Platforma kultury kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Summary

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kości przy użyciu ludzkich osteocytów osadzanych w metakrylowanych hydrożelach żelatyny (GelMA) uzupełnionych decelularyzowaną macierzą pozakomórkową. Metoda ta jest niskobudżetowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Abstract

Modelowanie chorób układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak osteoporoza, wymaga in vitro platform, które dokładnie odtwarzają kluczowe cechy ludzkiej biologii kości. Konwencjonalne 3D systemy kulturowe dostarczają cennych informacji o interakcjach między komórkami i między komórkami a macierzą, ale ich zależność od kosztownych materiałów, biodrukarek lub wyspecjalizowanej infrastruktury ogranicza ich szersze zastosowanie. Tutaj opisujemy efektywny i nisko kosztowy protokół generowania 3D struktur kości za pomocą pochodzących od ludzi osteocytów osadzanych w żelach GelMA, uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową (dECM) uzyskaną z darowanych głów kości udowych. Ta metoda oparta na pipetowaniu umożliwia wytwarzanie powtarzalnych, przypominających kości struktur przy fizjologicznej temperaturze (37 °C), przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Powstałe struktury utrzymują wysoką żywotność i integralność strukturalną, wspierając zastosowania sekwencyjne takie jak obrazowanie immunofluorescencyjne i badania molekularne. Włączenie decelularyzowanej macierzy pozakomórkowej pochodzącej od pacjenta zwiększa trafność translacyjną, lepiej odbijaną w procesie remodelacji kości u ludzi i progresji choroby. To podejście zapewnia dostępną, skalowalną platformę do testowania leków, medycyny regeneracyjnej i badań mechanistycznych biologii kości. Ogólnie rzecz biorąc, protokół oferuje praktyczną alternatywę dla drogich technik biodruku i może być łatwo dostosowany do innych tkankowych źródeł dECM.

Introduction

Ta metoda ma na celu stworzenie opłacalnej i możliwej do powtórzenia platformy 3D kultury komórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego, w tym osteoporozy, poprzez połączenie GelMA z dECM pochodzącym z ludzkiego tkanki kostnej. Ta strategia umożliwia generowanie konstrukcji przypominających kości, które bardziej zbliżone są do fizjologicznego mikrośrodowiska niż konwencjonalne dwuwymiarowe kultury, wspierając badanie interakcji komórka-komórka i komórka-matryca w biologicznie istotnych warunkach¹. Zastosowanie osteocytów pochodzących od pacjenta i klinicznie uzyskanego dECM z głów kości udowych zwiększa wartość translacyjną i zapewnia praktyczne połączenie między eksperymentacją in vitro a potrzebami badań klinicznych².

Ta metoda została opracowana w celu przezwyciężenia kluczowych ograniczeń istniejących systemów 3D kultury i biofabrykacji, które często wymagają biodrukarek, własnościowych biomateriałów lub kosztownych materiałów eksploatacyjnych (np. Matrigel), ograniczając dostępność w wielu przypadkach^3,4. Ponadto syntetyczne żele często nie odtwarzają biochemicznej złożoności skomponowanej zewnątrzkomórkowej matrycy kostnej ani zachowania rezydujących osteocytów⁵. W przeciwieństwie do tego, protokół ten zawiera pochodzące z ludzkiej kości dECM, zachowując zawartość zmineralizowaną, białka rodzime i cząsteczki sygnałowe, przy jednoczesnym unikaniu wymagań infrastrukturalnych związanych z technologiami produkcji addytywnej⁶.

Kombinacja GelMA i dECM oferuje kilka zalet. GelMA wspomaga adhezję komórkową, żywotność i różnicowanie, i może być przetwarzany w 37 °C, umożliwiając kapsykulację komórek bez specjalistycznego sprzętu. Sieciowanie za pomocą tanich źródeł ultrafioletu (UV) (365 nm) dodatkowo zwiększa dostępność⁷. Suplementacja dECM wzbogaca konstrukcję o wskazówki specyficzne dla tkanki, które są nieobecne w syntetycznych substytutach, poprawiając kompatybilność osteogeniczną i ułatwiając dalsze badania, takie jak immunofluorescencja i profilowanie molekularne⁸.

Ta metoda jest zgodna z obecnymi wysiłkami na rzecz opracowania ludzkich modeli kości, które zmniejszają zależność od badań na zwierzętach, których dokładność translacyjna jest często ograniczona przez międzygatunkowe różnice^1,9,10. Protokół jest zgodny z zasadami 3R¹¹ i może być przystosowany do generowania konstrukcji przy użyciu innych tkankowych dECM, rozszerzając potencjalne zastosowania na inżynierię tkankową chrząstki, skóry i układu krążenia¹².

Ogólnie rzecz biorąc, ta technika zapewnia dostępną i skalowalną platformę do badania biologii kości w warunkach fizjologicznie istotnych. Jego kompatybilność z rutynową infrastrukturą laboratorium i zdolność do włączenia ludzkich próbek klinicznych sprawia, że jest szczególnie odpowiednia dla grup badawczych akademickich i szpitalnych. Metoda wspiera nie tylko platformę do dalszych badań procesów kościowych, ale również może być punktem wyjścia dla bardziej translacyjnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i spersonalizowanym rozwoju terapii.

Protocol

To studium zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Naukowych Usług Zdrowotnych w Concepcion Health Service. Tkanka kostna ludzka została pozyskana z głów kości udowych przekazanych przez pacjentów poddawanych zabiegowi wymiany stawu biodrowego w Szpitalu Traumatologicznym w Concepcion, Chile, po uzyskaniu pisemnej zgody na podstawie pisemnej informacji o udziale w badaniu. Próbki przechowywano w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Wszystkie procedury zgodne były z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi etycznego wykorzystania ludzkiej tkanki w badaniach. Wszystkie próbki ludzkiej tkanki kostnej zostały uzyskane z głów kości udowych przekazanych przez pacjentów w Szpitalu Traumatologicznym w Concepcion, Chile, po uzyskaniu pisemnej zgody i zatwierdzeniu przez Komitet Etyczny ds. Naukowych Usług Zdrowotnych w Concepcion Health Service. Wszystkie procedury zgodne są z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania tkanki ludzkiej.

1. Synteza GelMA

1. Rozpuść 10 g żelatyny typu A w 100 mL buforu fosforanowego (PBS, pH 7,5) w temperaturze 60 °C pod stałym mieszaniem.
2. Obniż temperaturę do 50 °C i dodaj 5 mL anhydrydu metakrylowego z szybkością 0.5 mL/min, delikatnie mieszając przez 1-3 godz.
3. Rozcieńcz mieszaninę reakcyjną 5-krotnie z PBS podgrzanym do 40 °C, aby zatrzymać reakcję.
4. Dializuj roztwór za pomocą membrany o przepuszczalności 12-14 kDa wobec 3-5 L wody destylowanej w temperaturze 40 °C przez 5-7 dni, codziennie wymieniając wodę.
   UWAGA: (Krytyczny krok) Upewnij się, że codziennie wymieniasz wodę, aby usunąć niezreagowany anhydryd metakrylowy.
5. Liofilizuj roztwór dializowany przez 24 h i przechowuj liofilizowany GelMA w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie hydrożelu GelMA

1. Przygotuj 10 mL porcji hydrożelu GelMA w stężeniu 5, 10 lub 15 w/v%.
2. Rozpuść 0.5, 1.0 lub 1.5 g liofilizowanego GelMA w 9.5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.
3. Ochłodź roztwór do 37 °C.
4. Dodaj 0.5 mL roztworu fotoinicjatora Irgacure 2959 (0.5 w/v% w czystym alkoholu etylowym).
5. Delikatnie wymieszaj i utrzymuj roztwór w temperaturze 37 °C do sterylizacji przez membranę z acetinianu celulozy o przepuszczalności 0.22 μm.

3. Decellularyzacja kości

1. Stopniowo rozmroź właściwie głowy kości udowych do 25 °C. Każdą głowę kości udowej przekrój na pół i następnie na mniejsze kawałki.
2. Zanurz kawałki w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 60 °C i dźwiękowo obróć przez 15 min (40 kHz, ciągłe).
3. Przepłucz próbki w 300 mL wody destylowanej podgrzanej do 60 °C, trząsąc z szybkością 200 rpm przez 5 min.
4. Wiruj przez 15 min w temperaturze 25 °C z prędkością 1850 x g. Powtórz kroki przepłukiwania i wirowania trzykrotnie.
5. Sterilizuj tkankę dźwiękowo (40 kHz, ciągłe) przez 10 min w temperaturze 60 °C w roztworze zawierającym 3% nadtlenku wodoru i 0.02% kwasu peroksyoctowego.
6. Przenieś tkankę do 300 mL 70% etanolu i dźwiękowo obróć przez 10 min w temperaturze 21 °C.
7. Przepłucz próbki dwukrotnie w 300 mL wody destylowanej, trząsąc z szybkością 200 rpm przez 10 min w temperaturze 60 °C, a następnie wiruj przez 15 min w temperaturze 25 °C z prędkością 1850 x g.
8. Najpierw wstępnie zamroź kości na -80 °C przez 4 h, a następnie liofilizuj decellularyzowaną kość przez 24 h w szeroko-podstawowej komorze, aby zapewnić równomierne wysuszenie i uniknąć nadmiernej wysokości próbki przy 0.05 mbar w temperaturze od -40 do -60 °C.
   UWAGA: (Krytyczny krok) Upewnij się, że wysokość próbki nie przekracza 2-3 cm wewnątrz pojemnika, aby zapobiec niekompletnej liofilizacji.

4. Przygotowanie mikrocząstek kostnych

1. Umieść decellularyzowane fragmenty kości w 250 mL kolbach Erlenmeyera w roztworze sterylizującym i homogenizuj za pomocą homogenizatora do uzyskania jednolitego białego roztworu (Dodatkowo Wideo 1).
2. Wiruj przez 15 min w temperaturze 25 °C z prędkością 1850 x g, odrzuć nadstan, a następnie przepłucz pellet dwa razy z 300 mL wody destylowanej w temperaturze 25 °C, trząsąc z szybkością 200 rpm przez 10 min. Wykonaj ostateczne wirowanie z prędkością 1850 x g przez 15 min w temperaturze 25 °C.
3. Liofilizuj (0.05 mbar w temperaturze od -40 do -60 °C) powstały materiał przez 48 h i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu uży

Results

Pierwotne osteocyty zostały pomyślnie wyizolowane z ludzkich głów kości udowych i były wykrywalne w kulturze około 5 dni po wydobyciu. Komórki wykazywały gwiaździstą morfologię i tworzyły połączone sieci charakterystyczne dla morfologii osteocytów, co potwierdzało pomyślne wydzielenie, przyczepianie i żywotność (Rysunek 5).

Discussion

Przedstawiony protokół oferuje dostępną i translacyjną metodę generowania 3D konstrukcji przypominających kości, radzącą sobie z kluczowymi ograniczeniami obecnych podejść, takimi jak zależność od drogich biodrukarów lub własnościowych matryc¹³. Łącząc GelMA z ludzką decelularyzowaną macierzą pozakomórkową kości⁸, fizjologicznie istotne konstrukty mogą być wytwarzane wyłącznie przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Ta prostota umożliwia stosowanie w środowiskach...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)	Sigma-Aldrich	410896-10G	Hydrogel polymerization photoinitiator
AlamarBlue cell viability reagent	Invitrogen	DAL1100	For quantitative viability assay
Antibiotic-Antymycotic (100´)	Gibco	15240-062	Culture medium component
Cell culture flask (T75)	SPL Life Sciences	70075	For osteocyte culture
Collagenase Type 1	Gibco	17100-017	For enzymatic digestion of bone samples
Conical tube, 15 mL	SPL Life Sciences	50015	For Hydrogel preparation
DarkDawn D15-365 nm	DarkDawn	-	For UV Crosslinking of hydrogel
DPBS, powder, no calcium, no magnesium	gibco	21600069	Hydrogel solvent, LIVE/DEAD kit solvent
EDTA Disodium Salt 2-HID	Winkler	ED-0760	For enzymatic digestion of bone samples
Eppendorf centrifuge 5702	Eppendorf	5702000010	For bone microparticle preparation
Ethanol absolute for analysis	Supelco	1,00,98,32,511	For bone descellularization (diluted to 70%), photoinitiator solvent
Fetal bovine serum	Gibco	A52567-01	Culture medium component
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-500G	Hydrogel component
HBSS (10´)	Gibco	14185-052	For washing of bone marrow samples
L-Ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Culture medium component
LIVE/DEAD viability/cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	For qualitative viability/cytotoxicity assay
MEM Alpha (1´)	Gibco	12571-063	Culture medium component
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276685-500G	Hydrogel component
Micro centrifuge tube	Citotest	4610-1844	For preparation of alamarBlue and LIVE/DEAD dyes
NuncIon delta surface	Thermoscientific	150628	12 well plate for seeding of samples
OLYMPUS BX43 fluorescence light source Olympus U- LH100HG	Evident	U- LH100HG	Fluorescence analysis light source
RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	For bone descellularization and bone microparticle preparation
Synergy HTX multi mode reader	BioTek Instruments	-	Spectrophotometer
Syringe with needle	NIPRO	SY3-WN-R-03	For Hydrogel filtering
Tissue culture plate 96 well	Jet Biofil	TCP001096	96 well for alamarBlue viability assay.
Ultrasonic cleaner	VWE	97043-958	For sonication of bone samples