Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Perfuzja mikronaczyniowa monitorowana za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym podczas uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji u myszy

342 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70762

⸱

27 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Do monitorowania zmian przepływu krwi mikronaczyniowej nerki podczas jednostronnej niedokrwienności nerki po resekcji prawej nerki u myszy zastosowano laserowy system obrazowania z kontrastem plamkowym (plamkowatym).

Streszczenie

Laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI) to nieinwazyjna technika pomiaru powierzchownego przeciekania krwi na dużych obszarach. Dzięki wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej, LSCI częściowo ilościowo określa niejednorodne zmiany przepływu krwi w różnych obszarach w obrębie obrazowanego obszaru. Tutaj demonstrujemy technikę LSCI rejestrującą przepływ krwi podczas jednostronnego uszkodzenia niedokrwiennego nerki i reperfuzji (IRI) u myszy. Po prawej nefrektomii pozycja myszy oraz punkt ogniska obiektywu systemu LSCI zostały dostosowane, aby zapewnić pole widzenia lewej nerki. Badania LSCI wykonywano przed, w trakcie i po niedokrwieniu nerek. Ponadto, wybierając obszary zainteresowania (ROI), jednocześnie monitorowano przepływ krwi w tych obszarach. Metoda LSCI wizualizuje mikronaczyniową perfuzję nerki i umożliwia mapowanie przepływu krwi w czasie rzeczywistym. Może być wykorzystywany do monitorowania przepływu krwi mikronaczyniowej oraz oceny wpływu interwencji na kinetykę reperfuzji i jednorodność przestrzenną podczas IRI nerek myszy lub innych podobnych modeli zwierzęcych.

Wprowadzenie

Uszkodzenie niedokrwieniowo-reperfuzyjne (IRI) jest jedną z głównych przyczyn ostrego uszkodzenia nerek (AKI), które wiąże się z wysoką zachorowalnością i wysoką śmiertelnością u pacjentów 1,2. Zmiana hemodynamiki nerek jest jednym z kluczowych czynników wywołanego przez podpołnoc wywołanego AKI1. Dysfunkcja mikrokrążenia wywołana przez IR jest główną przyczyną powstawania urazów, prowadzących do niedotlenienia i dysfunkcji mitochondrialnych komórek 3,4. Dlatego monitorowanie zmian przepływu krwi w czasie rzeczywistym jest skuteczną metodą zapewnienia skutecznej niedokrwienia lub reperfuzji nerki oraz oceny stopnia IRI w modelach zwierzęcych dla tego zaburzenia.

Istnieje wiele technik pomiaru mikronaczyniowej perfuzji tkanek, w tym laserowa flowmetria Dopplera (LDF)5, obrazowanie autofluorescencji nikotynamido-adeninin-dehydrogenazy (NADH) 6,7,8, obrazowanie w podczerwieni9 oraz angiografia indocyjaninowo-zielona (ICG)10. Wśród nich obrazowanie w podczerwieni i autofluorescencja NADH pośrednio mierzą perfuzję mikronaczyniową. LDF, wykorzystując sondę optyczną, monitoruje jedynie przepływ krwi regionalnej5, a skanowanie LDF nie jest wystarczająco szybkie, aby monitorować zmiany w czasie rzeczywistym mikronaczyniowej perfuzji tkanek w warunkach I/R11. Angiografia ICG może również zidentyfikować naczynia zablokowane nerką10, ale wymaga podania środka kontrastowego, co ogranicza jego użycie do ograniczonej liczby pomiarów12. Laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI) to wydajna, nieinwazyjna metoda monitorowania mikroperfuzji nerek w czasie rzeczywistym13. Był wykorzystywany do generowania przestrzennie rozdzielonych informacji związanych z dynamiką przepływu krwi. Gdy spójna wiązka jest oświetlana na chropowatą powierzchnię, odbite lub rozproszone fale świetlne interferują ze sobą z powodu drobnych różnic ścieżek, tworząc losowy rozkład jasnych i ciemnych wzorów plam, zwany "plamką". LSCI mapuje prędkość przepływu krwi w tkankach powierzchownych, analizując stopień rozmycia "dynamicznej plamki" powstającej, gdy światło laserowe napromieniuje tkankę 12,14,15. W tym badaniu system LSCI pracował z długością fali laserowej 785 nm z rozdzielczością przestrzenną 3 μm, polem widzenia regulowanym między 6,3 mm × 4,7 mm oraz 42 mm × 31 mm oraz prędkością obrazowania do 120 klatek na sekundę, umożliwiającą wysokorozdzielcze, w czasie rzeczywistym mapowanie mikronaczyniowej perfuzji korowej. W świetle tych zalet LSCI było stosowane w różnych kontekstach eksperymentalnych i klinicznych do monitorowania przepływu krwi, w tym rany oparzeń16, perfuzja siatkówki17, przepływ krwimózgowej 18, przełyk19 oraz jelita20.

Należy zauważyć, że LSCI głównie ocenia perfuzję w tkance powierzchownej, dostarcza wartości przepływu względnego, a nie bezwzględnego, i może być kształtowana przez właściwości optyczne tkanek oraz artefakty ruchu. Te cechy wewnętrzne są brane pod uwagę podczas interpretacji danych obrazowych.

Prace te, wykorzystujące model obejmujący prawą nefrektomię ułatwiającą ekspozycję i obrazowanie nerki przeciwległej, monitorowały zmiany w perfuzji mikronaczyniowej przed, w trakcie i po niedokrwieniu w jednostronnym modelu nerki I/R mysza za pomocą LSCI oraz wykazały przestrzenną heterogeniczność przepływu krwi na powierzchni nerki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zwierzęce były zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Shantou. Aby wyeliminować różnice w efektach IRI wynikające ze względu na płeć i szczep, w badaniu wykorzystano wyłącznie samce myszy C57BL/6N. Wszystkie myszy były dopasowane pod względem wieku i wagi, aby uzyskać porównywalne rezultaty. Użyto próby n = 5, zgodnie z wcześniejszymi badaniami metodologicznymi wykorzystującymi LSCI do walidacji technicznej21. Zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę i zostały uśpione po eksperymentach poprzez wdychanieCO2 . Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

Przed rozpoczęciem zabiegu włącz system laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym. System użyty w tym badaniu działa z laserem o średnicy 785 nm. Ustaw odległość roboczą na około 15-20 cm nad polem operacyjnym. System oblicza przepływ krwi w jednostkach perfuzji laserowej (LSPU) na podstawie algorytmu kontrastu przestrzennego. Upewnij się, że instrument jest rozgrzany i stabilny przed dalszą jazdą.

1. Przygotowanie zwierząt i laparotomia

  1. Przed każdym zabiegiem sterylizuj stół operacyjny. Przygotuj i umieść na stole chirurgicznym wszystkie niezbędne materiały (sterylizowane narzędzia i patyczki kosmetyczne, gazę, wstępnie rozcieńczone środki znieczulające, poduszkę grzewczą, zacisk naczyniowy, roztwór solny fizjologiczny, krem depilacyjny, waciki, szwy, środki antyseptyczne i szwy).
  2. Podaj myszy meloksykam (0,2 mg/kg masy ciała; zastrzyk podskórny) 30 minut przed podłożem, aby złagodzić ból.
  3. Wlej odpowiednią ilość sterylizowanej soli fizjologicznej do czystego pojemnika. Następnie weź kawałek gazy i wytnij odpowiednie otwór pośrodku.
  4. Znieczulenie myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 2,5% trybrometanolu (400 mg/kg masy ciała; wcześniej rozcieńczone w sterylnej soli fizjologicznej).
    UWAGA: Tribrometanol był stosowany jako środek znieczulający podczas procesu prawej nefrektomii. A 1% izofluranu stosowano do znieczulenia podczas długotrwałych zabiegów monitorowania przepływu krwi.
  5. Połóż mysz na termoforze taśmą i użyj kremu depilacyjnego, aby usunąć włosy z okolic odwłoka myszy. Podczas operacji używaj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę odbytu na poziomie 37 °C ± 0,5 °C.
  6. Najpierw dezynfekuj skórę w okolicy operacyjnej 75% alkoholem, a następnie jodoforem za pomocą patyczka kosmetycznego.
  7. Użyj kleszczy, żeby uszczypnąć palec myszy. Gdy mysz nie wykazuje reakcji bólowej, wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha nożyczkami. Delikatnie oddziel skórę od otrzewnej, następnie rozetnij otrzewną i wejdź do jamy brzusznej.
  8. Przyłóż retraktor do myszy, aby zoptymalizować widoczność, i przykryj pole operacyjne gazą, jednocześnie wyrównując szczelinę na gazie z jamą brzuszną i zwilż ją solą fizjologiczną.

2. Prawy nefrektomia

  1. Użyj patyczka watowego, aby delikatnie przesunąć jelito na jedną stronę gazy, odsłaniając prawą nerkę i otaczające tkanki. Złóż gazę, aby zakryć jelito i zwilż je zwykłą solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu jelita.
  2. Użyj kleszczy pod kątem, aby unieść prawy moczowodu. Przeprowadź dwie nici szwów 6-0 przez moczowód i wykonaj ligację w dwóch pozycjach.
  3. Przeciąć moczowód między dwoma ligaturami za pomocą mikronożyczek.
  4. Po zwilżeniu wacików zwykłą solą fizjologiczną, użyj cienkich kleszczy, aby podnieść waciki, delikatnie popchnąć wątrobę do góry i mocować ją wacikami, aby odsłonić nerki i naczynia krwionośne po ich prawej stronie.
  5. Użyj ukośnych kleszczy, aby tępo oddzielić tłuszczowe poduszki krocze wzdłuż boku prawej nerki, aż tętnica nerkowa i żyła będą całkowicie odsłonięte.
    UWAGA: Jednocześnie oddziel masę tkanki nadnerczowej znajdującą się nad nerką.
  6. Ostrożnie wsuń kleszcze pod kątem pod tętnicę nerkową i żyłę, aby stworzyć kanał. Następnie przełóż wokół naczyń jedwabny szw 6-0, aby je związać.
  7. Przetnij zatkaną tętnicę nerkową i żyłę blisko nerki. Usuń nerkę wraz z pozostałą przyczepioną tkanką.
  8. Usuń wacik używany do trzymania wątroby.

3. Monitorowanie przepływu krwi nerek za pomocą laserowego obrazowania kontrastowego (LSCI) podczas niedokrwienia i reperfuzji

  1. Włącz system LSCI oraz dedykowane oprogramowanie instrumentu.
  2. Kliknij na Oryginalny obraz i Podgląd, aby zobaczyć surowy, nieprzetworzony obraz pola operacyjnego.
  3. Zmień pozycję myszy, utrzymuj znieczulenie przy użyciu 1% izofluranu podawanego z prędkością 600 mL/min przez stożek nosowy oraz reguluj powiększenie aparatu podczas obserwacji oryginalnego obrazu, aby uzyskać wyraźny widok docelowej nerki.
  4. Kliknij na Jednoczesny wyświetlacz , aby zobaczyć obraz przepływu krwi w czasie rzeczywistym. Ustaw powiększenie na 2,5× i wybierz Automatyczną Regulację Przepływu Krwi, aby zoptymalizować obraz. Następnie zablokuj parametry przepływu krwi. Poza tym, ustawione tak, by nagrywać jedną klatkę obrazu co 5000 ms.
    UWAGA: Mokre waciki mogą być użyte, aby zapewnić stabilną pozycję nerki i zapobiec oddzielaniu się od niej okolicznych narządów i tkanek, co wzmacnia rozróżnienie między obszarem nerek a tłem.
  5. Ustaw rozmiar parametrów kwadratowych obszarów na 112 i ułóż 5 kwadratowych obszarów równomiernie w stałej orientacji w widoku nerki. Kliknij na Rejestrację i Rejestrowanie Obrazów w czasie rzeczywistym, aby rozpocząć rejestrowanie danych o przepływie krwi.
    UWAGA: Urządzenie automatycznie rejestruje laserowe jednostki perfuzji plamkowej (LSPU), które reprezentują jednostki przepływu krwi w czasie rzeczywistym w ROI i mogą być wykorzystywane do analiz. Podczas procesu wykrywania ruch związany z oddychaniem lub zmiany środowiska mogą powodować przesunięcie pola widzenia. Jeśli system wykryje to w obszarze detekcji, bieżące nagranie powinno zostać przerwane. Następnie kliknij Rejestracja obrazu w czasie rzeczywistym i nagrywaj ponownie.
  6. Po uzyskaniu 30-minutowego poziomu wyjściowego rozdziel tkankę tłuszczową otaczającą naczynia nerkowe po lewej stronie. Użyj kleszczy hemostatycznych, aby chwycić mikroklamrę i umieścić ją na lewej tętnicy nerkowej i żyłie w pobliżu hilum. Kontynuuj monitorowanie w czasie rzeczywistym przez kolejne 30 minut.
  7. Zwolnij mikro-klamrę, aby rozpocząć reperfuzję. Monitoruj i rejestruj w czasie rzeczywistym odbudowę przepływu krwi w mikronaczyniach nerkowych.
  8. Po monitorowaniu przepływu krwi przez co najmniej 60 minut przerwij monitorowanie i zszyj nacięcie brzucha szwem 7-0 z jedwabnym warkotem.

4. Pooperacyjna rehabilitacja i opieka

  1. Podawaj płyny z intraarteritonealnym zastrzykiem 1 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu po operacji.
  2. Trzymaj myszy na podkładce grzewczej. Uważnie obserwuj myszy, aż odzyskają przytomność, będą wyglądać na czujne i będą w stanie się wyprostować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem tego artykułu było wykrycie zmian w przepływie krwi nerkowej podczas AKI wywołanego podczerwienią. Dlatego zastosowaliśmy wspólny model myszy, który obejmuje prawą nefrektomię (rysunek 1A), a następnie procedurę IR na nerce przeciwległej (rysunek 1B). Ponieważ wymagane było monitorowanie przepływu krwi w czasie rzeczywistym podczas IRI, wszystkie manipulacje na myszach wykonywano w rejonie instrumentu przez cały czas trwania (rysunek 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Praca ta opisuje zastosowanie systemu LSCI do wizualizacji w czasie rzeczywistym dynamiki mikronaczyniowego przepływu krwi w nerkach podczas IRI u myszy. Protokół ten oferuje znaczącą przewagę nad tradycyjnymi pomiarami końcowymi lub metodami o ograniczonej rozdzielczości przestrzennej, takimi jak LDF, oferując dwuwymiarową mapę perfuzji rejestrującą regionalną heterogeniczność w mikrocyrkulacji nerki. Efektywność i użyteczność LSCI do monitorowania w czasie rzeczywistym wewnątrzoperacyjnym to kluczowe zalety tej metody....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te zostały sfinansowane przez Program Badawczy Innowacyjnych Zespołów dla Uniwersytetów Prowincji Guangdong (2022KCXTD009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kanister absorbujący (do znieczulenia)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, Chiny10-0210
Alkohol, medyczny (75%)HENGLIYA, Xinjiang, ChinyNie maŚrodek dezynfekuujący skórę
Paporyzator znieczulającyŚrodekhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
Patyki watoweQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Chinyhttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
Krem do depilacjiVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
Opaska gazowaWinner Medical Co., Ltd, Shenzhen, Chinyhttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
Poduszka grzewczaRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, ChinyHD-1902Do utrzymania temperatury ciała
Rozwiązanie jodoforoweTaixinkang, Jinxian, Chinyhttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmŚrodek antyseptyczny do skóry
IzofluranRWD Life Science Co., Ltd, ChinyR510-22-10Znieczulenie wziewne
System laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym (LSCI)Hubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, ChinySIM BFI HR PROSystem równoważny MoorFLPI-2
MeloksykamQilu Animal Health Products Co., Ltd, Chinyhttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 mg na kg masy ciała; Środek przeciwbólowy
Mikro-zaciskShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd, ChinyW40140Zacisk naczyniowy
Sól fizjologiczna (0,9% chlorku sodu)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Chinyhttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Szycie z jedwabnym plecionem (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Chinyhttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlDla ligacji naczyń
Szycie z jedwabnym plecionem (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Chinyhttps://www.weigaoholding.com/Do zamknięcia ran stosuje się niechłanne szwy chirurgiczne za pomocą zakrzywionej igły
Strzykawka (1 mL)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Chinyhttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlZ igłą 26 G
TribrometanolSigma-AldrichT48402-100GRoztwór 2,5%; Znieczulenie do zastrzyków

Bibliografia

  1. Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. Renal ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg. 83 (2), 162-170 (1996).
  2. Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. Acute renal failure: Definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. J Clin Invest. 114 (1), 5-14 (2004).
  3. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  4. Legrand, M., Mik, E. G., Johannes, T., Payen, D., Ince, C. Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Mol Med. 14 (7-8), 502-516 (2008).
  5. Zhu, X., et al. Ischemic preconditioning prevents in vivo hyperoxygenation in postischemic myocardium with preservation of mitochondrial oxygen consumption. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1442-H1450 (2007).
  6. Coremans, J. M. C. C., et al. Pretransplantation assessment of renal viability with NADH fluorimetry. Kidney Int. 57 (2), 671-683 (2000).
  7. Fitzgerald, J. T., Demos, S., Michalopoulou, A., Pierce, J. L., Troppmann, C. Assessment of renal ischemia by optical spectroscopy. J Surg Res. 122 (1), 21-28 (2004).
  8. Raman, R. N., Pivetti, C. D., Matthews, D. L., Troppmann, C., Demos, S. G. A non-contact method and instrumentation to monitor renal ischemia and reperfusion with optical spectroscopy. Opt Express. 17 (2), 894(2009).
  9. Gorbach, A. M., et al. Assessment of critical renal ischemia with real-time infrared imaging. J Surg Res. 149 (2), 310-318 (2008).
  10. Ietto, G., et al. Indocyanine green angiography for quality assessment of the kidney during transplantation: An outcome predictor prospective study. Transplant Proc. 53 (6), 1892-1896 (2021).
  11. Bezemer, R., et al. Real-time assessment of renal cortical microvascular perfusion heterogeneities using near-infrared laser speckle imaging. Opt Express. 18 (14), 15054(2010).
  12. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Ann Biomed Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
  13. Heeman, W., et al. Real-time visualization of renal microperfusion using laser speckle contrast imaging. J Biomed Opt. 26 (05), 056004(2021).
  14. Briers, J. D. Laser speckle contrast analysis (LASCA): A nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow. J Biomed Opt. 1 (2), 174(1996).
  15. Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2010).
  16. Stewart, C. J., et al. A comparison of two laser-based methods for determination of burn scar perfusion: Laser Doppler versus laser speckle imaging. Burns. 31 (6), 744-752 (2005).
  17. Tamaki, Y., Araie, M., Kawamoto, E., Eguchi, S., Fujii, H. Noncontact, two-dimensional measurement of retinal microcirculation using laser speckle phenomenon. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (11), 3825-3834 (1994).
  18. Kazmi, S. S., Richards, L. M., Schrandt, C. J., Davis, M. A., Dunn, A. K. Expanding applications, accuracy, and interpretation of laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (7), 1076-1084 (2015).
  19. Ambrus, R., et al. Evaluation of gastric microcirculation by laser speckle contrast imaging during esophagectomy. J Am Coll Surg. 225 (3), 395-402 (2017).
  20. Knudsen, K., et al. Laser speckle contrast imaging to evaluate bowel lesions in neonates with NEC. Eur J Pediatr Surg Rep. 5 (1), e43-e46 (2017).
  21. Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neurosci. 23 (1), 80(2022).
  22. Hren, R., Brezar, S. K., Marhl, U., Sersa, G. Laser speckle contrast imaging of perfusion in oncological clinical applications: A literature review. Radiol Oncol. 58 (3), 326-334 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie plam laserowychmonitorowanie przepływu krwinerka myszyobrazowanie w czasie rzeczywistymmikrokrażenie nerkowechirurgia zwierzęca
Perfuzja mikronaczyniowa monitorowana za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym podczas uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.