Standaryzowany protokół metabolomiki do analizy zmian metabolicznych wywołanych wysiłkiem u elitarnych bokserów za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas

Summary

Protokół ten opisuje standaryzowany workflow metabolomiki surowicy oparty na chromatografii cieczowej sprzężonej z quadrupolową spektrometrią mas typu time-of-flight (LC-QTOF-MS/MS) oraz analizą danych wielowymiarowych do profilowania ostrych i krótkotrwałych zmian metabolicznych związanych z rekonwalescencją u elitarnych bokserów mężczyzn.

Abstract

Elitarny boks wywołuje szybkie zmiany metaboliczne, które nie są w pełni uchwycone przez konwencjonalne pomiary fizjologiczne. Do próbek pobranych przed sparingiem, bezpośrednio po sparingu oraz 24 godziny po sparingu oraz 24 godziny po sparingu i 24 godziny po sparingu zastosowano metodę chromatografii cieczowej – kwadrupolową dwukrotną spektrometrię mas (LC-QTOF-MS/MS). Workflow obejmował standaryzowane pobieranie próbek, wspólne monitorowanie jakości, profilowanie metabolitów, wielowymiarową analizę statystyczną oraz interpretację szlaków. Ostre sparingi wiązały się ze zmianami metabolitów związanych z glikolizą i glukoneogenezą, podczas gdy 24-godzinny punkt czasu był związany z metabolizmem siarki.

Fosfatydylinozytol PI (16:0/18:2(9Z,12Z)) wykazał silną dyskryminację w stanie bezpośrednim po sparingu, a tiosiarczan był powiązany ze stanem 24-godzinnym odzyskiwania. Wyniki te wspierają wykorzystanie tego przepływu pracy do powtarzalnego profilowania zmian metabolicznych związanych z ćwiczeniami w tej grupie siedmiu elitarnych bokserów męskich. Protokół jest przeznaczony do kontrolowanych badań małych kohort dotyczących ostrej aktywności fizycznej i krótkotrwałej regeneracji, kładąc nacisk na powtarzalną obsługę prób, wspólne monitorowanie kontroli jakości oraz interpretowalną analizę dalszą.

Introduction

Elitarny boks, charakteryzujący się trzema rundami po 2 minuty intensywnych sparingów, opiera się na połączeniu metabolizmu beztlenowego i tlenowego oraz wywołuje szybkie zmiany substratów energii, mediatorów stresu oksydacyjnego oraz metabolitów związanych z naprawą tkanek. Tradycyjne oceny (mleczan krwi i tętno) rejestrują jedynie pojedyncze punkty fizjologiczne, nie rozwiązując systemowych, powiązanych zmian metabolicznych, które obejmują "punkt wyjścia przed sparingiem, → ostry stres po sparingu → 24-godzinną regenerację."

Nieukierunkowana metabolomika, umożliwiona dzięki chromatografii cieczowej – kwadrupolowej spektrometrii mas czasowo-lotowej, rozwiązuje to ograniczenie poprzez kompleksowe profilowanie metabolitów małych cząsteczek w próbkach biologicznych. Zazwyczaj wykrywa tysiące szczytów metabolicznych i adnotuje setki do tysięcy metabolitów poprzez integrację z wyselekcjonowanymi bazami^{danych 1,2,3}. Takie podejście może ujawnić subtelne dynamiki metaboliczne, których tradycyjne metody pomijają, ale istniejące badania metabolomiczne skoncentrowane na boksie nie mają standaryzacji: często pomijają kontrolowane protokoły sparingowe, rygorystyczne kroki kontroli jakości (QC) lub długoterminowe punkty regeneracji, co prowadzi do niepowtarzalnych wyników i ograniczonego przełożenia na strategie treningowe lub regeneracyjne ^4,5.

Przedstawiono standaryzowany workflow metabolomiczny oparty na chromatografii cieczowej – kwadrupolowej spektrometrii mas z czasem lotu, zoptymalizowany dla elitarnych bokserów, aby uchwycić zarówno ostre reakcje wysiłkowe, jak i opóźnioną regenerację. Protokół obejmuje trzy kluczowe punkty czasowe (przed sparingiem [T0], bezpośrednio po sparingu [T1], 24 godziny po sparingu [T2]), aby odróżnić przejściowe naprężenie od trwałej adaptacji ^6,7,8. Kluczowe cechy techniczne obejmują: (1) kontrolowane sparingi (maksymalne tętno 80–85%) zapewniające stałą intensywność wysiłku ^7,9; (2) wysokorozdzielczości LC-QTOF do czułego wykrywania metabolitów surowicy o niskiej ilości, ^2,3,10; (3) analizy wielowymiarowe i jednowymiarowe, w tym analizę głównych składników (PCA), ortogonalną analizę rozróżniających metodą nieregularnych najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) oraz parowe testy statystyczne, w celu identyfikacji metabolitów reagujących na ćwiczenia ^6,8,11; oraz (4) pojedynczą próbkę QC w surowicy (mieszanie próbek badawczych o równej objętości) z wieloma iniekcjami w celu oceny stabilności instrumentu wobec dryfu sygnału¹².

Protokół ten może być dostosowany do innych sportów o wysokiej intensywności i krótkim czasie trwania (np. sprinty i zapasy), ale taka przenośność wymaga weryfikacji w kohorcie specyficznej dla konkretnej dyscypliny. W niniejszym badaniu workflow przedstawia wstępne ramy do identyfikacji markerów metabolicznych stresu i regeneracji u elitarnych bokserów męskich. Ten sposób działania jest najbardziej odpowiedni dla kontrolowanych badań ostrych ćwiczeń i krótkotrwałej regeneracji w małych, dobrze scharakteryzowanych kohortach sportowych z wykorzystaniem surowiczne, nieukierunkowanej metabolomiki. Może być mniej odpowiedni do bezpośredniej ekstrapolacji na inne sporty, sportsmenki, większe zróżnicowane populacje lub długoterminowe badania adaptacyjne bez dodatkowej weryfikacji.

Celem badania było scharakteryzowanie zmian metabolicznych w surowicy wywołanych przez elitarne sparingi bokserskie oraz odróżnienie ostrych reakcji po sparingu od zmian związanych z 24-godzinnym powrotem do zdrowia. Hipoteza zakładała, że ostre sparingi będą miały przeważający wpływ na metabolizm energii, podczas gdy 24-godzinna regeneracja będzie powiązana z metabolitami powiązanymi z równowagą redoks i naprawą tkanek. Ogólny przepływ pracy przedstawiono na Rysunku 1.

Protocol

Wykonywanie wszystkich procedur zgodnie z zatwierdzeniem Instytucjonalnego Komitetu Etyki ds. Badań nad Ludźmi Uniwersytetu Wychowania Fizycznego i Sportu w Stolicy (nr 2025A005).

UWAGA: Traktuj wszystkie próbki ludzkiej krwi jako potencjalnie zakaźne. Noś rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu. Wykonuj pobieranie krwi żylnej, przetwarzanie surowicy i utylizację odpadów zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bioasekuracji. Zdekontaminuj powierzchnie robocze po obsłudze próbki.

UWAGA: Metanol, acetonitryl i kwas mrówkowy to niebezpieczne substancje chemiczne. Zajmij się przygotowaniem, ekstrakcją i rekonstrukcją rozpuszczalnika w certyfikowanym chemicznym okapie oparowym. Unikaj kontaktu ze skórą i wdychania. Zbieraj odpady rozpuszczalne w zatwierdzonych pojemnikach.

1. Rekrutacja i przygotowanie uczestników badania

1. Rekrutuj siedmiu elitarnych bokserów w wieku 20–28 lat, którzy rywalizują w kategoriach wagowych 60–75 kg.
2. Potwierdź, że każdy uczestnik ma co najmniej 5 lat doświadczenia zawodowego i nie ma historii chorób metabolicznych.
3. Wykluczać uczestników z urazem układu mięśniowo-szkieletowego w ciągu ostatnich 6 miesięcy.
4. Należy polecić uczestnikom stosowanie standaryzowanej diety zawierającej 55% węglowodanów, 25% białka i 20% tłuszczu przez 3 dni przed testem.
5. Instruuj uczestników, aby unikali intensywnych ćwiczeń na poziomie lub powyżej 60% maksymalnego tętna przez 48 godzin przed testem.
6. Uczcie poczyli pościć przez 12 godzin przed pobraniem krwi. Pozwól na spożycie wody podczas okresu postu.
7. Określ maksymalne tętno na podstawie ocenianych testów ćwiczeń na tydzień przed sparingiem.
8. Zwiększ prędkość bieżni o 1 km/h co 3 minuty, aż do wykończenia. Użyj zmierzonego maksymalnego tętna, aby określić intensywność celu sparingu.

2. Protokół sparingu i pobieranie próbek surowicy

1. Przygotuj standardowy ring bokserski o długości 6 × 6 m, rękawice o pojemności 16 oz oraz monitor tętna z pasem na klatkę piersiową.
2. Przeprowadz standardową 10-minutową rozgrzewkę, składającą się z 5 minut biegu z prędkością 8 km/h, 3 minut dynamicznego rozciągania i 2 minut shadowboxingu.
3. Wykonaj protokół sparingu w następujący sposób.
   1. Przeprowadz trzy rundy sparingów po 2 minuty każda.
   2. Dopasowuj przeciwników według kategorii wagowej i poziomu technicznego.
   3. Daj sobie 1-minutową przerwę między rundami.
   4. Monitoruj tętno co 30 sekund podczas sesji.
   5. Dostosuj intensywność sparingu, aby utrzymać tętno na poziomie 80%–85% tętna.
   6. Przerw sparing, jeśli tętno przekracza 90% tętna. Wznowiaj sparing dopiero po powrocie tętna do docelowego zakresu.
4. Zbieraj próbki surowicy w trzech punktach czasowych zgodnie z następującymi krokami.
   1. Pobierz 5 mL krwi żylnej z żyły przedkubitalnej 30 minut po rozgrzewce T0, używając jednej probówki do separacji surowicy o pojemności 8 mL (SST).
   2. Pobierz 5 ml krwi żylnej w ciągu 5 minut po ostatniej serii T1, używając nowego SST.
   3. Pobierz 5 ml krwi żylnej o tej samej porze dnia co T0 dla T2, używając nowego SST. Upewnij się, że uczestnicy stosują te same ograniczenia dotyczące postu i aktywności co w przypadku T0.
5. Przetwarzaj próbki krwi w następujący sposób.
   1. Każdą SST wiruj w 11000 × g przez 15 minut w 4 °C, w ciągu 1 godziny po pobraniu.
   2. Przenieś 2–3 mL górnej warstwy surowicy do 1,5 mL kriovialów.
   3. Krioviale natychmiast przechowuj w temperaturze -80 °C.
   4. Ogranicz każdą próbkę do maksymalnie dwóch cykli zamrożenia i rozmrażania.
6. Przygotuj próbkę kontroli jakości w grupie.
   1. Wszystkie 21 próbek surowicy z badania (T0, T1 i T2 od siedmiu uczestników) rozmrozić na lodzie przed wspólnym przygotowaniem kontroli jakości.
   2. Przelej równą ilość aliquotu z każdej próbki do jednej probówki o pojemności 1,5 mL.
   3. Przelej 20 μL z każdej próbki, aby uzyskać ostateczną objętość QC w grupie 420 μL.
   4. Vortex z połączonej próbki kontroli jakości przez 10 sekund.
   5. Wykorzystaj zgromadzoną próbkę QC do powtarzających się wstrzyknięć podczas analizy LC-QTOF-MS, aby monitorować stabilność instrumentów i dryf sygnału.

3. Ekstrakcja metabolitów z próbek surowicy

1. Usuwaj mrożone próbki surowicy (T0, T1, T2 i QC) z temperatury -80 °C. Rozmrażaj próbki na lodzie przez 30 minut i wiruj każdą próbkę przez 10 sekund.
2. Pipeta 100 μL surowicy do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL o niskiej zawartości białek. Dodaj 500 μL rozpuszczalnika do ekstrakcji lodowatej zawierającej metanol:acetonitryl (1:1, v/v). Vortex przez 30 sekund.
   1. Nie dodawaj wewnętrznego standardu podczas ekstrakcji lekcji. Nie stosuj korekty ekstrakcji opartej na wewnętrznym standardzie ani normalizacji w końcowym procesie.
3. Sonikuj rurkę w kąpieli lodowodowodziej w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 300 W i 40 kHz. Inkubuj probówkę w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę, aby wytrącić białko.
4. Wiruj rurkę w 13200 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przelej około 450 μL supernatantu do nowej rurki mikrowirówki i wyrzuć granulki jako niebezpieczny odpad biologiczny.
5. Susz supernatant w koncentratorze próżniowym w temperaturze 37 °C i -0,09 MPa przez 45 minut lub aż do osiągnięcia całkowitej suchości.
6. Rekonstytuować wysuszony ekstrakt w 100 μL acetonitrylu:wody (1:1, v/v). Vortex przez 30 sekund.
   Uwaga: Acetonitryl:woda (1:1, v/v) została użyta, ponieważ była kompatybilna z kolumną chromatografii odwróconej fazy stosowaną w tym procesie i nie powodowała widocznych wytrąceń w testach wstępnych.
7. Roztwór zrekonstytuowany w wirówce w dawce 13200 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przelej około 90 μL supernatantu do szklanej fiolki LC-MS wyposażonej w wkładkę 200 μL i zamknij fiolkę.

4. Detekcja chromatografii cieczowej za pomocą spektrometrii mas

1. Zamontuj kolumnę chromatografii odwróconej fazy odpowiednią do metabolomiki surowicy (patrz Tabela materiałów) w systemie chromatografii cieczowej. Ustaw piekarnik kolumnowy na 40 °C.
2. Przygotuj fazę mobilną A jako 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w wodzie ultraczystej. Przygotuj fazę komórkową B jako 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitrylu.
3. Przefiltruj obie fazy komórkowe przez membranę o pojemności 0,22 μm.
4. Ustaw przepływ na 400 μL/min i objętość wtrysku na 5 μL.
5. Zastosuj następujący gradient: 0,0–0,5 min, 95% A i 5% B; 0,5–5,5 min, gradient liniowy do 50% A i 50% B; 5,5–9,0 min, liniowy gradient do 5% A i 95% B; 9,0–10,5 min, 5% A i 95% B; 10,5–12,0 min, powrót do 95% A i 5% B i ponowne wyrównanie
6. Połącz system chromatografii cieczowej z wysokorozdzielczym spektrometrem mas wyposażonym w źródło jonizacji elektrosprayowej.
7. Zbieraj dane w modach jonów dodatnich i ujemnych w oddzielnych przebiegach.
8. W trybie jonów dodatniej ustaw napięcie kapilarne na 2500 V, a napięcie stożka na 30 V.
9. W trybie ujemnym jonów ustaw napięcie kapilarne na -2000 V, a napięcie stożkowe na 25 V.
10. Ustaw temperaturę gazu rozpuszczalnego na 500 °C, przepływ gazu rozpuszczalnego na 800 L/h, a przepływ gazu stożkowego na 50 L/h.
11. Pobieranie danych powyżej m/z 50–1200 z czasem skanowania 0,2 s.
12. Zbieranie danych z tandemowej spektrometrii mas, używając niskiej energii kolizji przy 0 V i wysokiej energii zderzenia przy 10–40 V.
13. Uruchom próbki w następującej kolejności: Jedno ślepe wstrzyknięcie rozpuszczalnika rekonstytucji; Trzy kolejne iniekcje z zebranej próbki QC; Wszystkie próbki badania miały po jednym ślepym zastrzyku i jednym zastrzyku kontroli jakości po pięciu próbkach; Ostatni zastrzyk kontroli jakości; oraz Ostatnie wstrzyknięcie ślepej naboju
14. Ocena jakości danych i stabilności analitycznej w obu trybach jonów poprzez analizę korelacji QC w grupie oraz klasteryzację głównych komponentów (PCA).
15. Interpretuj współczynniki korelacji korelacji QC w grupie większych niż 0,8 jako wskazujące na akceptowalną stabilność analityczną w całej sekwencji analitycznej.

5. Wstępne przetwarzanie danych i analiza statystyczna

1. Importuj pliki chromatometrii masowej z surowej cieczy do oprogramowania do przetwarzania danych w celu wyrównania czasu retencji, dekonwolucji, wyrównania szczytów oraz ekstrakcji cech (patrz Tabela materiałów).
   1. Wybierz pierwszą wstrzyknięcie QC w grupie jako odniesienie do wyrównania.
   2. Wykonaj wyrównanie czasu retencyjnego, dekonwolucję i szczytowe wyrównanie, korzystając z domyślnego workflow wybranego oprogramowania. Stosuj tolerancję czasu zatrzymania ± 0,1 min oraz tolerancję masy ± 5 ppm.
   3. Wykonaj pikowe wybicie i zachowaj cechy o intensywności powyżej 1000 liczb, które występują w co najmniej 80% próbek w co najmniej jednej grupie.
   4. Nie stosuj dodatkowej normalizacji po preprzetwarzaniu w żadnym z trybów jonowych.
   5. Eksportuj przetworzoną tabelę cech zawierającą m/z, czas retencji oraz wartości szczytowych obszarów.
   6. Transformacja log2 zachowywała wszystkie intensywności szczytowe.
   7. Przypisuj brakujące wartości z jedną piątą minimalnej wartości dodatniej dla każdej cechy.
   8. Każdą cechę wyśrodkowaj i dziel przez jej odchylenie standardowe przed analizą wielozmienną.
   9. Używaj macierzy transformowanej i skalowanej do analizy głównych składowych (PCA), analizy najmniejszych kwadratów (PLS-DA), ortogonalnej analizy najmniejszych kwadratów dyskryminantnych (OPLS-DA), klastrowania oraz analizy korelacji. Użyj oryginalnych przetworzonych intensywności cech do wykresów obfitości.
2. Notuj metabolity, dopasowując cechy do publicznych baz danych metabolomiki, w tym Human Metabolome Database (HMDB), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) oraz LIPID MAPS, jeśli to możliwe.
   1. Każdą adnotację oceniaj według błędu masy jonów prekursorowych, rozkładu izotopów oraz dopasowania fragmentów w tandemowej spektrometrii masowej. Przypisz maksymalnie 20 punktów do każdego kryterium
   2. Zastosuj okno masowo-błędowe jonów prekursorowych o wysokości 100 ppm oraz okno błędu masy jonów fragmentarnych o wartości 50 ppm. Nie stosuj stałego okresu retencyjnego.
   3. Zachowaj adnotacje z łączną oceną co najmniej 40 na 60. Wyklucz adnotacje o niższej ocenie.
3. Grupy porównawcze zdefiniuj wyraźnie następująco: A = T0 (przed sparingiem), B = T1 (bezpośrednio po sparingu) oraz C = T2 (24 godziny po sparingu).
4. Przeprowadzaj analizy statystyczne w dalszej fazie z wykorzystaniem oprogramowania do obliczeń statystycznych oraz powiązanych pakietów analitycznych (patrz Tabela materiałów).
   1. Po skalowaniu jednostkowym przeprowadź analizę głównych składowych (PCA) i zwizualizuj wykresy punktowe.
   2. Zbuduj częściową analizę najmniejszych kwadratów dyskryminujących (PLS-DA) oraz ortogonalną analizę najmniejszych kwadratów dyskryminujących (OPLS-DA) dla A kontra B, B kontra C oraz A versus C.
   3. Stosuj 7-krotną walidację krzyżową, gdy liczba próbek wynosi co najmniej 7. Jeśli liczba próbek jest mniejsza niż 7, ustaw liczbę fałdów równą liczbie próbek.
   4. Wykonaj 200 testów permutacyjnych, aby ocenić trafność modelu.
   5. Przesiewaj różnice metabolitów poprzez zastosowanie następujących progów: zmiana fałdowania (FC) ≥ 2 lub FC ≤ 0,5, zmienne znaczenie w projekcji (VIP) ≥ 1 oraz test t-test P. < 0,05.
   6. Generuj wykresy wulkanów i powiązane wykresy statystyczne do porównań parowych.
   7. Generuj mapy ciepła za pomocą macierzy przekształconej log2 i skalowanej wariancji jednostkowej.
   8. Generuj mapy korelacji o progu istotności P ≤ 0,05 i wyświetlaj do 20 metabolitów.
   9. Określ optymalną liczbę klastrów przed klastrowaniem k-średnich. Wykonaj klasteryzację średnią k-średnią po skalowaniu jednostkowym wariancji.
   10. Generuj wykresy słupkowe obfitości na podstawie oryginalnych przetworzonych intensywności cech.
   11. Wygeneruj diagramy Venna, aby podsumować nakładanie się porównań parowych.
   12. Przeprowadz analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla wybranych metabolitów. Oceń wydajność diagnostyczną na podstawie obszaru pod krzywą (AUC).
5. Odwzorowanie różnicowych metabolitów na szlaki KEGG poprzez wykorzystanie funkcji wzbogacania szlaków w odpowiednim pakiecie bioinformatycznym (patrz Tabela materiałów).
   1. Interpretuj szlaki z P. < 0,05. W finalnym zapisie analizy nie zgłoszono żadnej korekty wielokrotnych testów.

Results

Walidacja danych LC-QTOF-MS/MS kontroli jakości (QC)

Aby ocenić stabilność sygnału i powtarzalność, wielokrotnie analizowano wstrzykiwanie zebranej próbki QC w obu trybach jonowych. Współczynniki korelacji Spearmana wśród wstrzyknięć QC w grupie przekroczyły 0,8 w obu trybach jonów, co wskazywało na stabilne działanie instrumentu w całej sekwencji analitycznej. PCA wszystkich próbek i iniekcje QC wykazały ścisłe skupienie zastrzyków QC i brak wyraźnych odchyleń, co wspierało a...

Discussion

Ten ustandaryzowany przepływ pracy charakteryzował zmiany metabolitów związane ze sparingiem bokserskim elitarnym oraz krótkotrwałą regeneracją w małej, kontrolowanej grupie. Wstrzykiwanie w grupę QC, analiza korelacji oparta na QC, klasteryzacja PCA oraz analizy wielowariantowe razem wspierały akceptowalną stabilność analityczną. Sukces protokołu zależał przede wszystkim od czterech czynników: utrzymania intensywności sparingu w granicach 80%–85% maksymalnego tętna, przetwarzania próbek krwi w ciągu 1 godziny po pobrani...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki	Acetonitryl	Merck	Klasa LC-MS, CAS 75-05-8
Odczynniki	Metanol	Merck	Stopień LC-MS, CAS 67-56-1
Odczynniki	Kwas mrówkowy	TCI	Klasa LC-MS, CAS 64-18-6
Materiały jednorazowe	WAKUETOWA RURKA KOT, AKTYWATOR SKRZEPÓW SERUMU	Greiner Bio-One	8 mL rurka aktywująca skrzepy w surowicy
Materiały jednorazowe	Fiolka kriogeniczna Nalgene	Thermo Fisher Scientific	1,5 mL, gwint zewnętrzny
Materiały jednorazowe	Rurka LoBind Protein	Eppendorf	Cat. Nr 0030108442, 1,5 mL
Szkło	Fiolka szklana z zakrętką i wkładką	Agilent	2 mL fiolki z 200 ml i mu; Wkład szklany L; Wstaw Cat. Nr 5183-2090
Materiały jednorazowe	Filtr Millex-GP	Merck	Cat. Nie. SLGP033RS, 0,22 μ Membrana m
Instrumenty	Custom Boxing Ring 6x6 m	Muay Thai Sport	6 & razy; Ring treningowy na 6 m
Materiały jednorazowe	Rękawice bokserskie Pro Style 2	Everlast	16 oz
Instrumenty	Polar H10	Polarne	Czujnik tętna z paskiem klatkowym
Instrumenty	Quasar	H/P/Cosmos	Zmotoryzowana bieżnia
Instrumenty	Wirówka 5425 R	Eppendorf	Mikrowirówka chłodzona
Instrumenty	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	Cyfrowa kąpiel ultradźwiękowa 40 kHz
Instrumenty	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Zintegrowany koncentrator próżniowy
Instrumenty	VWR Mini Vortex Mixer	Avantor / VWR	Cat. Nr 10153-688
Instrumenty	TSX ULT Freezer	Thermo Fisher Scientific	Model TSX50086A
Instrumenty	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Wody	System UHPLC
Instrumenty	Xevo G2-XS QTof	Wody	Spektrometr mas QTOF
Instrumenty	KOLUMNA T3 ACQUITY UPLC HSS	Wody	P/N 176001132, 1,8 μ m, 2,1 & razy; 100 mm
Oprogramowanie	MassLynx	Wody	Wersja 4.2
Oprogramowanie	Progenesis QI	Wody	Wersja 2.3
Oprogramowanie	R	R Foundation for Statistical Computing	Wersja 3.6.1
Oprogramowanie	prcomp	Podstawa R	Funkcja bazy R
Oprogramowanie	ROPLS	Bioconductor	Pakiet R
Oprogramowanie	mapa pheatmap	CRAN	Pakiet R
Oprogramowanie	corrplot	CRAN	Pakiet R
Oprogramowanie	kmeans	Podstawa R	Funkcja bazy R
Oprogramowanie	NbClust	CRAN	Pakiet R
Oprogramowanie	venn	CRAN	Pakiet R
Oprogramowanie	MetaboAnalystR	CRAN / Laboratorium Xia	Wersja 1.0
Oprogramowanie	pROC	CRAN	Wersja 1.15.0
Oprogramowanie	clusterProfiler	Bioconductor	Pakiet Bioconductor
Bazy danych	Baza danych metabolomu człowieka (HMDB)	HMDB	Baza danych online
Bazy danych	Encyklopedia Genów i Genomów w Kioto (KEGG)	KEGG	Baza danych online
Bazy danych	MAPY LIPIDÓW	MAPY LIPIDÓW	Baza danych online