Zielona synteza nanocząstek złota i srebra za pomocą ekstraktów roślinnych, filtratek grzybów i kultur bakteryjnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje powtarzalne metody zielonej syntezy do produkcji nanocząstek złota i srebra za pomocą ekstraktów roślinnych, filtrate grzybów i kultur bakterii, z potwierdzeniem nanocząstek za pomocą spektroskopii ultrafioletowo-widzialnej i mikroskopii transmisyjnej elektronowej.

Streszczenie

Zielona synteza nanocząstek metali (NP) za pomocą systemów biologicznych zapewnia alternatywę zrównoważoną dla konwencjonalnych metod chemicznego wytwarzania. Ten protokół przedstawia reproduktyjne procedury eksperymentalne i analityczne do syntezy nanocząstek złota (Au) i srebra (Ag) z wykorzystaniem kultur bakterii, filtrateów grzybów i ekstraktów z liści roślin jako środków redukujących i stabilizujących. Nanocząstki srebra (AgNP) zostały wytworzone za pomocą ekstraktów z Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera i Earliella sp., wykazując charakterystyczne pasma absorpcji ultrafioletu-widzialnego (UV-Vis) między 405 a 425 nm, które potwierdziły powstanie NP. Zastosowano podejście projektowania eksperymentu (design-of-experiments), aby ocenić wpływ czynników środowiskowych, w tym warunków tlenowych, pH, stężenia Au, stężenia komórek, rodzaju donora elektronów i temperatury na syntezę nanocząstek złota (AuNP) przez Shewanella oneidensis i Cupriavidus metallidurans. W idealnych warunkach (0,2 mM Au i pH 5) S. oneidensis wytwarzał głównie sferyczne nanocząstki złota o średniej wielkości 43,6 ± 11,0 nm i charakterystycznym picie absorpcji na 520 nm. Powstanie i morfologia NP zostały potwierdzone za pomocą spektroskopii UV-Vis i mikroskopii elektronowej transmisyjnej. Ten proces zapewnia reproduktyjną platformę do biogenicznej syntezy NP i wspiera zastosowania w biosensorach, bioremediacji i technologiach przeciwdrobnousstrojowych.

Wprowadzenie

Metaliczne nanocząstki (NPs) mają unikalne właściwości fizykochemiczne związane z ich dużą powierzchnią, w tym charakterystyczne zachowania elektroniczne, magnetyczne i katalityczne, a także wysoką reaktywność. Te cechy sprzyjały ich zastosowaniu w wielu dziedzinach, w tym medycynie w diagnostyce chorób i dostarczaniu leków^1,2,3,4,5,6, kosmetyce w formułach kremów opalających⁷, elektronice w tranzystorach i ogniwach słonecznych⁸, inżynierii środowiska w oczyszczaniu wody^2,9,10 oraz rolnictwie jako nawozy i pestycydy^11,12. Ciągła ekspansja zastosowań NP w różnych dziedzinach znajduje odzwierciedlenie w rosnącej liczbie powiązanych publikacji zgłaszanych w ostatnich latach^13,14.

Syntetyczne metody dla metalicznych NP umożliwiają precyzyjną kontrolę nad ważnymi cechami takimi jak wielkość cząsteczki, morfologia i stabilność, co sprawia, że proces syntezy jest krytycznym determinantem wydajności NP. Konwencjonalne metody syntezy chemicznej zostały znacznie zoptymalizowane; jednakże często wiążą się z toksycznymi reagentami, wysokim zużyciem energii i podwyższonymi kosztami produkcji^14,15. Te ograniczenia motywowały rozwój zielonych i bardziej zrównoważonych alternatyw. Zielone podejścia syntezy wykorzystują systemy biologiczne takie jak ekstrakty roślinne ^16,17, mikroorganizmy, w tym grzyby i bakterie¹⁸, i algi¹⁹ jako naturalne czynniki redukujące i stabilizujące. Podczas tych procesów sole metaliczne są redukowane do form zerowalentowych, generując NPs poprzez ekologicznie przyjazne i opłacalne ścieżki. Ponadto, biologicznie syntetyzowane NPs są często biokompatybilne, ułatwiając ich zastosowanie w medycynie, rolnictwie i zastosowaniach środowiskowych^8,14.

Wybór odpowiednej biologicznej metody syntezy NP zależy od przewidzianego zastosowania, jak również dostępnej infrastruktury i wymagań operacyjnych. Synteza na bazie roślin jest ogólnie preferowana dla szybkiego i nisko kosztowego produkowania NP, ponieważ wymaga minimalnego sterylnego przetwarzania; jednakże, zmienność w składzie ekstraktu może wpłynąć na reproduktywalność^20,21. Synteza pośredniczona przez grzyby może zapewnić wysokie plony NP i enzymy pozakomórkowe, które poprawiają stabilizację NP i przetwarzanie w dalszym etapie, choć to podejście wymaga dłuższych okresów hodowli i kontrolowanych warunków wzrostu²². W przeciwieństwie do tego, systemy bakteryjne umożliwiają syntezę możliwą do regulacji w zdefiniowanych warunkach metabolicznych i szybką produkcję biomasy, co sprawia, że są odpowiednie dla badań mechanstycznych i zastosowań związanych z NP²². Jednakże, synteza bakteryjna często wymaga ścisłej sterylnej obsługi, kontrolowanych warunków bioreaktora i dodatkowego przetwarzania w dalszym etapie, gdy NPs są odzyskiwane wewnątrzkomórkowo^21,22.

Mimo wymienionych zalet, metody zielonej syntezy nadal stoją wobec wyzwań związanych z reproduktywalnością i standaryzacją. Co więcej, szczegółowe wizualne, krok po kroku protokoły dla zielonej syntezy metalicznych NP pozostają ograniczone²³, ograniczając zdolność badaczy do sukcesywnego reprodukowania i wdrażania istniejących metodologii. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie reproduktywalnych zielonych protokołów syntezy złota (Au) i srebra (Ag) NPs przy użyciu ekstraktów roślinnych, filtratek grzybów i kultur bakterii. Konkretnie, wodne ekstrakty z Psidium guayaquilensis i Acanthophora spicifera, pozakomórkowe filtrate grzybów z Earliella sp., oraz systemy bakterii obejmujące Shewanella oneidensis i Cupriavidus metallidurans zostały zastosowane do syntezy NP. Przedstawione protokoły podkreślają krytyczne kroki w przygotowaniu ekstraktu biologicznego, syntezie NP i wstępnej charakteryzacji NP. Ponadto, workflow integruje projektowanie eksperymentów, standaryzowane procedury przygotowania i charakteryzację w czasie rzeczywistym, aby wspierać reproduktywalną i optymalizowalną biogeniczną syntezę NP.

Protokół

Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Ekwador). Biomasa roślinna, glonów i grzybów użyta w tym badaniu została zebrana z dostępnych środowisk i nie obejmowała gatunków chronionych ani obszarów objętych ochroną. Zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i krajowymi, nie były wymagane żadne specjalne pozwolenia na zbieranie wolno dostępnej biomasy w tych warunkach. Zapoznaj się z Rysunkiem 1 dotyczącym zintegrowanego przepływu eksperymentu stosowanego do syntezy zielonej AgNP i AuNP przy użyciu biologicznych systemów roślinnych, glonów, grzybów i bakterii.

Rysunek 1: Zintegrowany Przepływ Syntezy Zielonej Nanocząstek Srebra (Ag) i Złota (Au) przy użyciu Systemów Biologicznych. Schemat przepływu eksperymentu do zielonej syntezy AgNP i AuNP za pomocą systemów roślinnych, glonów, grzybów i bakterii. Schemat przedstawia wybór źródła biologicznego, przygotowanie ekstraktów lub biomasy, reakcję z prekursorami metali (AgNO₃ lub HAuCl₄), warunki reakcji i tworzenie NP. Systemy biologiczne obejmują ekstrakt z liści Psidium guayaquilensis, ekstrakt z glonów Acanthophora spicifera, ekstrafilar z Earliella sp. i kultury bakterii Shewanella oneidensis MR-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa w laboratorium podczas manipulacji chemikaliami i materiałami biologicznymi. Przed użyciem zapoznaj się z kartami charakterystyki technicznej wszystkich reagentów.

1. Synteza AgNP przy użyciu liści P. guayaquilensis

1. Zbieranie liści
   1. Zbierz świeże liście P. guayaquilensis podczas pory suchej w Guayaquil, prowincji Guayas, Ekwador (2°10′S, 80°0′W).
      ​UWAGA: Okazy roślin tego gatunku endemicznego zostały zdeponowane w Herbariu GUAY, Wydziale Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu w Guayaquil, Ekwador, oraz w Ogrodzie Botanicznym w Nowym Jorku (NYBG) STEERE HERBARIUM, Nowy Jork, USA. Dodatkowe informacje są dostępne pod adresem: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Przygotowanie ekstraktu z liści
   1. Dokładnie przepłucz świeży materiał roślinny przegotowaną wodą.
   2. Susz liście w suszarce z powietrzem doprowadzonym siłą na 40°C.
   3. Zmiel wysuszony materiał za pomocą młynka ręcznego, aby uzyskać drobny proszek.
   4. Zawieś 10 g proszku w 200 ml przegotowanej wody.
   5. Podgrzej zawiesinę do 70°C pod ciągłym mieszaniem przez 1 godzinę.
   6. Pozwól, aby ekstrakt ostygł do temperatury pokojowej (RT, ~28°C).
   7. Przefiltruj ekstrakt pod próżnią przez papier filtracyjny jakościowy (Grad 1, wielkość porów 11 µm, średnica 110 mm).
      UWAGA: Usuń wszystkie reszty stałe z materiału roślinnego.
   8. Przechowuj przefiltrowany ekstrakt w temperaturze 4°C w bursztynowych butelkach do dalszego użycia.
3. Wytwarzanie fitogenicznych AgNP przy użyciu ekstraktów z liści
   UWAGA: Podczas eksperymentów z optymalizacją, zmieniaj jeden parametr na próbę, utrzymując pozostałe parametry na stałym poziomie. Oceń stężenie azotan srebra (AgNO₃) (1–5 mM), ułamek ekstraktu (10%–50% v/v), czas reakcji (0.5–1 h) i temperaturę (25°C–80°C). Optymalizuj parametry syntezy za pomocą metodologii powierzchni odpowiedzi na podstawie centralnego składnikowego DoE. Badaj każdy czynnik na pięciu poziomach (-α, -1, 0, +1 i +α). Użyj długości fali szczytu rezonansu plazmowego powierzchni (SPR) (λ_SPR), która koreluje z wielkością NP, jako zmiennej odpowiedzi²⁴. Projekt eksperymentu składa się z 16 punktów faktorialnych, 8 punktów osiowych i 5 powtórzeń punktu centralnego, co daje łącznie 29 eksperymentów.
   1. Przygotuj roztwory AgNO₃ przez rozpuszczenie odpowiedniej masy AgNO₃ w przegotowanej wodzie, aby uzyskać stężenia od 1 do 5 mM.
      ​UWAGA: AgNO₃ jest środkiem żrącym i silnym utleniaczem, który może powodować podrażnienie skóry i oczu. Noś odpowiednią odzież ochronną, w tym rękawice i ochronę oczu. Unikaj ekspozycji na światło i usuń odpad

Wyniki

AgNPs zostały pomyślnie zsyntetyzowane za pomocą zielonych i biosyntetycznych metod z wykorzystaniem różnych biologicznych czynników redukujących, a idealne warunki syntezy zostały zidentyfikowane dla każdej metody. W syntezie zielonej z wykorzystaniem ekstraktu z liści P. guayaquilensis optymalne warunki obejmowały stężenie AgNO₃ w wysokości 5 mM, stosunek ekstraktu do roztworu metalu w proporcji 25% (v/v), temperaturę reakcji 80°C i czas mieszania 60 min, po którym następowało 24-godzinne przestoj. ...

Dyskusja

Porównując ocenione metody syntezy pod względem wykonalności, kontroli wielkości NP, kosztów operacyjnych, powtarzalności i ogólnej wydajności procesu, synteza z udziałem roślin przy użyciu ekstraktu z liści P. guayaquilensis wykazała najkorzystniejszą równowagę wśród badanych metod syntezy AgNP. Ten protokół zapewnił lepszą kontrolę nad wielkością NP poprzez systematyczną optymalizację i bezpośrednią charakteryzację mikroskopijną, działając w łagodnych warunkach bez długotrwałej hodowli biologicznej. Ponadto me...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydration series
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	For serum bottles
Amber glass bottles	Duran	2180154	Light-protected storage
ATR-FTIR spectrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Sterilization at 121 °C
Butyl rubber stoppers	Dwk Kimble	73827-21	Gas-tight sealing
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Bench-top centrifuge
Chloroauric acid trihydrate (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Gold precursor
Diamond knife	Aurion	Dyatom 45	Ultrathin TEM sectioning
Distilled or deionized water	Methrom	N/A	Solution preparation
Epoxy resin (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	TEM embedding medium
Filter paper, qualitative Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Pore size: 11 µm; diameter: 110 mm
Fourier transform infrared spectrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Gas manifold system	Custom-built	N/A	For purge cycles
Gas-tight syringe	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyde	VWR	219859510	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	20% stock preservation
Handheld crimper	Biomed	USYGQ-20Z	Crimp sealing of serum bottles
Hand mill/grinder	Corona	L10000	Plant biomass grinding
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	320331	pH adjustment
Hydrogen (H2) gas	Linde	Industrial grade	Electron donor gas
ICP-OES system	Varian	Vista-MPX	Metal quantification
Incubator	Memmert	SM 400	Temperature-controlled incubation
Laboratory oven	Barnstead	M100	Drying nanoparticles
Lead citrate	Merck	7398	TEM staining
Nitric acid (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Acid reagent
Nitrogen (N2) gas	Linde	Industrial grade	Anoxic conditions
Osmium tetroxide (OsO4)	Merck	201030	TEM fixation
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Potato Dextrose Agar (PDA)	Merck	110130	Fungal cultivation
Potato Dextrose Broth (PDB)	Merck	P6685	Microbiological medium
Rotary shaker	JoanLab	OS-20Pro	Incubation at controlled agitation
Serum bottles (120 mL)	Wheaton	223748	Borosilicate glass
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	ACS reagent, ≥99.0%
Sodium cacodylate buffer	VWR	11650	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	0.9% washing solution
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	pH adjustment
Sodium lactate	Sigma-Aldrich	L7022	Electron donor/carbon source
Sterile syringes and needles	BD	Various	Sterile liquid handling
Stirring hot plate	Biologix	01-310X	Heating and agitation
Toluidine blue	EMS	DcU-10	Semi-thin section staining
Transmission electron microscope (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Equipped with high-resolution digital camera
Tray dryer with forced airflow	Handmade	N/A	Biomass drying at 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Microbiological medium
Tryptic Soy Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	Microbiological medium
Uranyl acetate	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	TEM staining
UV–Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	UV–Vis spectral analysis
Vacuum pump	KNF or equivalent	N 820 G	For anoxic conditions
Biological Materials
Biological Material	Source	Identifier	Comments/Description
Acanthophora spicifera	Local collection	N/A	Marine algal biomass
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Bacterial strain
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Institutional fungal collection
Psidium guayaquilensis	Local collection	N/A	Wild plant biomass
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Culture collection strain