Metoda adaptacji Euglena gracilis do podłoży na bazie kaszawy do heterotroficznego uprawy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę krok po kroku adaptacji Euglena gracilis do substratów na bazie kasawi i następującą ocenę wzrostu, żywotności i produkcji biomasy w wielu produktach z kasawi w warunkach upraw heterotroficznych.  

Streszczenie

Przetwórstwo kasawi generuje uboczne produkty bogate w składniki odżywcze, które pozostają niedoceniane ze względu na zmienny skład chemiczny, związki cyjanogenne i aktywne społeczności mikrobiologiczne. Ten protokół przedstawia wieloetapowy plan adaptacji do ustanowienia kasawiotolerancyjnej linii Euglena gracilis nadającej się do heterotroficznej kultywacji na podłożach pochodzących z kasawi. Metoda rozpoczyna się od jednoczesnego narażenia kultur Euglena na autoklawowany i nieautoklawowany medium kasawiowe oraz na gradient stężenia garri od 10 do 30 g/L, aby ocenić tolerancję na złożoność mikrobiologiczną i obciążenie podłoża. Następnie kultury są poddawane wyższemu gradientowi stężenia od 30 do 50 g/L, aby ocenić wydajność przy użyciu gęstszych podłoży. Wynikowa linia jest porównywana z nieprzystosowanym szczepem typu dzikiego wśród pięciu produktów kasawowych; garri, suszona masa, pelety, skórki i pasza dla zwierząt, aby ocenić spójność wzrostu w materiałach odpowiednich dla pola. Protokół obejmuje pomiar zmian pH, poziomów cyjanku za pomocą kolorymetrycznych pasków oraz przygotowanie wysuszonej biomasy do analizy białka na podstawie całkowitej ilości azotu. Wszystkie te procedury zapewniają reprodukowalny rama dla adaptacji Euglena gracilis do podłoży pochodzących z kasawi oraz dla oceny wydajności szczepów w różnorodnych produktach kasawi. Ta metoda umożliwia rozwój wytrzymałych linii alg do zastosowania w przetwarzaniu bioprocesowym i aplikacjach wartościowania odpadów skupionych na kasawie.

Wprowadzenie

Mańdziołka (Manihot esculenta) jest główną rośliną żywnościową i przemysłową w zachodniej Afryce, wytwarzającą przetworzone produkty uboczne, takie jak garri, suszona masa, skórki i pelety^1.

Podłoża pochodzące z mańdziołki składają się głównie z fermentowalnych węglowodanów i resztkowych składników odżywczych, a także niewielkiego stężenia białka i błonnika, choć skład może się różnić w zależności od warunków przetwarzania i surowca źródłowego^2,3. Pozostają one niedostatecznie wykorzystywane ze względu na ich niejednorodny skład, obecność cyjanogennych glikozydów oraz zróżnicowane społeczności mikrobiologiczne, które powstają podczas tradycyjnego przetwarzania i fermentacji⁴. Te cechy stanowią wyzwania dla bezpośredniego uprawiania mikroorganizmów i ograniczają integrację produktów ubocznych z mańdziołki z standaryzowanymi procesami bioprocesowymi. Mimo obfitości produktów ubocznych pochodzących z mańdziołki, obecnie brakuje metod powtarzalnych i przyjaznych dla środowiska do uprawiania systemów mikrobiologicznych na tych chemicznie złożonych i aktywnych mikrobiologicznie podłożach. System uprawy zdolny do wzbogacania lub odtruwania tak popularnego źródła pożywienia, działającego niezawodnie w takich warunkach, wsparłby bardziej zrównoważone procesy przetwarzania mańdziołki i cyrkularne wykorzystanie zasobów.

Euglena gracilis to jednokomórkowy biczykowiec z grupy Euglenozoa⁵, znany ze swojej elastycznej ściany komórkowej, dynamicznej morfologii i możliwości otoczenia się osłoną w odpowiedzi na znaczne wahania dostępności składników odżywczych, ciśnienia osmotycznego i składu chemicznego⁶. Jego metaboliczna adaptacyjność pozwala mu również na syntezę paramylonu, polisacharydu magazynującego⁶, oraz regulację pH komórkowego poprzez metabolizm kwasów organicznych. Te cechy metaboliczne, szczególnie akumulacja paramylonu, mogą zwiększać magazynowanie energii i tolerancję na stres, wspierając przetrwanie i adaptację w zmiennych warunkach żywieniowych i chemicznych charakterystycznych dla podłoży pochodzących z mańdziołki. Te cechy pozwalają E. gracilis przetrwać w chemicznie różnorodnych warunkach słodkowodnych, co sprawia, że jest on obiecującym kandydatem do uprawy na niejednorodnych, nierafinowanych podłożach⁷.

Gdy są narażone na chemicznie złożone lub mikrobiologicznie aktywne podłoża, nieprzystosowane kultury E. gracilis często wykazują reakcje stresowe, takie jak zwiększona otoczka osłonowa i zmniejszona ruchliwość, podczas gdy przystosowane populacje mogą utrzymywać bardziej stabilną morfologię i aktywność metaboliczną⁸. Interakcje z powiązanymi społecznościami mikrobiologicznymi mogą dodatkowo wpływać na działanie fizjologiczne podczas długotrwałego narażenia na złożone podłoża. Te cechy podkreślają znaczenie podejść opartych na adaptacji podczas uprawiania E. gracilis na materiałach pochodzących z mańdziołki⁹.

Aby sprostać tym wyzwaniom, ta metoda stosuje etapową strategię adaptacji zaprojektowaną do stopniowego przyzwyczajania E. gracilis do podłoży pochodzących z mańdziołki. Podejście to obejmuje kontrolowane narażenie na rosnące złożoność podłoża i aktywność mikrobiologiczną, co pozwala na wybór populacji zdolnych do utrzymania żywotności i wzrostu w zróżnicowanych warunkach uprawy. To zaprojektowanie pozwala E. gracilis na interakcję i potencjalne czerpanie korzyści z powiązanej mikroflory oraz adaptację do rosnących stężeń w podłożu.

Po adaptacji, protokół prowadzi porównawczą ocenę przystosowanych i nieprzystosowanych linii E. gracilis na różnych produktach pochodzących z mańdziołki. Ta porównawcza ramka umożliwia ocenę spójności wzrostu, stabilności morfologicznej i reakcji fizjologicznych w warunkach podłoży odpowiednich dla terenu, gdyż proces adaptacji stopniowo przygotowuje E. gracilis do radzenia sobie ze zmiennością składników odżywczych, czynnikami stresującymi chemicznymi i aktywnością mikrobiologiczną charakterystycznymi dla produktów ubocznych z mańdziołki.

Metoda ta obejmuje standaryzowane monitorowanie pH i poziomów cyjanku¹⁰ podczas uprawy, a także przygotowanie zebranej biomasy do dalszej analizy białka poprzez kwantyfikację całkowitego azotu¹¹, co umożliwia porównanie potencjału żywieniowego różnych podłoży i szczepów. Razem, te pomiary wspierają ocenę stabilności metabolicznej, interakcji podłoża oraz cech biomasy podczas uprawy na bazie mańdziołki i adaptacji, aby wykazać, że przystosowana linia E. gracilis może rosnąć mocno i spójnie na wielu produktach ubocznych z mańdziołki.

Ta metoda jest najbardziej odpowiednia do laboratoriów lub zastosowań badań stosowanych z dostępem do podstawowej infrastruktury mikrobiologicznej i lokalnie do

Protokół

Ten protokół wykorzystuje niepatogenne protisty i podłoża roślinne pochodzące z kasawi. Przeprowadź wszystkie procedury zgodnie z instytucjonalnymi wymaganiami bezpieczeństwa biologicznego i chemicznego dotyczącymi materiałów roślinnych zawierających cyjanoglifyozydy.

1. Przygotowanie i fermentacja podłoży na bazie kasawi

UWAGA: Materiały pochodzące z kasawi mogą zawierać cyjanoglifyozydy i mogą uwalniać cyjanowodór w pewnych warunkach. Przeprowadzaj wszystkie ważenia, hydratację, mieszanie i pobieranie próbek w wyciągu chemicznym. Noś fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Dezynfekuj powierzchnie robocze po potraktowaniu podłożami kasawi i usuń odpady stałe i ciekłe jako odpady chemiczne według wytycznych instytucjonalnych.

1. Przygotuj zawiesiny garri
   Uwaga: Dziki typ Euglena gracilis był hodowana w warunkach ciągłego ciemna przy 28°C z mieszaniem orbitalnym przy 120 x g. Kompozycja heterotroficznego podłoża odżywczego została przygotowana jako zdefiniowana formuła składająca się z 1,5% glukozy, 0,5% wyciągu z drożdży, 0,1% KH2PO4, 0,1% MgSO4, 0,2% (NH4)2SO4, 0,01% CaCL2.2H2O plus 0,4 mL/L roztworu stockowego witamin (witamina B1: 2,50g/L; witamina B12: 12,5 mg/L; witamina B6: 0,5mg/L; witamina B7: 0,025 mg/L) i 2,0 mL/L roztworu stockowego metali śladowych (Na2EDTA.2H2O: 25,00 g/L; FeCl3.6H2O: 21,00 g/L; ZnSO4.7H2O: 11,0 g/L; MnCl2.4H2O: 4,0 g/L; CuSO4.5H2O: 0,39 g/L; H3BO3: 0,285 g/L; Na2MoO4.2H2O: 0,9 g/L).
   1. Etykietuj każdą sterylną butelkę o pojemności 500 mL z wieczkowym kapslem z otworem wentylacyjnym z typem podłoża (garri), docelową koncentracją (10, 20, 30, 40 lub 50 g L^-1), identyfikatorem repliki i planowanym warunkiem sterylizacji (autoklawowana lub nieautoklawowana).
   2. Umieść łódź ważeniową na wadze analitycznej i naciśnij TARE/Zero, aby ustawić wyświetlacz na 0,000 g.
   3. Waż garri tak, aby pasowało do końcowej objętości roboczej (np. dla 300 mL, waż 3,0 g dla 10 g L^-1, 6,0 g dla 20 g L^-1, 9,0 g dla 30 g L^-1, 12,0 g dla 40 g L^-1 lub 15,0 g dla 50 g L^-1).
      UWAGA: Wybrany zakres koncentracji (10–50 g L^-1) został zaprojektowany, aby obejmować warunki od wzrostu bazowego do wysokiego obciążenia podłożem, umożliwiając ocenę adaptacji na rosnącej złożoności fizykochemicznej.
   4. Aseptycznie dodaj ważony garri do każdej sterylnej butelki o pojemności 500 mL zawierającej 300 mL dejonizowanej lub destylowanej wody i ponownie zamocuj wieczkowy kapsel.
   5. Mieszaj każdą zawiesinę przez 3 min, aż mieszanka będzie homogenizowana za pomocą jednego z następujących podejść.
      UWAGA: E. gracilis jest wrażliwa na mechaniczne ścinanie; dlatego warunki mieszania zostały dobrane, aby zminimalizować stres indukowany przez mieszanie, zachowując jednocześnie odpowiedni kontakt między komórkami a podłożem.
      1. Do manualnego mieszania dokręć wieczkowy kapsel i kręć butelką ręcznie w kierunku kołowym przez 3 min, aż skondensowane cząstki będą równomiernie rozproszone.
      2. Do mieszania magnetycznego aseptycznie dodaj sterylną łopatkę mieszającą do butelki, umieść butelkę na płycie mieszającej i ustaw prędkość na 200 x g, aby utworzyć płytki wirnik bez rozbryzgiwaniu.
   6. Pozwól zawiesinie na hydratację bez zakłóceń przez 10 min w temperaturze pokojowej (25 °C).
   7. Najpierw przed fermentacją delikatnie homogenizuj mieszaninę, ściągając wieczkowy kapsel i kręcąc butelkami ręcznie 5 razy, aby resuspendować osadzone materiały.
      UWAGA: Garri użyte w tym badaniu było dostępnym komercyjnie produktem pochodzącym z kasawi. Na podstawie informacji o wartości odżywczej dostarczonych przez producenta składało się głównie z węglowodanów, z niewielkimi ilościami białka i nieznaczną zawartością tłuszczu. Ta kompozycja odzwierciedla typowe przetworzone podłoża kasawiowe stosowane w kontekście spożywczym i przemysłowym.
2. Przygotuj dodatkowe podłoże na bazie kasawi
   1. Etykietuj każdą sterylną butelkę o pojemności 500 mL z wieczkowym kapslem z otworem wentylacyjnym z typem podłoża (suszone miazga, pelety, skórki lub pasza dla zwierząt), koncentracją (30 g L^-1), identyfikatorem repliki i warunkiem sterylizacji (autoklawowana lub nieautoklawowana).
   2. Umieść łódź ważeniową na

Wyniki

Poniższe wyniki reprezentatywne ilustrują oczekiwane rezultaty, gdy opisany protokół jest stosowany pomyślnie, a także zakres wyników obserwowanych w warunkach suboptymalnych. Reprezentatywne dane odpowiadające tym wynikom są przedstawione na Rysunku 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7. Wszystkie te wyniki dostarczają praktycznych wskazówek dotyczących interpretacji dynamiki wzrostu, żywotności, morfologii i wyników białkowych podczas adaptacji E. gracilis do substratów na bazie kassawi pod warunkami heterotroficznego, całkowicie ciemnego uprawiania. Ponadto te wyniki potwierdzają kluczowe biologiczne wyniki protokołu, w tym pomyślną adaptację, utrzymany wzrost, wysoką żywotność, stabilną morfologię, spójną wydajność na różnych substratach i wykrywalną produkcję białek.

Przez cały czas trwania eksperymentów wykorzystano trzy replikaty na każde z traktowań (wszystkie typy mediów z kassawą). Przyjmujemy, że liczba replikat zależy od uznania i ograniczeń logistycznych każdej grupy stosująej się do powyższych protokołów. Pomyślne zastosowanie tego protokołu powoduje utrzymany heterotroficzny wzrost E. gracilis w mediach opartych na garri w warunkach całkowicie ciemnych. Pozytywne wyniki charakteryzują się gładkimi, sygmaloidalnymi trajektoriami wzrostu, ograniczonym rozbieżnością między replikatami i stabilnymi gęstościami komórek w późnej fazie. Cecha morfologiczna, która oznaczała pozytywne wyniki i była konsekwentnie obserwowana w zaadaptowanych populacjach, to zaokrąglenie komórek i grube błony komórkowe. Natomiast niezdrowe zapadające się komórki zazwyczaj wyglądają nieregularnie, fragmentalnie lub są strukturalnie osłabione i są związane z obniżoną żywotnością, co odróżnia je od całych zaokrąglonych lub półotoczkowanych form obserwowanych w zaadaptowanych hodowlach. Dla odniesienia, reprezentatywne obrazy dzikiego typu E. gracilis wykazującego charakterystyczną wydłużoną morfologię są dołączone (Rysunek 8), aby odróżnić podstawową strukturę komórkową od zaadaptowanych lub zmienionych form. Kultury wyhodowane w 30 g L^-1 garri wykazywały wyższy zintegrowany wzrost, mierzony jako pole pod krzywą wzrostu (AUC), w porównaniu z niższymi stężeniami, co sugeruje bardziej wydajne wykorzystanie substratu z kassawi i pomyślną adaptację fizjologiczną (Rysunek 1).

Suboptymalne wyniki są często obserwowane przy niższych stężeniach garri (10–20 g L^-1), gdzie wzrost jest wykrywalny, ale zmniejszony w wielkości i bardziej zmienny między replikatami. Przy wyższych stężeniach (40–50 g L^-1) kultury mogą osiągać podwyższone maksymalne gęstości komórek; jednak te warunki często wykazują opóźnioną stabilizację lub zwiększoną zmienność czasową (Rysunek 2).

W pomyślnych eksperymentach żywotność komórek pozostaje wysoka przez cały okres hodowli, z niewielkimi wahaniami w połowie eksperymentu. Testy wykluczania Trypan Blue wskazują, że kultury utrzymane w 30 g L^-1 garri zachowują wysoką proporcję żywych (niezbarwionych) komórek względem nieżywych (zbarwionych na niebiesko) komórek w pobranej próbce w różnych punktach czasowych (Rysunek 3). Odchylenia od tego wzorca, w tym zwiększona proporcja zbarwionych komórek, zmniejszona ruchliwość lub przesunięcia w kierunku zaokrąglonych lub zapadających się morfologii, mogą wskazywać na warunki suboptymalne i służyć jako wczesne sygnały do rozwiązywania problemów. Oceny żywotności i morfologii opierały się na spójnych kryteriach obserwacyjnych, w tym na integralności komórek, ruchliwości kierunkowej i względnej częstości występowania form wydłużonych w porównaniu z zaokrąglonymi lub zapadającymi się formami.

Suboptymalne wyniki charakteryzują się przejściowymi spadkami żywotności, najczęściej obserwowanymi przy wyższych stężeniach garri. Możliwe jest częściowe odzyskanie w późniejszych punktach czasowych; jednak te warunki wykazują zwiększoną zmienność żywotności w okresie hodowli (Rysunek 4). Te wzorce wzrostu pokazują, że średnie stężenia substratu (np. 30 g L^-1) zapewniają równowagę między dostępnością składników odżywczych a stresem, co prowadzi do bardziej stabilnego wzrostu. Te trendy odzwierciedlają wpływ warunków przetwarzania i stopniowej adaptacji na wydajność hodowli, ponieważ stopniowe narażenie na rosnącą złożoność substratu wspiera lepszą stabilność fizjologiczną i powtarzalne zachowanie wzrostu. Niższe stężenia ograniczają produkcję biomasy, podczas gdy wyższe stężenia prowadzą do większej zmienności i opóźnionej stabilizacji.

Oceny morfologicz

Dyskusja

Kluczowym czynnikiem sukcesu w tym protokole jest równowaga między stężeniem substratu z kasawi a stabilnością fizjologiczną podczas heterotroficznej kultywacji E. gracilis. Materiały pochodzące z kasawi wprowadzają fizyczną heterogeniczność, pozostałe cząstki i zmienne kinetyki uwalniania składników odżywczych, które bezpośrednio wpływają na zachowanie wzrostu i stabilność kultury^2,3. Wśród kroków protokołu, preparacja substratu i wybór stężenia przedstawiają najbardziej wrażliwe punkty kontrolne. Jak pokazują Przedstawione Wyniki, pośrednie stężenia substratu niezawodnie wspierają utrzymane wzrost z ograniczoną różnicą replikacji, podczas gdy niższe stężenia ograniczają akumulację biomasy, a wyższe stężenia zwiększają zmienność czasową i przejściowe reakcje na stres. Te wyniki podkreślają, że maksymalne ładowanie substratu niekoniecznie przynosi optymalne lub stabilne wyniki kultywacji, gdy pracuje się z heterogenicznymi materiałami agro-przemysłowymi. Wybrane kroki przetwarzania wstępnego i zakresy stężeń substratu zostały zaprojektowane tak, aby stopniowo wyzywać E. gracilis pod coraz większą złożonością chemiczną i mikrobiologiczną. Zaobserwowane różnice w stabilności wzrostu i żywotności w tych warunkach potwierdzają ważność tego etapowego podejścia i potwierdzają, że pośrednie stężenia substratu zapewniają równowagę między dostępnością składników odżywczych a stresem fizjologicznym.

Obsługa kultury podczas heterotroficznego wzrostu dalsze wpływa na wyniki adaptacji. Konsekwentne, ale delikatne mieszanie w całkowicie ciemnych warunkach było kluczowe dla utrzymania kontaktu między E. gracilis komórkami a zawieszonym materiałem substratu, unikając jednocześnie nadmiernego stresu ścinającego. Niewystarczające mieszanie sprzyjało sedymentacji i lokalnym gradientom składników odżywczych, co komplikowało zarówno pomiary wzrostu, jak i żywotności, szczególnie w nieautoklawowanych mediach¹². Te obserwacje zgadzają się z poprzednimi raportami pokazującymi, że przestrzenna heterogeniczność i nierównomierne narażenie na substrat mogą zacierać odpowiedzi fizjologiczne w systemach kultywacji mikroorganizmów. Protokół zatem podkreśla rutynowe odwracanie zamiast ciągłego mieszania jako praktyczny kompromis między jednorodnością a integralnością kultury. 

Aby sprostać zmienności nieodłącznej substratom na bazie kasawi, protokół zawiera wiele punktów narady nad rozwiązywaniem problemów i elastyczności. Autoklawacja fermentowanego media z kasawi poprawiła krótkoterminową spójność poprzez zmniejszenie ładunku mikrobiologicznego i zmianę struktury substratu, szczególnie podczas wczesnych etapów adaptacji. W przeciwieństwie do tego, media nieautoklawowane może być skutecznie używane po udanej adaptacji, pod warunkiem, że gęstość inokulum i mieszanie były wystarczające, aby utrzymać stabilny wzrost. Ten etapowy podejście jest zgodny z wcześniejszymi badaniami pokazującymi że stopniowe selektywne ciśnienie umożliwia populacjom mikroorganizmów tolerowanie rosnącej złożoności środowiskowej z czasem^13,14. Długotrwała monitoryzacja była niezbędna w tym kontekście, ponieważ przejściowe spadki wzrostu lub żywotności często odzyskiwano podczas następnych przebiegów bez kompromitacji ogólnego sukcesu adaptacji. 

Testy żywotności i monitorowanie morfologiczne służyły jako szybkie narzędzia diagnostyczne w całym procesie adaptacji. Wykluczenie Trypan Blue dostarczyło ilościowego wskaźnika fizjologicznej odporności, podczas gdy ocena oparta na mikroskopii ruchliwości i encystacji oferowała wczesne ostrzeżenie o nieoptymalnych warunkach, takich jak nadmierne ładowanie substratu lub opóźniona aklimatyzacja¹⁵. Co ważne, protokół podkreśla trendy na przestrzeni czasu, a nie pojedyncze pomiary, ponieważ krótkotrwałe wahania żywotności lub morfologii nie zawsze przewidywały długoterminowej niepowodzenie kultury. To długotrwałe perspektywa okazała się kluczowa dla rozróżnienia przejściowych reakcji na stres od trwałego fizjologicznego spadku. Spadek wykrywalnych poziomów cyjanku obserwowanych podczas kultywacji sugeruje częściową detoksykację substratów pochodzących z kasawi w opisywanych warunkach. Te spadki mogą wynikać z kombinacji degradacji związanej z fermentacją, wolatylizacji i aktywności mikrobiologicznej. Chociaż specyficzne mechanizmy biochemiczne i kinetyki usuwania cyjanku nie były bezpośrednio badane w tym badaniu, te obserwacje wspierają włączenie monitorowania cyjanku jako praktycznego wskaźnika transformacji substratu i wykonalności kultury podczas adaptacji.

Kilka ogranicz

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Autoclave - 533LS Steam Sterilizer	Getinge	533LS	Sterylizacja parowa mediów z kasawią. Sterylizuj medium za pomocą cyklu płynnego.
Bright-Line™ Hemacytometer replacement cover slip	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	Specjalistyczne grube pokrywy przeznaczone do użytku w hemocytometrze.
Cassava dried pulp	Psaltry International	N/A	Dostarczony podłoże z kasawią
Cassava pellets	Psaltry International	N/A	Dostarczony podłoże z kasawią
Cassava peels	Psaltry International	N/A	Dostarczony podłoże z kasawią
Cassava substrate (garri)	Local supplier	N/A	Pochodzące z kasawi garri podłoże używane jako źródło węgla przygotowane z odjonizowanej wody.
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifuge	75004241	Zdolny do ≥3 500 × g, używany do zbioru biomasy.
Centrifuge tubes E.g. Axygen (A Corning Brand)	Corning	MCT-150-C-S	Sterylne, minimalna objętość 1,5 mL
Clean water E.g. UltraPure™ DNase/RNase- Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977035	Odjonizowana lub destylowana. Używana do przygotowania mediów
Compound light microscope	Olympus	N/A	Standardowy mikroskop złożony odpowiedni do rutynowej obserwacji i liczenia komórek.
Cyanide Test Strips, colorimetric. CN- 10-30 mg/L	MQuant	110044	Półilościowa detekcja cyjanowodoru. Usuwaj jako odpady niebezpieczne
Sterile Standard Weighing Boat	Fisher Scientific	01-549-750	Używany do ważenia podłoży z kasawią i suchej biomasy.
Euglena gracilis (adapted lineage)	N/A	N/A	Dostosowany do kasawi szczep Euglena wygenerowany w niniejszym badaniu
Euglena gracilis (Wild-type)	N/A	N/A	Niedostosowany szczep odniesienia. Utrzymuj te same warunki standardowe.
Euglena growth medium components	Various	N/A	Podstawowe medium Euglena przygotowane zgodnie ze standardowymi recepturami laboratoryjnymi.
FreeZone 6 Liter Console Freeze Dryer	Labconco	70061xxxx	Używany do odwadniania biomasy
Hemocytometer with Standard Lines	Weber Scientific	NC1587539	Używany do ręcznego liczenia komórek.
Magnetic stirrer with hot plate	IKA	N/A	Opcjonalnie; poprawia spójność podczas przygotowania mediów i zawiesiny podłoża.
Micropipettes (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	Pipety o regulowanej objętości używane do aseptycznych przelewów płynów.
Mini-centrifuge	Eppendorf	N/A	Opcjonalnie; ułatwia szybkie osiadanie podczas zbioru biomasy.
Parafilm	Bemis	PM996	Używany do tymczasowego uszczelniania kolb lub płytek, gdy niedostępne są nakrętki wentylacyjne.
pH indicator strips	Fisher Scientific	13-640-520	Alternatywna metoda pomiaru pH do szybkiej jakościowej oceny mediów kulturalnych.
pH meter with probe Thermo Scientific Orion Star A211 Benchtop pH Meter	Thermo Scientific Orion Star A211 Benchtop pH Meter	13-645-519	Kalibrowany przed użyciem. Do pomiaru pH nadstanu kultury
Refrigerated storage (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	Krótkotrwała przechowywanie mediów
Shaking incubator (dark)	Thermolyne	M49235	Orbitalny inkubator z mieszaniem o mocy 100–150 RPM, zakres temperatur 24–28 °C; używany w warunkach ciemności do wspierania heterotroficznego wzrostu Euglena.
Spray bottle (32oz)	Boardwalk	BWK03010	Używany do sterylizacji na blacie i rutynowej aseptycznej obsługi (70% roztwór etanolu)
Spreadsheet software	Microsoft Excel	N/A	Zbieranie, organizacja i analiza danych
Sterile pipette tips	Eppendorf	N/A	Sterylne, jednorazowe końcówki kompatybilne z pipetami P20, P200 i P1000.
Sterile serological pipettes (5, 10, 25 mL)	Corning	N/A	Indywidualnie zapakowane sterylne pipety używane do transferu kultur i pobierania próbek.
Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	T8154	Barwnik vitalny używany do oceny żywotności komórek za pomocą testu wykluczającego Trypan Blue.
Tubes for sample collection (50 mL)	Falcon	14-432-22	Do pobierania próbek pH i cyjanku
Vent-cap Erlenmeyer flasks (250–500 mL)	Corning