Artykuł metodologiczny

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

116 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70782

⸱

23 czerwca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de Odontología, Universidad San Sebastián, 2Laboratorio de Biotecnología y Biofarmacia, Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, 3Hospital Traumatológico de Concepción, Servicio Salud Concepción

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Streszczenie

Modelowanie chorób układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak osteoporoza, wymaga in vitro platform, które dokładnie odtwarzają kluczowe cechy ludzkiej biologii kości. Konwencjonalne systemy 3D kultury dostarczają cenny wgląd w interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, ale ich zależność od kosztownych materiałów, biodrukarki lub specjalistycznej infrastruktury ogranicza ich szersze przyjęcie. Opisujemy tutaj wytrzymały i niskobudżetowy protokół generowania 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem pochodzących od ludzi osteocytów osadzanych w hydrożelach GelMA, uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową (dECM) uzyskaną z podarowanych głów kości udowej. Ta metoda oparta na pipetowaniu umożliwia produkcję powtarzalnych, przypominających kości konstrukcji w temperaturze fizjologicznej (37 °C), przy użyciu standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

Powstałe konstrukcje zachowują wysoką żywotność i integralność strukturalną, wspierając zastosowania dalsze, takie jak obrazowanie immunofluorescencyjne i badania molekularne. Wprowadzenie pochodzącej od pacjenta dECM zwiększa istotność translacyjną poprzez lepsze odzwierciedlenie przebudowy kości ludzkich i postępu choroby. To podejście zapewnia dostępną, skalowalną platformę do testowania leków, medycyny regeneracyjnej i badań mechanizmu biologii kości. Ogólnie rzecz biorąc, protokół oferuje praktyczną alternatywę dla drogich technik biodrukowania i może być łatwo dostosowany do innych tkankowych źródeł dECM.

Wprowadzenie

Niniejsza metoda ma na celu stworzenie opłacalnej i powtarzalnej platformy 3D do kultury komórek w celu modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego, w tym osteoporozy, poprzez łączenie GelMA z dECM pochodzącym z ludzkiego tkanki kostnej. Ta strategia umożliwia generowanie konstrukcji przypominających kości, które bardziej realistycznie odzwierciedlają fizjologiczne środowisko niż konwencjonalne dwuwymiarowej kultury, wspierając badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz w warunkach biologicznie istotnych1. Zastosowanie osteocytów pochodzących od pacjenta oraz dECM pochodzących z głów kości udowej zwiększa wartość translacyjną i zapewnia praktyczne połączenie między eksperymentacją in vitro a potrzebami badań klinicznych2.

Niniejsza metoda została opracowana w celu przezwyciężenia kluczowych ograniczeń istniejących systemów kultur 3D i biofabrykacji, które często wymagają biodrukarki, specjalistycznych biomateriałów lub kosztownych materiałów eksploatacyjnych (np. Matrigel), ograniczając dostępność w wielu przypadkach3,4. Co więcej, syntetyczne żele często nie odzwierciedlają biochemicznej złożoności zmineralizaowanej macierzy pozakomórkowej kości lub zachowania osteocytów rezydujących w tkankach5. W przeciwieństwie do tego, protokół ten zawiera ludzkie dECM pochodzące z kości, zachowując zawartość zmineralizowaną, białka rodzime i cząsteczki sygnałowe, jednocześnie unikając wymagań infrastrukturalnych związanych z technologiami produkcji dodatkowej6.

Kombinacja GelMA i dECM zapewnia kilka zalet. GelMA wspomaga adhezję komórkową, ich żywotność i różnicowanie oraz może być przetwarzana w temperaturze 37 °C, umożliwiając enkapsulację komórek bez specjalistycznego sprzętu. Sieciowanie za pomocą niedrogich źródeł ultrafioletu (UV) (365 nm) dodatkowo zwiększa dostępność7. Suplementacja dECM wzbogaca konstrukcję o wskazówki specyficzne dla tkanki, które są nieobecne w syntetycznych substytutach, poprawiając kompatybilność osteogenną i ułatwiając dalsze badania takie jak immunofluorescencja i profilowanie molekularne8.

Niniejsza metoda zgadza się z obecnymi wysiłkami na rzecz opracowania ludzkich modeli kości, które zmniejszają zależność od badań na zwierzętach, których dokładność translacyjna jest często ograniczona przez międzygatunkowe różnice1,9,10. Protokół jest zgodny z zasadami 3R11 i może być dostosowany do generowania konstrukcji z użyciem innych tkankowych dECM, rozszerzając potencjalne zastosowania na inżynierię tkankową chrząstki, skóry i układu krążenia12.

Ogólnie rzecz biorąc, ta technika zapewnia dostępną i skalowalną platformę do badania biologii kości w warunkach fizjologicznie istotnych. Kompatybilność z rutynową infrastrukturą laboratoryjną oraz zdolność do włączenia ludzkich próbek klinicznych czynią ją szczególnie przydatną dla grup badawczych z uczelni i szpitali. Metoda wspiera nie tylko platformę do dalszych badań kości nad procesami kostnymi, ale również może być punktem wyjścia dla bardziej translacyjnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i spersonalizowanym rozwoju terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Naukowej Służby Zdrowia w Concepción. Ludzką tkankę kostną pobrano z głowy kości udowej przekazanej przez pacjentów poddawanych operacji wymiany stawu biodrowego w Szpitalu Traumatologicznym w Concepción w Chile, po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody. Próbki przechowywano w temperaturze −80 °C do momentu użycia. Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego wykorzystania ludzkich tkanek w badaniach. Wszystkie ludzkie tkanki kostne pobrano z głowy kości udowej przekazanej przez pacjentów w Szpitalu Traumatologicznym w Concepción w Chile, po uzyskaniu świadomej zgody i za zgodą Komitetu Etyki Naukowej Służby Zdrowia w Concepción. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania ludzkich tkanek.

1. Synteza GelMA

  1. Rozpuścić 10 g żelatyny typu A w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS, pH 7,5) w temperaturze 60 °C przy stałym mieszaniu.
  2. Obniżyć temperaturę do 50 °C następnie dodać 5 ml bezwodnika metakrylowego z szybkością 0,5 ml/min, delikatnie mieszając przez 1–3 h.
  3. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 5× z użyciem PBS uprzednio ogrzanego do 40 °C aby zatrzymać reakcję.
  4. Przeprowadzić dializę roztworu za pomocą membrany o odcięciu 12–14 kDa przeciwko 3–5 l wody destylowanej w 40 °C przez 5–7 dni, z codzienną wymianą wody.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Należy zapewnić całkowitą codzienną wymianę wody w celu usunięcia nieprzereagowanego bezwodnika metakrylowego.
  5. Liofilizować dializowany roztwór przez 24 h, a liofilizowany GelMA przechowywać w 4 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie hydrożelu GelMA

  1. Przygotować 10 mL partii hydrożeli GelMA o stężeniach 5, 10 lub 15 w/v%.
  2. Rozpuścić 0,5, 1,0 lub 1,5 g liofilizowanego GelMA w 9,5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.
  3. Ostudzić roztwór do 37 °C.
  4. Dodać 0,5 mL roztworu fotoinicjatora Irgacure 2959 (0,5 w/v% w etanolu bezwodnym).
  5. Delikatnie wymieszać i utrzymywać roztwór w temperaturze 37 °C aż do momentu sterylnej filtracji przez membranowy filtr z octanu celulozy o porach 0,22 µm.

3. Decelularyzacja kości

  1. Stopniowo rozmrażać głowy kości udowej do 25 °C. Przeciąć każdą głowę kości udowej na pół, a następnie na mniejsze kawałki.
  2. Zanurzyć kawałki w sterylnej wodzie destylowanej w temperaturze 60 °C i poddać sonikacji przez 15 min (40 kHz, tryb ciągły).
  3. Przemyć próbki w 300 mL wody destylowanej wstępnie podgrzanej do 60 °C, mieszając na wytrząsarce z prędkością 200 rpm przez 5 min.
  4. Wirować przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C. Powtórzyć etapy płukania i wirowania trzy razy.
  5. Zsterylizować tkankę poprzez sonikację (40 kHz, tryb ciągły) przez 10 min w 60 °C w roztworze zawierającym 3% nadtlenku wodoru i 0,02% kwasu nadoctowego.
  6. Przenieść tkankę do 300 mL 70% etanolu i poddać sonikacji (40 kHz, tryb ciągły) przez 10 min w 21 °C.
  7. Przemyć próbki dwukrotnie 300 mL wody destylowanej, wytrząsać z prędkością 200 rpm przez 10 min w 60 °C i wirować przy 1850 × g przez 15 min w 25 °C.
  8. Najpierw wstępnie zamrozić kość w temperaturze -80 °C przez 4 h, a następnie liofilizować zdekulularyzowaną kość przez 24 h w naczyniu o szerokim dnie (aby zapewnić równomierne suszenie i uniknąć zbyt dużej wysokości próbki) przy ciśnieniu 0,05 mbar i temperaturze od -40 do -60 °C.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Należy dopilnować, aby wysokość próbki w pojemniku nie przekraczała 2–3 cm, co zapobiegnie niepełnej liofilizacji.

4. Przygotowanie mikrocząstek kostnych

  1. Umieścić zdecelularyzowane fragmenty kości w kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 mL z roztworem sterylizującym i homogenizować za pomocą homogenizatora do uzyskania jednorodnego białego roztworu (Supplementary Video 1).
  2. Wirować przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C, odrzucić naddatek i dwukrotnie przemyć osad 300 mL wody destylowanej w temperaturze 25°C przy mieszaniu z prędkością 200 rpm przez 10 min. Przeprowadzić końcowe wirowanie przy 1850 × g przez 15 min w temperaturze 25 °C.
  3. Liofilizować (0,05 mbar w temperaturze od -40 do -60 °C) otrzymany materiał przez 48 h i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  4. Mechanicznie rozetrzeć liofilizowaną kość korową lub szpikową za pomocą sterylnego moździerza ceramicznego, aż do uzyskania drobnego proszku (Rycina 1).
  5. Przesiać proszek przez sito o oczkach 200 µm, zważyć końcowy materiał i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Przed przesiewaniem należy upewnić się, że proszek jest całkowicie suchy, aby zapobiec agregacji i błędnemu doborowi wielkości cząstek.

Wideo uzupełniające 1: Procedura homogenizacji kości. Homogenizacja odkomórkowionych fragmentów kości za pomocą homogenizatora aż do uzyskania jednorodnej białej zawiesiny.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przygotowanie mikrocząstek kostnych. (A) Zdecelularyzowane fragmenty kości po homogenizacji za pomocą homogenizatora OV5 i przechowywaniu w -80 °C. (B,C) Sterylny moździerz ceramiczny użyty do rozcierania zdecelularyzowanej kości na drobny proszek. (D) Końcowe zdecelularyzowane mikrocząstki kostne po przesiewaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Wytwarzanie żelu kostnego

  1. Przygotować 10% w/v GelMA, rozpuszczając 1 g GelMA w 9,5 mL wody dejonizowanej w temperaturze 50 °C.
  2. Ostudzić roztwór do 37 °C i dodać roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959.
  3. Utrzymywać roztwór w temperaturze 37 °C i przeprowadzić filtrację sterylną za pomocą filtra 0,22 µm.
  4. Dodać decelularyzowane mikrocząsteczki kostne (DBMP) w stężeniu 1% w/v.
  5. Mieszać i ostrożnie pipetować w górę i w dół w temperaturze 40 °C, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania homogenicznej zawiesiny w celu utworzenia żelu kostnego (BG).
  6. Przechowywać BG w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Przed wprowadzeniem komórek należy utrzymywać hydrożel powyżej temperatury żelowania (≥37 °C), aby uniknąć przedwczesnego utwardzenia.

6. Hodowla pierwotna osteocytów

  1. Ekstrakcja szpiku kostnego i wstępne przemywanie
    1. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych wyekstrahować i posiekać tkankę szpiku kostnego z wnętrza głowy kości udowej (Rysunek 2).
    2. Przenieść posiekaną tkankę do sterylnej szalki Petriego.
    3. Przemyć tkankę trzy razy pożywką hodowlaną α-MEM uzupełnioną o roztwór antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych (100 µg/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny, 0,25 µg/mL amfoterycyny).
    4. Przepłukać raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS).
      UWAGA: (Krok krytyczny) Należy zminimalizować czas między pobraniem tkanki a jej przetworzeniem, aby zachować żywotność komórek.
  2. Trawienie enzymatyczne
    1. Inkubować tkankę w roztworze kolagenazy typu I przez 25 min w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu.
    2. Przemyć roztworem HBSS.
    3. Powtórzyć kroki 6.2.1–6.2.2 jeszcze dwa razy (łącznie trzy trawienia kolagenazą).
    4. Inkubować tkankę w 0,5 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 25 min w temperaturze 37 °C.
    5. Przemyć roztworem HBSS i powtórzyć etap z EDTA jeszcze dwa razy.
    6. Przeprowadzić ostatnie trawienie kolagenazą typu I (25 min w 37 °C), a następnie przemyć roztworem HBSS.
      UWAGA: (Rozwiązywanie problemów) Niepełne trawienie może skutkować niską wydajnością komórek; w razie potrzeby wydłużyć inkubację enzymatyczną o 5–10 min.
  3. Odzyskiwanie i hodowla komórek
    1. Zebrać roztwór kolagenazy i przenieść końcowy przemywany roztwór HBSS do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.
    2. Wirować przy 1,000 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    3. Odlać nadsącz i resuspendować osad w 2 mL kompletnej pożywki α-MEM.
    4. Zasiać zawiesinę komórkową do dwóch kolb hodowlanych T75 i inkubować w 37 °C przy 5% CO₂.
      ​UWAGA: Wymieniać pożywkę hodowlaną co 2–3 dni aż do uzyskania odpowiedniej konfluencji (Rysunek 3).

figure-protocol-2
Rycina 2: Pozyskiwanie tkanki szpiku kostnego. (A) Główka kości udowej pobrana podczas operacji wymiany stawu biodrowego, ukazująca obszar szpiku wykorzystany do izolacji komórek. (B) Rozdrobnione fragmenty kości szpikowej umieszczone w sterylnym naczyniu Petri przed trawieniem enzymatycznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-3
Rycina 3: Pierwotna hodowla osteocytów. Osteocyty przytwierdzone i proliferujące w monowarstwie w naczyniu T75 po izolacji z ludzkiej kości szpikowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

7. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek

  1. Podgrzej odpowiednią ilość hydrożelu BG do 37 °C.
    UWAGA: (Krok krytyczny) Upewnij się, że w obszarze roboczym nie ma przeciągów; chłodzenie przyspiesza przedwczesne żelowanie.
  2. Odlep hodowane osteocyty i odwiruj przy 500 × g przez 5 min w probówce 15 mL.
  3. Resuspenduj osad w 200 µL pożywki hodowlanej i wymieszaj z hydrożelem BG, aby uzyskać końcową gęstość komórek co najmniej 1000 cells/µL (zwany odtąd bioatramentem).
  4. Pobierz 50 µL bioatramentu za pomocą pipety 1000 µL i utrzymuj w temperaturze 37 °C do momentu nakładania.
  5. Nanieś pipetą 50 µL bioatramentu na jeden konstrukt do każdego dołka płytki hodowlanej (Supplementary Video 2); pozostaw na około 5 min w temperaturze pokojowej w celu żelowania fizycznego (Figure 4).
  6. Naświetlaj każdy dołek światłem UV o długości fali 365 nm przez 1 min, aby uzyskać nieodwracalne sieciowanie (0.30 J/cm2).
  7. Dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj konstrukty w 37 °C, 5% CO2 przez wymagany czas. Użyj oddzielnej płytki dla każdego punktu czasowego.

figure-protocol-4
Rycina 4: Przygotowanie 3D konstrukcji hodowli komórkowej. Płytka wielodołkowa zawierająca konstrukty GelMA z komórkami bezpośrednio po pipetowaniu oraz po sieciowaniu UV (365 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Film uzupełniający 2: Przygotowanie trójwymiarowych konstrukcji z komórkami. Naniesienie mieszanin hydrożelu z komórkami do płytki 12-dołkowej przy użyciu prostej techniki pipetowania przed sieciowaniem UV.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

8. Badanie biokompatybilności

  1. Barwienie żywe/martwe
    1. Kulturować rusztowania z zasianymi komórkami przez pożądane odstępy czasu.
    2. Delikatnie przemyć sterylnym PBS.
    3. Inkubować konstrukty przez 30 min w ciemności z roztworem do barwienia żywe/martwe zawierającym 0,2% etydyny homodimeru-1 (EthD-1) i 0,05% kalceiny AM w PBS.
    4. Wykonać obrazowanie natychmiast przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami dla kalceiny AM (~495/515 nm) i EthD-1 (~495/635 nm). Standardowe zestawy filtrów dla izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) oraz Texas Red są odpowiednio kompatybilne z detekcją kalceiny AM i EthD-1.
    5. Zidentyfikować żywe komórki po zielonej fluorescencji cytoplazmatycznej, a martwe komórki po czerwonej fluorescencji jądrowej.
      ​UWAGA: Obrazy planarne można przetwarzać za pomocą programu ImageJ (Fiji). Obiektyw, czas ekspozycji, wzmocnienie i intensywność oświetlenia pozostawały stałe dla wszystkich porównywanych próbek i były dostosowywane jedynie w celu uniknięcia nasycenia sygnału. Aby zminimalizować błędną interpretację spowodowaną autofluorescencją, dla wszystkich próbek w ramach każdego eksperymentu utrzymywano te same ustawienia akwizycji, a do rozpoznania wzorca fluorescencji tła związanej z biomateriałem wykorzystano obserwacje kontrolne konstruktów z rusztowania/mikrocząsteczek kostnych bez komórek. Kontrole te pozwoliły odróżnić sygnał pochodzący z cząsteczek od rzeczywistego barwienia zaokrąglonych komórek podczas interpretacji obrazu.
  2. Ilościowe oznaczenie Alamarblue
    1. Przygotować 5% roztwór roboczy alamarblue w medium kompletnym.
    2. Inkubować rusztowania w roztworze alamarBlue przez 2,5 h w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, chroniąc przed światłem.
    3. Przenieść 100 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej w trzech powtórzeniach, wliczając kontrole.
    4. Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 360/40 nm i emisji 460/40 nm.
    5. Znormalizować wartości fluorescencji względem kontroli w celu określenia względnej aktywności metabolicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne osteocyty zostały pomyślnie wyizolowane z ludzkich głowek kości udowej i były wykrywalne w hodowli około 5 dni po ekstrakcji. Komórki wykazywały morfologię gwiaździstą i tworzyły połączone sieci charakterystyczne dla morfologii osteocytów, co potwierdziło pomyślną izolację, przyleganie oraz żywotność (Rysunek 5).

figure-results-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół oferuje dostępną i translacyjną metodę wytwarzania 3D konstrukcji przypominających kości, rozwiązując kluczowe ograniczenia obecnych podejść, takie jak zależność od drogich biodrukarów lub własnościowych matryc13. Łącząc GelMA z pozbawionymi komórek ludzkiej tkanki kostnej ekstrakomórkową matrycą8, fizjologicznie istotne konstrukty można wykonać wyłącznie za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego. Ta prostota umożliwia stosowanie w środowiskach ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Dr Carolina Delgado z Jednostki Anatomii Patologicznej Uniwersytetu Concepción za jej wsparcie i zapewnienie dostępu do zasobów mikroskopicznych.

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo ANID kodów VIU24P0041 i SUC260026.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)Sigma-Aldrich410896-10GFotoinicjator polimeryzacji hydrożelu
AlamarBlue reagent żywotności komórek InvitrogenDAL1100Do ilościowego testu żywotności
Antybiotyk-Antymykotyczny (100´) Gibco15240-062Składnik pożywki kulturalnej
Kolba do kultury komórek (T75)SPL Life Sciences70075Do kultury osteocytów
Kolagenaza Typ 1Gibco17100-017Do enzymatycznego trawienia próbek kości
Probówka stożkowa, 15 mLSPL Life Sciences50015Do przygotowania hydrożelu
DarkDawn D15-365 nmDarkDawn-Do UV krzyżowania hydrożelu
DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezugibco21600069Rozpuszczalnik hydrożelu, rozpuszczalnik zestawu LIVE/DEAD
EDTA Disodium Salt 2-HIDWinklerED-0760Do enzymatycznego trawienia próbek kości
Centryfuga Eppendorf 5702Eppendorf5702000010Do przygotowania mikrocząstek kości
Etanol absolutny do analizySupelco1,00,98,32,511Do deskielowania kości (rozcieńczony do 70%), rozpuszczalnik fotoinicjoru
Surowica byczaGibcoA52567-01Składnik pożywki kulturalnej
Żelatyna z skóry świńSigma-AldrichG1890-500GSkładnik hydrożelu
HBSS (10´)Gibco14185-052Do płukania próbek szpiku kostnego
L-Askorbinian 2-fosfatSigma-AldrichA8960-5GSkładnik pożywki kulturalnej
Zestaw żywotności/cytotoksyczności LIVE/DEADInvitrogenL3224Do jakościowego testu żywotności/cytotoksyczności
MEM Alpha (1´)Gibco12571-063Składnik pożywki kulturalnej
Anhydryd metakrylanowySigma-Aldrich276685-500GSkładnik hydrożelu
Mikroprobówka do centrumCitotest4610-1844Do przygotowania barwników alamarBlue i LIVE/DEAD
NuncIon delta surface Thermoscientific15062812-dołkowa płyta do siewu próbek
Źródło światła fluorescencyjnego OLYMPUS BX43 źródło światła Olympus U- LH100HGEvidentU- LH100HGŹródło światła do analizy fluorescencyjnej
RC-6 Plus centryfugaThermo Scientific Sorvall46910Do deskielowania kości i przygotowania mikrocząstek kości
Wielofunkcyjny czytnik Synergy HTXBioTek Instruments-Spektrofotometr 
Strzykawka z igłąNIPROSY3-WN-R-03Do filtrowania hydrożelu
Płytka do kultury tkankowej 96 dołkówJet BiofilTCP00109696 dołków do testu żywotności alamarBlue.
Oczyszczacz ultradźwiękowyVWE97043-958Do sonicacji próbek kości

Bibliografia

  1. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (11), 751-769 (2016).
  2. Hatt, L. P., et al. Standard in vitro evaluations of engineered bone substitutes are not sufficient to predict in vivo preclinical model outcomes. Acta Biomater. 156, 177-189 (2023).
  3. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Commun Biol. 4 (1), 1387 (2021).
  4. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  5. Sun, Q., Choudhary, S., Mannion, C., Kissin, Y., Zilberberg, J., et al. Ex vivo replication of phenotypic functions of osteocytes through biomimetic 3D bone tissue construction. Bone. 106, 148-155 (2018).
  6. Metzger, W., et al. Expansion and differentiation of human primary osteoblasts in two- and three-dimensional culture. Biotech Histochem. 88 (2), 86-102 (2013).
  7. Walsh, C. M., Wychowaniec, J. K., Costello, L., Brougham, D. F., Dooley, D. An In vitro and ex vivo analysis of the potential of GelMA hydrogels as a therapeutic platform for preclinical spinal cord injury. Adv Healthc Mater. 12 (26), e2300951 (2023).
  8. Smith, C. A., Board, T. N., Rooney, P., Eagle, M. J., Richardson, S. M., et al. Human decellularized bone scaffolds from aged donors show improved osteoinductive capacity compared to young donor bone. PLoS One. 12 (5), e0177416 (2017).
  9. Ryan, S. L., et al. Drug discovery approaches utilizing three-dimensional cell culture. Assay Drug Dev Technol. 14 (1), 19-28 (2016).
  10. Sittampalam, S., et al. Three-dimensional cell culture assays: Are they more predictive of in vivo efficacy than 2D monolayer cell-based assays?. Assay Drug Dev Technol. 13 (5), 254-261 (2015).
  11. Knight, A. Systematic reviews of animal experiments demonstrate poor human clinical and toxicological utility. Altern Lab Anim. 35 (6), 641-659 (2007).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Schlander, M., Hernandez-Villafuerte, K., Cheng, C. Y., Mestre-Ferrandiz, J., Baumann, M. How Much Does It Cost to Research and Develop a New Drug? A Systematic Review and Assessment. Pharmacoeconomics. 39 (11), 1243-1269 (2021).
  14. Shah, K. M., Stern, M. M., Stern, A. R., Pathak, J. L., Bravenboer, N., et al. Osteocyte isolation and culture methods. Bonekey Rep. 5, 838 (2016).
  15. Zhang, W., Lee, W. Y., Siegel, D. S., Tolias, P., Zilberberg, J. Patient-specific 3D microfluidic tissue model for multiple myeloma. Tissue Eng Part C Methods. 20 (8), 663-670 (2014).
  16. Jiang, Q., Nagano, K., Moriishi, T., Komori, H., Sakane, C., et al. Roles of Sp7 in osteoblasts for the proliferation, differentiation, and osteocyte process formation. J Orthop Translat. 47, 161-175 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla ko cimodelowanie chor b uk adu mi niowo szkieletowegohydro ele GelMAprzebudowa ko ciko in vitroobrazowanie immunofluorescencyjnewytwarzanie konstrukt w kostnychmedycyna regeneracyjna

Powiązane artykuły