Cytokiny i polimorfizmy genów zapalnych związane z infekcją płuc nosokomialną po spontanicznej krwotoczu śródmózgowym

Podsumowanie

To studium retrospektywne przedstawia powtarzalny proces pobrania krwi we wczesnym okresie po przyjęciu do szpitala, pomiaru stężenia cytokin w surowicy i receptorów Toll-podobnych, genotypowania polimorfizmów genów zapalnych oraz oceny ryzyka infekcji u pacjentów z spontaniczną krwotoczą do mózgu.

Streszczenie

Zakaźne zapalenie płuc w warunkach szpitalnych jest częstą powikłaniem po spontanicznej krwotoce śródmózgowej i może pogorszyć powrót do zdrowia neurologicznego, przedłużyć hospitalizację i zwiększyć obciążenie kliniczne. To retrospektywne badanie kliniczno-laboratoryjne przedstawia odtwarzalny proces oceny markerów zapalnych i profili immunogenetycznych żywiciela związanych z zakaźnym zapaleniem płuc w warunkach szpitalnych po pierwotnej spontanicznej krwotoce śródmózgowej. Pacjenci są klasyfikowani w zależności od tego, czy zakaźne zapalenie płuc występuje po przyjęciu do szpitala. We wczesnym okresie po przyjęciu, w warunkach znormalizowanych przed-analitycznych, pobiera się krew obwodową z żyły. Osocza jest oddzielana, porcjonowana i przechowywana do pomiaru za pomocą enzymatycznego testu immunopochłaniania IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 i TLR9. Równolegle ekstrahowana jest DNA genomowa z przeciwzakrzepowej pełnej krwi i używana do polimerazowej reakcji łańcuchowej z ograniczaniem fragmentów polimorficznych dla wybranych lokusa związanych z cytokinami i receptorami Toll-podobnymi. Proces obejmuje również procedury kontroli jakości dotyczące postępowania z próbkami, powtórne pomiary ELISA, ocenę czystości DNA, wyznaczanie genotypów i powtórne genotypowanie. Analiza statystyczna obejmuje porównanie międzygrupowe cech klinicznych i poziomów biomarkerów, testowanie równowagi Hardy’ego-Weinberga, analizę regresji logistycznej dla skojarzeń genotypów i alleli, korektę dla istotnych klinicznych współczynników oraz korektę fałszywie dodatnich wyników dla wielu porównań genetycznych. Ten skombinowany proces kliniczny, zapalny i immunogenetyczny może pomóc w charakteryzowaniu profili ryzyka zakażenia po spontanicznej krwotoce śródmózgowej, choć przed rutynowym zastosowaniem klinicznym wymagana jest walidacja wieloośrodkowa.

Wprowadzenie

Mistna krwotok do wnętrza mózgu (ICH) jest poważnym podtypem udaru spowodowanym nietraumatycznym pęknięciem naczyń mózgowych i pozostaje głównym źródłem neurologicznych zgonów i niepełnosprawności. Klinicznie, ICH jest zwykle klasyfikowana jako pierwotna lub wtórna. Pierwotne ICH stanowi większość przypadków i jest głównie związane z nadciśnieniową arteriopatią lub amyloidową angiopatiką mózgu¹. Natomiast ICH wtórna jest związana z przyczynami strukturalnymi lub hematologicznymi, w tym tętniaki, tętniaki tętniczo-żylne, choroba Moyamoya i zaburzenia krzepnięcia. Chociaż ICH stanowi mniejszy udział wszystkich przypadków udaru niż udar niedokrwienny, jest związana z wysoką krótkoterminową śmiertelnością i długoterminowym obciążeniem funkcjonalnym^2,3,4,5.

Wśród głównych powikłań szpitalnych po ICH, infekcja płuc nosokomialna jest szczególnie częsta i klinicznie istotna. Poprzednie badania wykazały, że infekcja płuc może wystąpić u znacznej liczby hospitalizowanych pacjentów po udarze lub krwotokach do mózgu i jest związana z dłuższym pobytem w szpitalu, większym obciążeniem medycznym, gorszym powrótem do zdrowia neurologicznego i zwiększoną śmiertelnością^6,7,8. Kliniczne znaczenie tego powikłania wykracza poza samą opiekę oddechową. Obniżona świadomość, upośledzone odruchy połykania i kaszlu, unieruchomienie, wsparcie mechaniczne dróg oddechowych i inwazyjne procedury drenażowe mogą wszystkie zwiększać ryzyko infekcji w ostrym okresie po ICH. Jednocześnie infekcja płuc może dodatkowo pogorszyć stan zapalny ogólnoustrojowy, zaburzyć dostarczanie tlenu i komplikować opiekę neurokrytyczną, tym samym nasilając procesy wtórnego uszkodzenia.

Ta zależność jest biologicznie prawdopodobna, ponieważ ICH jest nie tylko ogniskowym wydarzeniem naczyniowym mózgu, ale również wyzwalaczem ogólnoustrojowej dysregulacji układu odpornościowego. Ostra krwotok do mózgu może aktywować kaskady zapalne, zmieniać sygnalizację odporności wrodzonej i zakłócać równowagę między neurozapaleniem a obronieniem organizmu. W tym kontekście niektórzy pacjenci mogą stać się bardziej podatni na infekcje szpitalne nawet przy podobnym leczeniu klinicznym. Dlatego infekcja płuc po ICH nie powinna być postrzegana wyłącznie jako konsekwencja narażenia w łóżku pacjenta lub opieki wsparcia; może również odzwierciedlać różnice w aktywacji układu odpornościowego i reaktywności immunologicznej pacjenta.

Mimo klinicznej istotności tego powikłania, praktyczne podejścia do wczesnej stratyfikacji ryzyka pozostają ograniczone⁹. Istniejące kliniczne podejścia do stratyfikacji ryzyka infekcji płuc po ICH opierają się ogólnie na zmiennych związanych z łóżkiem i przyjęciem do szpitala, takich jak ciężkość stanu neurologicznego, wiek, upośledzenie połykania, choroby współistniejące, inwazyjne zabiegi i czas ekspozycji na urządzenia. Narzędzia te są przydatne klinicznie, ponieważ mogą być szybko zastosowane w środowisku ratunkowym, intensywnej terapii lub opieki neurokrytycznej. Jednak samo zmienności kliniczne nie może w pełni wyjaśnić, dlaczego pacjenci z porównywalną ciężkością stanu neurologicznego i podobnym narażeniem na opiekę wykazują różne wyniki infekcji. Dlatego markery zapalne i czynniki immunogenetyczne mogą dostarczyć dodatkowych informacji o biologicznej podatności, szczególnie wcześnie po przyjęciu, kiedy podejmowane są decyzje dotyczące nadzoru zapobiegawczego i zarządzania układem oddechowym.

Cytokiny są centralnymi mediatorami odpowiedzi immunologicznych i zapalnych, a szlaki receptorów Toll-podobnych (TLR) odgrywają kluczowe role w rozpoznawaniu patogenów i aktywacji odporności wrodzonej. Oznaczenia cytokin w surowicy i białek TLR mogą dostarczyć przekroju wczesnej aktywacji zapalnej układu odpornościowego, podczas gdy wybrane polimorfizmy genów odpornościowych mogą odzwierciedlać bardziej stabilne różnice gospodarza w produkcji cytokin, sygnalizacji receptorowej lub regulacji zapalnej. W porównaniu z samoocenę kliniczną, połączona praca biomarkerów i polimorfizmów może uchwycić zarówno bieżący stan zapalny, jak i układ odpornościowy każdego pacjenta. Takie podejście nie ma na celu zastąpienia oceny klinicznej w łóżku, ale uzupełnić ją o informacje laboratoryjne i genetyczne gospodarza, które mogą pomóc w zidentyfikowaniu pacjentów, którzy wymagają ściślejszego nadzoru infekcji po spontanicznej ICH.

Na tej podstawie postawiliśmy hipotezę, że pacjenci z spontaniczną ICH, którzy rozwiną infekcję płuc nosokomialną, wykażą odrębny profil zapalny wraz z inną dystrybucją wybranych polimorfizmów genetycznych związanych z odpornością w porównaniu z pacjentami, którzy pozostają wolni od infekcji. Aby przetestować tę hipotezę, niniejsze retrospektywne badanie klinicz

Protokół

To badania zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szpitala Afiliatowanego Uniwersytetu Jiaxing, Pierwszego Szpitala w Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, Chiny (Numer zgody 2025-LP-599). Wszystkie procedury z udziałem ludzkich uczestników przeprowadzano zgodnie z wymogami instytucjonalnymi oraz zasadami Deklaracji Helsińskiej. Pisemną informowaną zgodę na pobór krwi i wykorzystanie danych uzyskało się od wszystkich uczestników i/lub ich upoważnionych przedstawicieli przed poborem próbek.

Wszystkie komercyjne zestawy, odczynniki, materiały eksploatacyjne, instrumenty, oprogramowanie, producenci, numery katalogowe i kluczowe specyfikacje operacyjne użyte w tym przepływie pracy są wymienione w Tabeli Materiałów.

Zakres badania, kwalifikowanie i grupowanie pacjentów

Badanie to przeprowadzono jako jednocentowa retrospektywna analiza kliniczna i laboratoryjna wśród pacjentów z pierwotnym samoistnym krwotokiem do mózgu (ICH) przyjętych do Centrum Ratunkowo-Krytycznego lub Oddziału Intensywnej Terapii Szpitala Afiliatowanego Uniwersytetu Jiaxing, Pierwszego Szpitala w Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, Chiny, w okresie od maja 2019 do września 2024. Rozpoznanie ICH potwierdzono za pomocą tomografii komputerowej czaszki lub rezonansiu magnetycznego zgodnie z Chińskimi Wytycznymi Diagnostyki i leczenia krwotoków mózgowych (2019)¹⁰.

Do badania kwalifikowali się pacjenci z potwierdzonym obrazowym pierwotnym samoistnym ICH, przyjęci w ciągu 3 dni od wystąpienia objawów i mający kompletne kluczowe zmienne kliniczne, a także dostępne próbki krwi obwodowej do pomiaru biomarkerów zapalnych i analizy genetycznej. Pacjentów wykluczono, jeśli mieli krwotok śródczaszkowy z urazu, wtórne ICH, infekcję płuc przed przyjęciem lub w ciągu 48 godzin po przyjęciu, opuszczenie szpitala wbrew zaleceniu lekarza lub zgony w ciągu 48 godzin po przyjęciu, historię nowotworu lub choroby autoimmunologicznej lub niekompletne kluczowe zapisy kliniczne, laboratoryjne lub genotypowe. Po przeszukaniu 360 pacjentów spełniło kryteria kwalifikacyjne i zostało włączonych do ostatecznej analizy. Wśród nich 180 pacjentów rozwinęło infekcję płuc w trakcie hospitalizacji, a 180 pacjentów nie. Pacjentów przydzielono do grupy z infekcją płuc lub bez infekcji płuc na podstawie wystąpienia infekcji płuc w szpitalu po przyjęciu.

Przed ostatecznym grupowaniem sprawdzono diagnozę obrazową, czas przyjęcia, czas wystąpienia infekcji, dostępność próbek krwi oraz kompletność zapisów klinicznych i laboratoryjnych. Krok ten służył zmniejszeniu błędnego grupowania i upewnieniu się, że wszystkie zawarte przypadki miały kompletne dane do porównania klinicznego, pomiaru biomarkerów zapalnych i genotypowania.

Definicja infekcji płuc w szpitalu

Infekcję płuc w szpitalu definiowano na podstawie radiologicznych dowodów w połączeniu z kryteriami klinicznymi¹¹. Potwierdzenie radiologiczne wymagało nowego lub progresywnego przecieku, konsolidacji lub cienia typu szklanego szlachetnego na zdjęciu rentgenowskim klatki piersiowej lub tomografii komputerowej. Ponadto musiało wystąpić co najmniej dwa z następujących kryteriów: temperatura ciała > 38 °C, ropne wydzieliny z dróg oddechowych lub nieprawidłowa liczba białych krwinek w krwi obwodowej z WBC < 4 × 10⁹/L lub > 10 × 10⁹/L.

Infekcja płuc obecna przed przyjęciem lub zdiagnozowana w ciągu pierwszych 48 godzin po przyjęciu nie była klasyfikowana jako infekcja płuc w szpitalu. Klasyfikację infekcji weryfikowano za pomocą raportów radiologicznych, zapisów temperatury ciała, dokumentacji wydzielin z dróg oddechowych, wyników liczenia krwi obwodowej i zapisów diagnostycznych.

Bezpieczeństwo biologiczne i utylizacja odpadów

Krwią ludzką, surowicą i pochodnymi DNA krwi manipulowano z zachowaniem standardowych środków ostrożności na poziomie 2 bezpieczeństwa biologicznego. Personel laboratoryjny nosił rękawiczki, szlafroki laboratoryjne, maseczki i ochronę oczu podczas manipulacji krwią, pobierania alikwotów surowicy, testów ELISA, ekstrakcji DNA, przygotowania PCR, elektroforezy w żelu, restrykcji i wizualizowania UV.

Próbki krwi były sprawdzane na przedmioty wycieku lub pęknięcia przed przetworzeniem. Wirowanie przeprowadzano w zakorkowanej ampułce lub, jeśli było to możliwe, w zamkniętym wiadrze do wirowania.

Ostre narzędzia były wyrzucane natychmiast do zatwierdzonych pojemników na ostre odpady. Rury pobrane z krwią, końcówki pipet, rękawiczki, płytki ELISA i inne jednorazowe materiały eksploatacyjne były wyrzucane jako odpady biologiczne. Płynne odpady biologiczne były dezynfekowane zgodnie z procedurą instytucjonalną przed wyrzuceniem. Żele agarozowe, żele poliakryloamidowe, odczynniki barwiące i materiały związane z elektroforezą były wyrzucane zgodnie z instytucjonalnymi wymaganiami dotyczącymi odpadów chemicznych i laboratoryjnych.

Przygotowanie reagent

Wyniki

Wskaźniki kliniczne

Podstawowe cechy kliniczne są opisane w Tabeli 1. W analizie końcowej uwzględniono łącznie 360 pacjentów z spontanicznym krwotokiem śródmózgowym, w tym 180 pacjentów, u których rozwinęło się nozokomialne zakażenie płuc podczas hospitalizacji i 180 pacjentów, u których nie wystąpiło. Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami w zakresie wieku (62,4 roku ± 6,8 roku vs 63,6 roku ± 7,0 roku, P > 0,05), płci (142/180, 78,9% vs 137/...

Dyskusja

Mistna krwotok domózgowa (ICH) pozostaje jednym z najcięższych podtypów udaru mózgu i nadal powoduje znaczną wczesną śmiertelność i obciążenia związane z długotrwałą niepełnosprawnością¹³. W praktyce klinicznej pacjenci z ICH są szczególnie narażeni na powikłania szpitalne, ponieważ uraz neurologiczny może osłabić ochronę dróg oddechowych, zmniejszyć skuteczność kaszlu, ograniczyć ruchliwość i zwiększyć narażenie na inwazyjne procedury wsparcia. Wśród tych powikłań, infekcja płuc nosokomialna jest...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Human TNF-α ELISA Kit	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	KHC3011	Zestaw ELISA do ilościowego pomiaru ludzkiego TNF-α w surowicy.
Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit	Sigma-Aldrich / Merck	RAB0744-1KT	96-dołkowy zestaw ELISA do pomiaru ludzkiego TLR2 w próbkach surowicy lub osocza.
Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP3-11807	Kolorymetryczny zestaw ELISA typu sandwich do pomiaru ludzkiego TLR4 w surowicy, osoczu lub innych płynach biologicznych.
Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric	Novus Biologicals / Bio-Techne	NBP2-76574	Kolorymetryczny zestaw ELISA do pomiaru ludzkiego TLR9 w próbkach surowicy.
Absorbance microplate reader	Agilent BioTek	800 TS	Czytnik mikroplatek do pomiaru gęstości optycznej w 450 nm z korekcją referencyjną w 570 nm.
QIAamp DNA Blood Mini Kit	QIAGEN	51104	Zestaw na bazie membrany krzemionkowej do ekstrakcji DNA genomowego z przeciwzakrzepowej pełnej krwi.
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Mikrowolumenowy spektrofotometr UV-Vis do oceny stężenia DNA i czystości A260/A280.
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	A24811	Cykler termiczny używany do amplifikacji końcowej PCR w genotypizacji PCR-RFLP.
PCR Master Mix, 2X	Thermo Scientific	K0171	Gotowy miks reakcji PCR zawierający Taq DNA polimerazę, dNTPs, MgCl2 oraz bufor reakcji; stosowany do konwencjonalnej amplifikacji PCR.
Recombinant Taq DNA Polymerase	Thermo Scientific	EP0401	Alternatywne źródło enzymów do reakcji PCR z lokusa specyficznymi, gdy oddzielne składniki PCR są używane zamiast 2X miksu.
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581	Woda o stopniu czystości do biologii molekularnej używana do przygotowania PCR, rozcieńczania DNA i kontroli bez szablonu.
Custom DNA primers	Sangon Biotech	Custom synthesis	Lokusa specyficzne primery do genotypizacji PCR-RFLP; sekwencje primerów są wymienione w Tabeli Suplementowej S1.
Restriction endonucleases for PCR-RFLP	Thermo Scientific / New England Biolabs	Locus-specific enzymes listed in Supplementary Table S1	Enzymy restrykcyjne stosowane do genotypu specyficznej hydrolizy produktów PCR. Wybrany enzym dla każdego lokusa powinien odpowiadać wzorowi hydrolizy wymienionym w Tabeli Suplementowej S1.
Agarose I, molecular biology grade	Thermo Scientific	17850	Agaroza do przygotowania żeli 1,5% i 2,5% stosowanych do potwierdzenia produktów PCR i rozdzielania większości fragmentów RFLP.
GeneRuler 50 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0371	Marker rozmiarów DNA do estymacji rozmiarów amplikonów PCR i fragmentów RFLP.
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	S33102	Barwnik do żeli kwasów nukleinowych do wizualizowania DNA w żelach agarozowych lub akrylamidowych; stosowany jako alternatywa o mniejszym ryzyku dla bromku etydyny.
Horizontal agarose gel electrophoresis system	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base	System elektroforetyczny do separacji żelowej agarozą produktów PCR i RFLP.
Vertical PAGE electrophoresis system	Bio-Rad	Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001	Wertykalny system elektroforetyczny do separacji żelowej poliakryloamidu 8% gdy wymagana jest wyższa rozdzielczość fragmentów.
Gel documentation system with UV or blue-light transillumination	Bio-Rad / equivalent laboratory system	Gel Doc XR+ or equivalent	System do dokumentacji obrzynanych pasm DNA po elektroforezie żelowej. Użyj osłony UV lub trybu światła niebieskiego, jeśli jest dostępny.
Refrigerated centrifuge	Eppendorf / equivalent laboratory centrifuge	5424 R or equivalent	Chłodzona wirówka stosowana do separacji surowicy przy 1500 × g i 4 °C.
−80 °C ultra-low temperature freezer	Thermo Scientific / equivalent laboratory freezer	Forma 900 Series or equivalent	Przechowywanie alikwotów surowicy przed analizą ELISA.
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 25.0	Oprogramowanie statystyczne stosowane do analizy statystycznej opisowej, testowania normalności, porównywania grup, regresji logistycznej i eksportu wyników modelu.
Spreadsheet software	Microsoft	Excel for Microsoft 365	Stosowany do sprawdzania danych, organizacji mapy płytek, przeglądu wartości powtórzeń i przygotowania plików do analizy w SPSS.