą może dostarczyć bardziej kompleksowego zrozumienia uszkodzeń śluzówki i reakcji terapeutycznych w eksperymentalnym UC.

W niniejszym badaniu wykorzystano model myszy z cyklicznym siarczanem dekstranów sodowych i wyzwaniem czynnikiem nekrozującym nowotwory alfa w celu oceny wpływu niskiej, średniej i wysokiej dawki FSEC. Kluczowa moc metodologiczna tego projektu to integracja oceny histopatologicznej z pomiarami wskaźników stresu oksydacyjnego w surowicy, cytokin w tkance jelita grubego, immunohistologii JAK2/STAT3 i analizy Western blot związanych z białkami związanymi z ferroptozą w ramach jednej eksperymentalnej ramy. Podejście to zostało wykorzystane, aby określić, czy FSEC łagodzi eksperymentalne UC i scharakteryzować związane z tym zmiany w stresie oksydacyjnym, sygnalizacji zapalnej i profilach markerów związanych z ferroptozą. Ogólny projekt eksperymentalny i przepływ analityczny są skupione w Rysunek 1.

Rysunek 1: Eksperymentalny przepływ pracy modelu mysiego i dalszej analizy. Przewlekły eksperymentalny zespół wrzodziejącego zapalenia jelita grubego został wywołany cyklicznym narażeniem na 2,5% siarczan dekstranów sodowych (DSS) w połączeniu z wyzwaniem czynnikiem nekrozującym nowotwory alfa (TNF-α) w ostatnim tygodniu eksperymentu. Myszy zostały przypisane do grupy kontrolnej, modelowej, niskiej dawki FSEC, średniej dawki FSEC, wysokiej dawki FSEC i dodatkowej grupy kontrolnej CRX-526. FSEC był podawany przez sondę do żołądka w dawkach 108, 216 lub 432 mg/kg masy ciała. CRX-526 zostało użyte jako interwencja dodatkowa kontrolna. Po ostatnim leczeniu, próbki zostały pobrane do oceny histopat

Protokół

Wszystkie procedury zwierzęce zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami i Etykę Nanchang Medical College (numer zatwierdzenia NY2SC 20250407). Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Substancje chemiczne, odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zwierzęta i leczenie

W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J (typ dziki, 8 tygodni). Zwierzęta były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych, w kontrolowanej temperaturze i wilgotności, z wolnym dostępem do żywności i wody. Po aklimatyzacji przewlekłe zapalenie jelita grubego zostało wywołane przez podawanie trzech cykli 2,5% siarczanu dekstrany sodowej (DSS) w wodzie pitnej. Każdy cykl trwał 1 tydzień i był rozdzielany 2-tygodniowym okresem wyleczenia z regularną wodą pitną. W ostatnim tygodniu protokołu eksperymentalnego myszy w grupach modelowych i leczniczych otrzymywały alfa czynnik nekrozujący nowotworu (TNF-α; 10 µg/100 g masy ciała, dwa razy dziennie) przez sondę żołądkową, aby dodatkowo zaostrzyć uszkodzenie jelita grubego. Myszy kontrolne otrzymywały tylko pojazd i nie były narażone na DSS lub TNF-α.

Pięcioaromatyka Sophora flavescens w kapsułkach o powłoce nieprzepuszczalnej dla żołądka (FSEC) była używana jako dostępny komercyjnie, zatwierdzony chiński patent leku. Formuła zawierała Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f. i Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. Zawartość kapsułek z tej samej partii produkcyjnej była wazona i zawieszana w sterylnej wodzie destylowanej, aby przygotować świeże zawiesiny do podawania. Zawiesiny były dokładnie mieszane przed każdą sondą, aby zapewnić jednorodne rozproszenie. Źródło produktu, numer zatwierdzenia, specyfikacje farmaceutyczne i informacje o kontroli jakości są podane w Tabeli Materiałów. Jakość produktu została opisana zgodnie z zatwierdzoną specyfikacją farmaceutyczną i informacjami dostarczonymi przez producenta, w tym specyfikacje kapsułek, wygląd, wymagania dotyczące uwalniania z powłoki i rozpadu, ograniczenia mikrobiologiczne i standardy kontroli jakości.

Myszy leczonym FSEC podawano niskie dawkowanie FSEC (108 mg/kg masy ciała), średnie dawkowanie FSEC (216 mg/kg masy ciała) lub wysokie dawkowanie FSEC (432 mg/kg masy ciała) przez sondę żołądkową dwa razy dziennie w ostatnim tygodniu modelowania. Poziomy dawek zostały wybrane na podstawie zatwierdzonej dawki klinicznej, konwersji powierzchni ciała i wstępnych rozważań dotyczących zakresu dawkowania. Myszy leczone pojazdem otrzymywały taką samą objętość sterylnej wody destylowanej przez sondę żołądkową.

Grupa kontrolna dodatnia otrzymała antagonistę TLR4 CRX-526 w dawce 1 mg/kg przez iniekcję do żyły ogonowej w ostatnim tygodniu modelowania. CRX-526 został użyty jako referencyjne działanie przeciwzapalne. Badanie obejmowało sześć grup (n = 6 na grupę): normalną kontrolną, modelową, niskodawkowaną FSEC, średniodawkowaną FSEC, wysokodawkowaną FSEC oraz dodatnią kontrolną CRX-526. Myszy zostały uśmiercone 24 godziny po ostatnim leczeniu badaniowym. Eutanazję wykonano przez wybicie szyi pod znieczuleniem izofluranem, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi.

2. Ocena histologiczna przez barwienie hematoksyliną i eozyną

Tkanki jelita grubego zostały pobrane z makroskopowo najbardziej dotkniętego obszaru między odbytem a okolicą okrężniczo-kątniczą. Dla każdej myszy jeden reprezentatywny segment jelita grubego z tego obszaru został utrwalony w 10% neutralnym buforowanym formalinie, osadzony w parafinie, przekrojony i zabarwiony hematoksyliną i eozyną. Dla oceny histologicznej przygotowano co najmniej trzy przekroje od każdego zwierzęcia i zbadano pięć nienakładających się wysokich pól widzenia na przekroju. Pola zostały wybrane systematycznie losowo poprzez zeskanowanie przekroju od jednego brzegu do drugiego, unikając obszarów rozdartego, złożonego lub słabo zabarwionego. Zmiany histopatologiczne, w tym owrzodzenie błony śluzowej, niszczenie gruczołów, przekrwienie i infiltracja komórek zapalnych, zostały oceniane pod mikroskopem świetlnym.

3. Pomiar wskaźników biochemicznych związanych ze stresem oksydacyjnym

Probki krwi (0,5 mL) zostały pobrano do probówek zawierających antykoagulant i wyśrodkowano w przybliżeniu 1160 × g przez 10 min w 4 °C. Przezroczysty nadstan został pobrany i użyty do zmierzenia poziomu żelaza w surowicy, nadtlenku dysmutazy (SOD), glutationu (GSH), katalazy (CAT) i mieloperoksydazy (MPO) za pomocą odpowiednich zestawów do badań wymienionych w Tabeli Materiałów zgodnie z instrukcjami producentów.

4. Immunohistochemijna analiza JAK2 i STAT3</

Wyniki

FSEC łagodzi uszkodzenia histopatologiczne i poprawia wskaźniki związane ze stresem oksydacyjnym u myszy z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego
Jak pokazano na Rysunku 2, grupa kontrolna normalna wykazywała integralną architekturę błony śluzowej jelita grubego, z dobrze zorganizowanymi gruczołami i minimalnym naciekiem komórek zapalnych. Natomiast grupa modelowa wykazywała ciężkie uszkodzenia błony śluzowej charakteryzujące się uszkodzeniem nabłonka, owrzodzeniami b...

Dyskusja

To badanie zbadano wpływ pięcioaspektowych kapsułek z powłoką przetrwalnikową z Sophora flavescens (FSEC) na mysim modelu eksperymentalnego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC) i oceniono związane z tym zmiany w wskaźnikach związanych ze stresem oksydacyjnym, cytokinach zapalnych, sygnalizacji JAK2/STAT3 oraz markerach związanych z ferroptozą. Główne wyniki to: leczenie FSEC łagodziło histopatologiczne uszkodzenia jelita grubego, poprawiało biochemiczne wskaźniki związane z antyoksydantami, obniżało pozi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Chromogen substrate for HRP-based immunohistochemistry.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Mouse monoclonal primary antibody for western blot; used at 1:500; RRID: AB_10842002.
Antigen retrieval solution, citrate buffer, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	Heat-induced epitope retrieval buffer for paraffin-section immunohistochemistry.
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0012	Protein quantification before western blotting.
C57BL/6J mice	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Male SPF mice, 8 weeks old; animal source consistent with the submitted ethics approval materials.
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Colorimetric kit for serum CAT activity measurement.
ChemiDoc XRS+ imaging system	Bio-Rad Laboratories	1708265	Chemiluminescence imaging system for western blot detection.
CRX-526	TargetMol	T27090	TLR4 antagonist used as the positive-control intervention; CAS no. 245515-64-4.
Dextran sulfate sodium salt (DSS), colitis grade	MP Biomedicals	160110	DSS, colitis grade, molecular weight 36,000–50,000 Da; used at 2.5% in drinking water.
ECL chemiluminescent substrate	Bio-Rad Laboratories	1705061	Clarity Western ECL substrate for HRP-based western blot signal detection.
ELISA kit, mouse IL-13	Abcam	ab219634	Colorimetric sandwich ELISA kit for mouse IL-13 quantification; 450 nm readout.
ELISA kit, mouse IL-1α	Abcam	ab199076	Colorimetric sandwich ELISA kit for mouse IL-1α quantification; 450 nm readout.
ELISA kit, mouse TNF-α	Abcam	ab208348	Colorimetric sandwich ELISA kit for mouse TNF-α quantification; 450 nm readout.
Ethanol, absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Used for tissue processing, dehydration, and reagent preparation.
Ferrous iron (Fe2+) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Colorimetric kit for Fe2+ measurement in serum or tissue samples.
Five-flavor Sophora flavescens enteric-coated capsules	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA approval no. Z20150002	Chinese patent medicine; 0.4 g/capsule; formulation includes Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., and Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; pharmaceutical specification YBZ00152015
Glutathione (GSH) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Reduced glutathione assay kit for serum GSH measurement.
GPX4 antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Mouse monoclonal primary antibody for western blot; used at 1:500; RRID: not listed in the supplier datasheet.
Hematoxylin and eosin staining kit	Solarbio	G1120	H&E staining of paraffin-embedded colon tissue sections.
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Secondary antibody for western blot; used at 1:50,000; RRID: AB_631736.
ImageJ software	National Institutes of Health	Version 1.54	Image-analysis and densitometry software used for western blot band quantification.
Immunohistochemistry detection kit	ZSGB-BIO	PV-9000	Polymer-based HRP detection kit for paraffin-section immunohistochemistry.
JAK2 antibody (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Rabbit monoclonal primary antibody for JAK2 immunohistochemistry on paraffin sections; RRID: AB_2128522.
Microplate reader	BioTek Instruments	Synergy H1	Plate reader for ELISA absorbance measurement at 450 nm.
Myeloperoxidase (MPO) activity assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Colorimetric kit for serum MPO activity measurement.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Fixation of colon tissue before paraffin embedding.
Normal goat serum	Solarbio	SL038	Blocking reagent for immunohistochemistry.
Paraffin	Leica Biosystems	39601006	Embedding medium for colon tissue processing.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio	P1020	Buffer for tissue homogenization, washing, and immunostaining procedures.
PVDF membrane	MilliporeSigma	IPVH00010	Protein-transfer membrane for western blotting.
Recombinant mouse TNF-α protein	R&D Systems	410-MT	Recombinant mouse TNF-α used for the final-week inflammatory challenge.
SDS-PAGE and transfer system	Bio-Rad Laboratories	1658004	Mini-PROTEAN Tetra system for SDS-PAGE and western blot transfer workflow.
SPSS Statistics software	IBM	Version 24.0	Statistical analysis software for one-way ANOVA and Bonferroni post-hoc testing.
STAT3 antibody (124H6)	Cell Signaling Technology	9139	Mouse monoclonal primary antibody for STAT3 immunohistochemistry; RRID: AB_331757.
Superoxide dismutase (SOD) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	WST-1 method kit for serum SOD activity measurement.
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418	Dewaxing reagent for paraffin-section processing.
β-actin antibody (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Mouse monoclonal loading-control antibody for western blot; used at 1:1,000; RRID: AB_626632.