$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Jako trójwymiarowe (3D) modele in vitro, struktury przypominające organoidy wysepek trzustkowych stały się kluczowymi narzędziami w badaniach nad cukrzycą i medycynie regeneracyjnej, dzięki zdolności do wiernego naśladowania wielokomórkowego składu i struktury przestrzennej rodzimych wysepek trzustkowych1. Takie modele nie tylko stanowią unikalną platformę do zrozumienia biologii rozwoju wysepek i patologicznych mechanizmów cukrzycy 2,3, ale także wspierają rozwój terapii zastępowania komórek i systemów przesiewowych leków4. W obliczu rosnącej globalnej częstości cukrzycy — zwłaszcza absolutnego niedoboru insuliny spowodowanego nieodwracalnym uszkodzeniem β komórek w cukrzycy typu 1 — konwencjonalna terapia zastępcza insuliną może kontrolować objawy, ale nie jest w stanie wyleczyć choroby. Tymczasem przesadzanie wysepek boryka się z poważnym niedoborem dawców, co sprawia, że rozwój skalowalnych alternatywnych źródeł wysepek jest pilnym priorytetem 1,5. Wykorzystując skierowany potencjał różnicowania pluripotentnych komórek macierzystych lub dorosłych komórek macierzystych, technologia przypominająca organoidy wysepek trzustkowych może pomóc złagodzić to ograniczenie 6,7,8.
W ostatnich latach poczyniono znaczące postępy w systemach hodowli wysepek trzustkowych, przypominających organoidy oparty na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) oraz indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych (iPSCs)9. Wiele badań potwierdziło, że poprzez optymalizację protokołów indukcyjnych i warunków hodowli, komórki macierzyste mogą różnicować się w komórki przypominające wyspy o funkcjach wydzielania insuliny reagującymi na glukozę10. Przełomy w technologii chemicznego przeprogramowania umożliwiły generowanie hiPSC bez manipulacji genetycznej, poprawiając potencjał translacyjny11. W kontekście systemów hodowlanych, hodowla 3D w połączeniu ze specyficznymi kombinacjami macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników wzrostu może sprzyjać samoorganizacji komórek prekursorowych wysepek w struktury organoidalne złożone z komórek α, β i δ12. Jednak istniejące technologie nadal stoją przed licznymi wyzwaniami, w tym niestabilną efektywnością różnicowania, niewystarczającą dojrzałością funkcjonalną oraz brakiem sieci naczyniowych i immunologicznego mikrośrodowiska — kluczowymi czynnikami ograniczającymi13 ograniczające szersze zastosowanie.
Pomimo postępów w badaniach nad strukturą organoidów wysepek trzustkowych, kilka kluczowych kwestii naukowych w tej dziedzinie pozostaje do rozwiązania14. Po pierwsze, brak ustandaryzowanych definicji organoidów i procedur konstrukcyjnych utrudnia bezpośrednie porównywanie wyników między różnymi laboratoriami15. Po drugie, obecne systemy hodowli nie są w pełni w stanie odtworzyć złożonego składu komórkowego i precyzyjnego układu przestrzennego rodzimych wysepek trzustkowych16. Po trzecie, kluczowe kwestie, takie jak stabilność funkcjonalna podczas długotrwałej hodowli organoidów oraz przeżywalność po przeszczepie, pozostają niewystarczająco scharakteryzowane17. Ponadto większość istniejących protokołów nadal opiera się na materiałach matrycowych pochodzenia zwierzęcego, które cierpią na nieokreślony skład i duże różnice między partiami, co utrudnia kontrolę jakości w zastosowaniach klinicznych18. Te luki w wiedzy i technice poważnie utrudniają przenoszenie struktur przypominających organoidy wysepek trzustkowych z badań podstawowych do praktyki klinicznej.
Protokół ten został zaprojektowany, aby zbudować stabilne, przystępne cenowo i powtarzalne podejście do generowania konstrukcji przypominających organoidy wysepek trzustkowych, wykorzystując mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC). Ustalona metoda jest przeznaczona do badań laboratoryjnych oraz zastosowań przedklinicznych w zakresie badań leków. Obecne strategie różnicowania wysepek wysyp wywołanych przez BMSC napotykają wiele ograniczeń, w tym nadmierne koszty, niespójne standardy operacyjne oraz ograniczoną zastosowalność. Większość istniejących systemów indukcyjnych opiera się na kosztownych cytokinach rekombinowanych, profesjonalnych macierzach hodowli oraz urządzeniach do hodowli wysoko precyzyjnych, co znacznie ogranicza ich szerokie zastosowanie. Aby rozwiązać te wady, obecny protokół przyjmuje lizat tkanki trzustkowej wieprzowinki jako czynnik indukcji rdzenia. Ta zoptymalizowana i uproszczona strategia hodowli pozwala na efektywne zróżnicowanie BMSC na struktury przypominające wysepki, przy użyciu jedynie rutynowego sprzętu laboratoryjnego i warunków.
W porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na hESC, iPSC lub koktajlach o wysokich kosztach wzrostu, obecna strategia oferuje kilka wyraźnych praktycznych zalet. Eliminuje to potrzebę stosowania kosztownych odczynników i skomplikowanych układów hodowli, zmniejsza koszty eksperymentów oraz umożliwia spójne wyniki przy minimalnej zmienności między partiami 10,11,12,13. W przeciwieństwie do systemów opartych na ksenogenicznych matrycach, protokół ten wykorzystuje uproszczony lizat tkankowy, poprawiając kontrolowalność i powtarzalność eksperymentów w laboratoriach15, 16, 17, 18. Ponadto BMSC są łatwo dostępne, stabilne w hodowli i wolne od etycznych ograniczeń związanych z pluripotentnymi komórkami macierzystymi, co czyni to podejście szczególnie odpowiednim do rutynowego użytku laboratoryjnego.
Istniejące podejścia badawcze są spolaryzowane w dziedzinie modelowania organoidów trzustki: zaawansowane platformy organoidów do transformacji klinicznej są kosztowne i technicznie złożone, podczas gdy uproszczone alternatywne modele nie wspierają dogłębnej analizy funkcjonalnej. Protokół zaproponowany w tej pracy niweluje tę lukę badawczą, oferując ustandaryzowany, średniozaawansowany schemat techniczny. Takie podejście zachowuje podstawowe właściwości fizjologiczne wysepek trzustkowych i jest w pełni kompatybilne z konwencjonalnymi warunkami laboratoryjnymi podstawowymi. Służy jako praktyczne narzędzie dla badaczy koncentrujących się na mechanizmach rozwoju wysepek, modelowaniu chorób cukrzycowych oraz wstępnej ocenie kandydatów na leki, szczególnie dla zespołów wyposażonych w rutynową infrastrukturę hodowli komórek, ale brakujących profesjonalnych platform do hodowli komórek macierzystych. Chociaż metoda ta nie jest w stanie generować w pełni ukrwionych lub immunologicznie kompetentnych organoidów do konkretnych zaawansowanych badań, jest doskonale przystosowana do wstępnych badań eksperymentalnych, eksploracji mechanistycznych oraz szkolenia akademickiego w badaniach biologicznych wysepek.
Prace te koncentrują się na stworzeniu ekonomicznego i ustandaryzowanego systemu hodowli struktur przypominających organoidy wysepek trzustkowych, dążąc do zaoferowania wiarygodnego trójwymiarowego modelu badawczego do badań związanych z cukrzycą. Systematycznie analizując, jak różnorodne schematy indukcji i środowiska hodowlane wpływają na efektywność formowania organoidów oraz cechy morfologiczne, badania te próbują przełamać główne przeszkody techniczne ograniczające postęp w tej dziedzinie. Główne cele badawcze obejmują trzy kluczowe aspekty: ustanowienie uniwersalnego protokołu hodowli stosowalnego do zwykłych laboratoriów podstawowych bez zaawansowanych instrumentów, opracowanie ilościowych standardów oceny jakości organoidów oraz optymalizację strategii hodowli w celu utrzymania stabilności morfologicznej i funkcjonalnej organoidów podczas długotrwałej inkubacji. Wyniki tego badania mogą stanowić solidne wsparcie techniczne dla eksperymentów in vitro, jednocześnie budując praktyczny i wiarygodny model badań nad mechanizmami rozwoju wysepek oraz badaniami leków hipoglikemicznych.