Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

209 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70782

⸱

23 czerwca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de Odontología, Universidad San Sebastián, 2Laboratorio de Biotecnología y Biofarmacia, Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, 3Hospital Traumatológico de Concepción, Servicio Salud Concepción

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Streszczenie

Modelowanie chorób układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak osteoporoza, wymaga in vitro platform, które dokładnie odtwarzają kluczowe cechy ludzkiej biologii kości. Konwencjonalne systemy 3D kultury dostarczają cenny wgląd w interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, ale ich zależność od kosztownych materiałów, biodrukarki lub specjalistycznej infrastruktury ogranicza ich szersze przyjęcie. Opisujemy tutaj wytrzymały i niskobudżetowy protokół generowania 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem pochodzących od ludzi osteocytów osadzanych w hydrożelach GelMA, uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową (dECM) uzyskaną z podarowanych głów kości udowej. Ta metoda oparta na pipetowaniu umożliwia produkcję powtarzalnych, przypominających kości konstrukcji w temperaturze fizjologicznej (37 °C), przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

Powstałe konstrukcje zachowują wysoką żywotność i integralność strukturalną, wspierając zastosowania dalsze, takie jak obrazowanie immunofluorescencyjne i badania molekularne. Wprowadzenie pochodzącej od pacjenta dECM zwiększa istotność translacyjną poprzez lepsze odzwierciedlenie przebudowy kości ludzkich i postępu choroby. To podejście zapewnia dostępną, skalowalną platformę do testowania leków, medycyny regeneracyjnej i badań mechanizmu biologii kości. Ogólnie rzecz biorąc, protokół oferuje praktyczną alternatywę dla drogich technik biodrukowania i może być łatwo dostosowany do innych tkankowych źródeł dECM.

Wprowadzenie

Niniejsza metoda ma na celu stworzenie opłacalnej i powtarzalnej platformy 3D do kultury komórek w celu modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego, w tym osteoporozy, poprzez łączenie GelMA z dECM pochodzącym z ludzkiego tkanki kostnej. Ta strategia umożliwia generowanie konstrukcji przypominających kości, które bardziej realistycznie odzwierciedlają fizjologiczne środowisko niż konwencjonalne dwuwymiarowej kultury, wspierając badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz w warunkach biologicznie istotnych1. Zastosowanie osteocytów pochodzących od pacjenta oraz dECM pochodzących z głów kości udowej zwiększa wartość translacyjną i zapewnia praktyczne połączenie między eksperymentacją in vitro a potrzebami badań klinicznych2.

Niniejsza metoda została opracowana w celu przezwyciężenia kluczowych ograniczeń istniejących systemów kultur 3D i biofabrykacji, które często wymagają biodrukarki, specjalistycznych biomateriałów lub kosztownych materiałów eksploatacyjnych (np. Matrigel), ograniczając dostępność w wielu przypadkach3,4. Co więcej, syntetyczne żele często nie odzwierciedlają biochemicznej złożoności zmineralizaowanej macierzy pozakomórkowej kości lub zachowania osteocytów rezydujących w tkankach5. W przeciwieństwie do tego, protokół ten zawiera ludzkie dECM pochodzące z kości, zachowując zawartość zmineralizowaną, białka rodzime i cząsteczki sygnałowe, jednocześnie unikając wymagań infrastrukturalnych związanych z technologiami produkcji dodatkowej6.

Kombinacja GelMA i dECM zapewnia kilka zalet. GelMA wspomaga adhezję komórkową, ich żywotność i różnicowanie oraz może być przetwarzana w temperaturze 37 °C, umożliwiając enkapsulację komórek bez specjalistycznego sprzętu. Sieciowanie za pomocą niedrogich źródeł ultrafioletu (UV) (365 nm) dodatkowo zwiększa dostępność7. Suplementacja dECM wzbogaca konstrukcję o wskazówki specyficzne dla tkanki, które są nieobecne w syntetycznych substytutach, poprawiając kompatybilność osteogenną i ułatwiając dalsze badania takie jak immunofluorescencja i profilowanie molekularne8.

Niniejsza metoda zgadza się z obecnymi wysiłkami na rzecz opracowania ludzkich modeli kości, które zmniejszają zależność od badań na zwierzętach, których dokładność translacyjna jest często ograniczona przez międzygatunkowe różnice1,9,10. Protokół jest zgodny z zasadami 3R11 i może być dostosowany do generowania konstrukcji z użyciem innych tkankowych dECM, rozszerzając potencjalne zastosowania na inżynierię tkankową chrząstki, skóry i układu krążenia12.

Ogólnie rzecz biorąc, ta technika zapewnia dostępną i skalowalną platformę do badania biologii kości w warunkach fizjologicznie istotnych. Kompatybilność z rutynową infrastrukturą laboratoryjną oraz zdolność do włączenia ludzkich próbek klinicznych czynią ją szczególnie przydatną dla grup badawczych z uczelni i szpitali. Metoda wspiera nie tylko platformę do dalszych badań kości nad procesami kostnymi, ale również może być punktem wyjścia dla bardziej translacyjnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i spersonalizowanym rozwoju terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Naukowej Służby Zdrowia w Concepción. Ludzką tkankę kostną pozyskano z głow la udowych przekazanych przez pacjentów poddawanych operacji wymiany stawu biodrowego w Szpitalu Traumatologicznym w Concepción w Chile, po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody. Próbki przechowywano w temperaturze −80 °C do momentu użycia. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego wykorzystania ludzkich tkanek w badaniach. Cała ludzka tkanka kostna została pozyskana z głów udowych przekazanych przez pacjentów w Szpitalu Traumatologicznym w Concepción w Chile, po uzyskaniu świadomej zgody i za zgodą Komisji Etyki Naukowej Służby Zdrowia w Concepción. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania ludzkich tkanek.

1. Synteza GelMA

  1. Rozpuścić 10 g żelatyny typu A w 100 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS, pH 7.5) w temperaturze 60 °C przy ciągłym mieszaniu.
  2. Obniżyć temperaturę do 50 °C i dodać 5 mL bezwodnika metakrylowego z szybkością 0,5 mL/min, mieszając łagodnie przez 1–3 h.
  3. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 5-krotnie za pomocą PBS uprzednio ogrzanego do 40 °C, aby zatrzymać reakcję.
  4. Dializować roztwór za pomocą membrany 12–14 kDa przeciwko 3–5 L wody destylowanej w temperaturze 40 °C przez 5–7 dni, wymieniając wodę codziennie.
    UWAGA: (Kluczowy krok) Należy zapewnić całkowitą codzienną wymianę wody, aby usunąć niezareagowany bezwodnik metakrylowy.
  5. Liofilizować zdializowany roztwór przez 24 h i przechowywać liofilizowane GelMA w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie hydrożelu GelMA

  1. Przygotować 10 mL partii hydrożeli GelMA o stężeniu 5, 10 lub 15 w/v%.
  2. Rozpuścić 0,5, 1,0 lub 1,5 g liofilizowanego GelMA w 9,5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.
  3. Schłodzić roztwór do 37 °C.
  4. Dodać 0,5 mL roztworu fotoinicjatora Irgacure 2959 (0,5 w/v% w etanolu absolutnym).
  5. Delikatnie wymieszać i utrzymywać roztwór w temperaturze 37 °C aż do momentu sterylnej filtracji przez membranowy filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,22 µm.

3. Decelularyzacja kości

  1. Stopniowo rozmrażaj głowy kości udowej do temperatury 25 °C. Przetnij każdą głowę kości udowej na pół, a następnie na mniejsze fragmenty.
  2. Zanurz fragmenty w sterylnej wodzie destylowanej o temperaturze 60 °C i poddaj sonikacji przez 15 min (40 kHz, tryb ciągły).
  3. Przemyj próbki w 300 mL wody destylowanej uprzednio podgrzanej do 60 °C, wstrząsając z prędkością 200 rpm przez 5 min.
  4. Wiruj przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C. Powtórz etapy płukania i wirowania trzy razy.
  5. Zesterylizuj tkankę poprzez sonikację (40 kHz, tryb ciągły) przez 10 min w temperaturze 60 °C w roztworze zawierającym 3% nadtlenku wodoru i 0,02% kwasu nadoctowego.
  6. Przenieś tkankę do 300 mL 70% etanolu i poddaj sonikacji (40 kHz, tryb ciągły) przez 10 min w temperaturze 21 °C.
  7. Przemyj próbki dwukrotnie 300 mL wody destylowanej, wstrząsając z prędkością 200 rpm przez 10 min w temperaturze 60 °C, a następnie wiruj przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C.
  8. Najpierw zamroź wstępnie kość w temperaturze -80 °C przez 4 h, a następnie liofilizuj zdecelularyzowaną kość przez 24 h w naczyniu o szerokim dnie, aby zapewnić równomierne suszenie i uniknąć nadmiernej wysokości próbki, przy ciśnieniu 0,05 mbar i temperaturze od -40 do -60 °C.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Upewnij się, że wysokość próbki wewnątrz naczynia nie przekracza 2–3 cm, aby zapobiec niepełnej liofilizacji.

4. Przygotowanie mikrocząstek kostnych

  1. Umieścić zdecelularyzowane fragmenty kości w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 mL z roztworem sterylizującym i homogenizować za pomocą homogenizatora do uzyskania jednorodnego białego roztworu (Supplementary Video 1).
  2. Wirować przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C, odrzucić nadsącz i dwukrotnie przemyć osad 300 mL wody destylowanej w 25 °C przy mieszaniu z prędkością 200 rpm przez 10 min. Przeprowadzić końcowe wirowanie przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C.
  3. Liofilizować (0,05 mbar w temperaturze od -40 do -60 °C) otrzymany materiał przez 48 h i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  4. Rozetrzeć mechanicznie liofilizowaną kość korową lub rdzeniową w sterylnym moździerzu ceramicznym aż do uzyskania drobnego proszku (Ryc. 1).
  5. Przesiać proszek przez sito o oczkach 200 µm, zważyć końcowy materiał i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Należy upewnić się, że proszek jest całkowicie suchy przed przesiewaniem, aby zapobiec agregacji i nieprawidłowemu doborowi wielkości cząstek.

Film uzupełniający 1: Procedura homogenizacji kości. Homogenizacja zdekularyzowanych fragmentów kości przy użyciu homogenizatora aż do uzyskania jednorodnej białej zawiesiny.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Przygotowanie próbek chemicznych; proces z użyciem moździerza i tłuczka; mielenie proszku do analizy; zestaw laboratoryjny.
Rysunek 1: Przygotowanie mikrocząstek kostnych. (A) Zdecelularyzowane fragmenty kości po homogenizacji za pomocą homogenizatora OV5 i przechowywaniu w temperaturze -80 °C. (B,C) Sterylny moździerz ceramiczny użyty do zmielenia zdecelularyzowanej kości na drobny proszek. (D) Końcowe zdecelularyzowane mikrocząstki kostne po przesiewaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Wytwarzanie żelu kostnego

  1. Przygotować 10 w/v% GelMA, rozpuszczając 1 g GelMA w 9,5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.
  2. Ostudzić roztwór do 37 °C i dodać roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959.
  3. Utrzymać roztwór w temperaturze 37 °C i przeprowadzić filtrację sterylną za pomocą filtra 0,22 µm.
  4. Dodać mikrocząsteczki odkomórkowionej kości (DBMP) w stężeniu 1% w/v.
  5. Mieszać i ostrożnie pipetować w górę i w dół w temperaturze 40 °C, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny w celu utworzenia żelu kostnego (BG).
  6. Przechowywać BG w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Przed wprowadzeniem komórek należy utrzymywać hydrożel powyżej temperatury żelowania (≥37 °C), aby uniknąć przedwczesnego stwardnienia.

6. Hodowla pierwotna osteocytów

  1. Ekstrakcja szpiku kostnego i wstępne przemywanie
    1. Wyciąć i rozdrobnić tkankę szpiku kostnego z wnętrza głowy kości udowej, używając sterylnych narzędzi chirurgicznych (Rysunek 2).
    2. Przenieść rozdrobnioną tkankę do sterylnej szalki Petriego.
    3. Przemyć tkankę trzy razy pożywką hodowlaną α-MEM uzupełnioną o roztwór antybiotykowo-antygrzybiczny (100 µg/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny, 0,25 µg/mL amfoterycyny).
    4. Przepłukać raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS).
      UWAGA: (Krok krytyczny) Należy zminimalizować czas między pobraniem tkanki a jej przetwarzaniem, aby zachować żywotność komórek.
  2. Trawienie enzymatyczne
    1. Inkubować tkankę w roztworze kolagenazy typu I przez 25 min w temperaturze 37 °C przy delikatnym mieszaniu.
    2. Przemyć roztworem HBSS.
    3. Powtórzyć kroki 6.2.1–6.2.2 jeszcze dwa razy (łącznie trzy trawienia kolagenazą).
    4. Inkubować tkankę w 0,5 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 25 min w temperaturze 37 °C.
    5. Przemyć roztworem HBSS i powtórzyć etap z EDTA jeszcze dwa razy.
    6. Przeprowadzić ostatnie trawienie kolagenazą typu I (25 min w 37 °C), a następnie przemyć roztworem HBSS.
      UWAGA: (Rozwiązywanie problemów) Niepełne trawienie może skutkować niską wydajnością komórek; w razie potrzeby przedłużyć inkubację enzymatyczną o 5–10 min.
  3. Odzyskiwanie i hodowla komórek
    1. Zebrać roztwór kolagenazy i przenieść ostatnią porcję przemywania HBSS do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.
    2. Wirować przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    3. Odlać supernatant i resuspender osad w 2 mL pełnej pożywki α-MEM.
    4. Zasiać zawiesinę komórkową do dwóch kolb hodowlanych T75 i inkubować w 37 °C przy 5% CO₂.
      UWAGA: Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2–3 dni, aż do osiągnięcia odpowiedniej konfluencji (Rysunek 3).

Proces dyssekcji tkanek; A: przygotowanie organu, B: zdyssekcyjne próbki w szalce Petri do analizy.
Rysunek 2: Pobieranie tkanki szpiku kostnego. (A) Głowa kości udowej uzyskana podczas operacji endoprotezoplastyki stawu biodrowego, z zaznaczonym obszarem szpiku wykorzystanym do izolacji komórek. (B) Rozdrobnione fragmenty kości szpikowej umieszczone w sterylnej szalce Petri przed trawieniem enzymatycznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopowy obraz hodowli komórkowej przedstawiający wzorzec wzrostu fibroblastów.
Rycina 3: Pierwotna hodowla osteocytów. Osteocyty przytwierdzone i proliferujące w monowarstwie w naczyniu T75 po izolacji z ludzkiej kości szpikowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

7. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek

  1. Podgrzej odpowiednią ilość hydrożelu BG do 37 °C.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Należy upewnić się, że w obszarze roboczym nie ma przeciągów; ochłodzenie przyspiesza przedwczesne żelowanie.
  2. Odklej hodowane osteocyty i odwiruj w probówce 15 mL przy 500 × g przez 5 min.
  3. Resuspenduj osad w 200 µL pożywki hodowlanej i wymieszaj z hydrożelem BG, aby uzyskać końcowe zagęszczenie komórek na poziomie co najmniej 1000 cells/µL (dalej określany jako biotusz).
  4. Pobierz 50 µL biotuszu za pomocą pipety 1000 µL i utrzymuj w temperaturze 37 °C do momentu osadzania.
  5. Nanieś pipetą 50 µL biotuszu na każdy konstrukt do poszczególnych dołków płytki hodowlanej (Supplementary Video 2); odczekaj około 5 min na fizyczne żelowanie w temperaturze pokojowej (Figure 4).
  6. Naświetlaj każdy dołek światłem UV o długości fali 365 nm przez 1 min, aby uzyskać nieodwracalne sieciowanie (0.30 J/cm2).
  7. Dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj konstrukty w 37 °C, 5% CO2 przez wymagany czas. Użyj osobnej płytki dla każdego punktu czasowego.

Ustawienie płytki do hodowli tkanek, eksperyment wzrostu komórek, sprzęt laboratoryjny, narzędzie do badań biologicznych.
Rysunek 4: Przygotowanie konstrukcji do trójwymiarowej hodowli komórkowej. Płytka wielodołkowa zawierająca konstrukty GelMA z zawiesionymi komórkami bezpośrednio po pipetowaniu oraz po sieciowaniu UV (365 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo uzupełniające 2: Przygotowanie trójwymiarowych konstruktów z obciążeniem komórkowym. Naniesienie mieszanin hydrożelu z komórkami do płytki 12-dołkowej przy użyciu prostej techniki pipetowania przed sieciowaniem UV.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

8. Badanie biokompatybilności

  1. Barwienie żywe/martwe
    1. Kultywować rusztowania z komórkami przez wymagane odstępy czasu.
    2. Przepłukać delikatnie sterylnym PBS.
    3. Inkubować konstrukty przez 30 min w ciemności w roztworze do barwienia żywe/martwe zawierającym 0,2% etydium homodimeru-1 (EthD-1) i 0,05% kalceiny AM w PBS.
    4. Wyonać obrazowanie natychmiast przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami dla kalceiny AM (~495/515 nm) i EthD-1 (~495/635 nm). Standardowe zestawy filtrów izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i Texas Red są odpowiednio kompatybilne z detekcją kalceiny AM i EthD-1.
    5. Zidentyfikować żywe komórki po zielonej fluorescencji cytoplazmatycznej, a martwe komórki po czerwonej fluorescencji jądrowej.
      UWAGA: Obrazy planarne można przetwarzać za pomocą programu ImageJ (Fiji). Obiektyw, czas ekspozycji, wzmocnienie (gain) oraz natężenie oświetlenia pozostawiono stałe dla wszystkich porównywanych próbek i dostosowano jedynie w celu uniknięcia nasycenia sygnału. Aby zminimalizować błędną interpretację spowodowaną autofluorescencją, dla wszystkich próbek w obrębie każdego eksperymentu utrzymano te same ustawienia akwizycji, a do rozpoznania wzorca fluorescencji tła związanej z biomateriałem wykorzystano obserwacje kontrolne konstruktów z rusztowania/mikrocząsteczek kostnych bez komórek. Kontrole te pozwoliły odróżnić sygnał pochodzący od cząsteczek od rzeczywistego barwienia zaokrąglonych komórek podczas interpretacji obrazu.
  2. Ilościowe oznaczanie AlamarBlue
    1. Przygotować 5% roztwór roboczy AlamarBlue w pełnej pożywce.
    2. Inkubować rusztowania w roztworze alamarBlue przez 2,5 h w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, chroniąc przed światłem.
    3. Przenieść 100 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej w trzech powtórzeniach, wliczając kontrole.
    4. Zmierzyć fluorescencję przy pobudzeniu 360/40 nm i emisji 460/40 nm.
    5. Znormalizować wartości fluorescencji względem kontroli w celu określenia względnej aktywności metabolicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne osteocyty zostały pomyślnie wyizolowane z ludzkich główek kości udowej i były wykrywalne w hodowli około 5 dni po ekstrakcji. Komórki wykazywały morfologię gwiaździstą i tworzyły połączone sieci charakterystyczne dla morfologii osteocytów, co potwierdziło pomyślną izolację, adhezję oraz żywotność (Rycina 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół oferuje dostępną i translacyjną metodę wytwarzania 3D konstrukcji przypominających kości, rozwiązując kluczowe ograniczenia obecnych podejść, takie jak zależność od drogich biodrukarów lub własnościowych matryc13. Łącząc GelMA z pozbawionymi komórek ludzkiej tkanki kostnej ekstrakomórkową matrycą8, fizjologicznie istotne konstrukty można wykonać wyłącznie za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego. Ta prostota umożliwia stosowanie w środowiskach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Dr Carolina Delgado z Jednostki Anatomii Patologicznej Uniwersytetu Concepción za jej wsparcie i zapewnienie dostępu do zasobów mikroskopicznych.

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo ANID kodów VIU24P0041 i SUC260026.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)Sigma-Aldrich410896-10GFotoinicjator polimeryzacji hydrożelu
AlamarBlue reagent żywotności komórek InvitrogenDAL1100Do ilościowego testu żywotności
Antybiotyk-Antymykotyczny (100´) Gibco15240-062Składnik pożywki kulturalnej
Kolba do kultury komórek (T75)SPL Life Sciences70075Do kultury osteocytów
Kolagenaza Typ 1Gibco17100-017Do enzymatycznego trawienia próbek kości
Probówka stożkowa, 15 mLSPL Life Sciences50015Do przygotowania hydrożelu
DarkDawn D15-365 nmDarkDawn-Do UV krzyżowania hydrożelu
DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezugibco21600069Rozpuszczalnik hydrożelu, rozpuszczalnik zestawu LIVE/DEAD
EDTA Disodium Salt 2-HIDWinklerED-0760Do enzymatycznego trawienia próbek kości
Centryfuga Eppendorf 5702Eppendorf5702000010Do przygotowania mikrocząstek kości
Etanol absolutny do analizySupelco1,00,98,32,511Do deskielowania kości (rozcieńczony do 70%), rozpuszczalnik fotoinicjoru
Surowica byczaGibcoA52567-01Składnik pożywki kulturalnej
Żelatyna z skóry świńSigma-AldrichG1890-500GSkładnik hydrożelu
HBSS (10´)Gibco14185-052Do płukania próbek szpiku kostnego
L-Askorbinian 2-fosfatSigma-AldrichA8960-5GSkładnik pożywki kulturalnej
Zestaw żywotności/cytotoksyczności LIVE/DEADInvitrogenL3224Do jakościowego testu żywotności/cytotoksyczności
MEM Alpha (1´)Gibco12571-063Składnik pożywki kulturalnej
Anhydryd metakrylanowySigma-Aldrich276685-500GSkładnik hydrożelu
Mikroprobówka do centrumCitotest4610-1844Do przygotowania barwników alamarBlue i LIVE/DEAD
NuncIon delta surface Thermoscientific15062812-dołkowa płyta do siewu próbek
Źródło światła fluorescencyjnego OLYMPUS BX43 źródło światła Olympus U- LH100HGEvidentU- LH100HGŹródło światła do analizy fluorescencyjnej
RC-6 Plus centryfugaThermo Scientific Sorvall46910Do deskielowania kości i przygotowania mikrocząstek kości
Wielofunkcyjny czytnik Synergy HTXBioTek Instruments-Spektrofotometr 
Strzykawka z igłąNIPROSY3-WN-R-03Do filtrowania hydrożelu
Płytka do kultury tkankowej 96 dołkówJet BiofilTCP00109696 dołków do testu żywotności alamarBlue.
Oczyszczacz ultradźwiękowyVWE97043-958Do sonicacji próbek kości

Bibliografia

  1. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).
  2. Hatt, L. P., et al. Standard in vitro evaluations of engineered bone substitutes are not sufficient to predict in vivo preclinical model outcomes. Acta Biomater. 156, 177-189 (2023).
  3. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387 (2021).
  4. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  5. Sun, Q., Choudhary, S., Mannion, C., Kissin, Y., Zilberberg, J., et al. Ex vivo replication of phenotypic functions of osteocytes through biomimetic 3D bone tissue construction. Bone. 106, 148-155 (2018).
  6. Metzger, W., et al. Expansion and differentiation of human primary osteoblasts in two- and three-dimensional culture. Biotech Histochem. 88 (2), 86-102 (2013).
  7. Walsh, C. M., Wychowaniec, J. K., Costello, L., Brougham, D. F., Dooley, D. An In vitro and ex vivo analysis of the potential of GelMA hydrogels as a therapeutic platform for preclinical spinal cord injury. Adv Healthc Mater. 12 (26), e2300951 (2023).
  8. Smith, C. A., Board, T. N., Rooney, P., Eagle, M. J., Richardson, S. M., et al. Human decellularized bone scaffolds from aged donors show improved osteoinductive capacity compared to young donor bone. PLoS One. 12 (5), e0177416 (2017).
  9. Ryan, S. L., et al. Drug discovery approaches utilizing three-dimensional cell culture. Assay Drug Dev Technol. 14 (1), 19-28 (2016).
  10. Sittampalam, S., et al. Three-dimensional cell culture assays: Are they more predictive of in vivo efficacy than 2D monolayer cell-based assays?. Assay Drug Dev Technol. 13 (5), 254-261 (2015).
  11. Knight, A. Systematic reviews of animal experiments demonstrate poor human clinical and toxicological utility. Altern Lab Anim. 35 (6), 641-659 (2007).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Schlander, M., Hernandez-Villafuerte, K., Cheng, C. Y., Mestre-Ferrandiz, J., Baumann, M. How Much Does It Cost to Research and Develop a New Drug? A Systematic Review and Assessment. Pharmacoeconomics. 39 (11), 1243-1269 (2021).
  14. Shah, K. M., Stern, M. M., Stern, A. R., Pathak, J. L., Bravenboer, N., et al. Osteocyte isolation and culture methods. Bonekey Rep. 5, 838 (2016).
  15. Zhang, W., Lee, W. Y., Siegel, D. S., Tolias, P., Zilberberg, J. Patient-specific 3D microfluidic tissue model for multiple myeloma. Tissue Eng Part C Methods. 20 (8), 663-670 (2014).
  16. Jiang, Q., Nagano, K., Moriishi, T., Komori, H., Sakane, C., et al. Roles of Sp7 in osteoblasts for the proliferation, differentiation, and osteocyte process formation. J Orthop Translat. 47, 161-175 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa hodowla kościmodelowanie chorób układu mięśniowo-szkieletowegohydrożele GelMAprzebudowa kościkość in vitroobrazowanie immunofluorescencyjnewytwarzanie konstruktów kostnychmedycyna regeneracyjna
Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.