Farmakologia sieciowa i weryfikacja eksperymentalna w celu zbadania kory cinamomi w kontekście osteomartizy głowy kości udowej wywołanej sterydami

Podsumowanie

Celem tego badania są zbadanie potencjalnych mechanizmów kory cinamomi w leczeniu osteonekrozy głowy kości udowej poprzez integrację farmakologii sieci, symulacji dynamiki molekularnej oraz eksperymentów na zwierzętach.

Streszczenie

Osteomartica kości udowej wywołana sterydami (SONFH) powoduje silny ból i ograniczoną ruchomość, co znacząco obniża jakość życia pacjentów. Kora cinamomi (CC) wykazano jako skuteczną łagodzącą tę chorobę, jednak mechanizm działania pozostaje niejasny. Celem tego badania jest identyfikacja aktywnych związków CC oraz zbadanie ich mechanizmów w SONFH. Aktywne składniki były przesiewane za pomocą baz danych HERB 2.0, PubChem i SwissADME, a odpowiadające im cele przewidywano za pomocą bazy Swiss Target Prediction. Cele dla SONFH zostały zidentyfikowane poprzez przecięcie celów z baz danych GEO, DisGeNET, GeneCards i OMIM z celami związanymi ze związkami. Sieć interakcji białko-białko (PPI) została zbudowana przy użyciu bazy danych STRING, a analizy wzbogacenia GO i KEGG przeprowadzono za pośrednictwem bazy danych DAVID. Najbardziej obiecujące interakcje związek złożony z celem zostały zweryfikowane poprzez symulacje dokowania molekularnego (MD) oraz dynamiki molekularnej. Badacze zidentyfikowali 563 potencjalne cele, w tym 61 celów związanych z SONFH, przy czym AKT1, HIF-1α i STAT3 pełniły rolę centralnych węzłów. Analiza wzbogacenia KEGG uwypukliła szlak sygnalizacji HIF-1α jako kluczowy mechanizm. Ponadto eksperymenty na zwierzętach wykazały, że aktywna frakcja CC skutecznie łagodziła strukturalne uszkodzenia głowy udowej w modelu mysim z SONFH. Wyniki sugerują, że CC może poprawić SONFH poprzez koordynację adaptacji do hipoksji oraz regulację angiogenezy i osteogenezy.

Wprowadzenie

Osteomartwa głowy kości udowej wywołana sterydami (SONFH) to krytyczne zaburzenie kościowo-stawowe, które jest spowodowane zaburzeniem lub ograniczeniem dopływu krwi do głowy kości udowej z powodu różnych¹. Śmierć komórek kostnych i składników szpiku prowadzi do uszkodzeń strukturalnych w głowie kości udowej oraz upośledzenia funkcji stawu biodrowego². Klinicznie pacjenci zazwyczaj zgłaszają się z bólem biodra i ograniczoną ruchomością³. Bez skutecznego leczenia 80% pacjentów z SONFH przebiega do zapadania się głowy kości udowej, wymagającej całkowitej wymiany stawu^{biodrowego 4}. Wywiera to na pacjentów poważną presję psychologiczną i duże obciążenie ekonomiczne⁵. Praktyka kliniczna zaleca stosowanie kombinacji leków przeciwzakrzepowych, leków fibrynolitycznych, wazodylatatorów oraz leków obniżających poziom lipidu w leczeniu SONFH, które wykazały pewien potencjał kliniczny, ale ogólnie ograniczoną skuteczność terapeutyczną⁶.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) coraz częściej wykazuje pozytywny wpływ na leczenie SONFH⁷. TCM wykazuje potencjał w łagodzeniu objawów, kontroli chorób oraz poprawie ruchomości stawów i jakości życia pacjentów⁸. Klinicznie CC i jego składniki były szeroko stosowane w celu poprawy SONFH, wykazując znaczącą skuteczność⁹. Wiele substancji bioaktywnych zawartych w CC wykazuje różnorodne właściwości biologiczne, w tym przeciwzapalne, antyoksydacyjne, wspierające angiogenezę oraz poprawiające mikrokrążenie¹⁰. Wcześniejsze badania nad inżynierią tkanki kostnej i metabolizmem wykazały, że cynamaldehyd, główny aktywny składnik CC, może modulować szlaki sygnalizacyjne związane z przebudową kości¹¹. Pierwsze badanie wykazało, że tabletki Yougui (YGP) mają potencjał terapeutyczny dla SONFH poprzez promowanie angiogenezy i wzmacnianie odpowiedzi zapalnych¹². Jako suwerenny lek w YGP, CC może rozgrzewać yang, wspierać qi i odblokowywać meridiany, wywołując korzystne efekty terapeutyczne na SONFH¹³. Niemniej jednak dokładne mechanizmy leżące u podstaw jej skuteczności pozostają niejasne. Wyjaśnienie wielocelowej sieci regulacyjnej, którą CC wykorzystuje do poprawy SONFH, nie tylko pomogłoby zrozumieć jego farmakologiczny charakter, ale także zachęciłoby do rozsądnego zastosowania klinicznego i tworzenia powiązanych środków poprawy. Integracja bioinformatyki z farmakologią sieciową zapewnia skuteczne podejście do wyjaśniania mechanizmów działania¹⁴.

Farmakologia sieciowa może identyfikować bioaktywne składniki ziół i przewidywać powiązania między tymi składnikami leku a celami genowymi¹⁵. MD jest wykorzystywany do weryfikacji interakcji wiązań między kandydatami na związki aktywne a kluczowymi celami terapeutycznymi. Dynamika molekularna wykorzystuje mechanikę Newtona do oceny stabilności i elastyczności wiązania ligand-receptor za pomocą symulacji ruchu¹⁶. Autorzy kompleksowo badali potencjalne efekty CC na SONFH, wykorzystując farmakologię sieci, MD oraz symulacje dynamiki molekularnej. Wyniki stanowią punkt odniesienia do przyszłych, dogłębnych badań nad farmakodynamicznymi podstawami materiałowymi CC w zakresie poprawy SONFH. Schemat blokowy badania przedstawiono na Rysunku 1.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Zhejiang (IACUC-20240708-22) i zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych wydanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia. W tym eksperymencie użyto dwudziestu dziesięciotygodniowych samic myszy C57BL/6J o wadze od 20 do 22 g. Myszy te pozyskano z centrum zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang. Zobacz Tabelę materiałów , aby znaleźć listę wszystkich odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

Przesiewowe badania związków aktywnych i celów CC
Związki chemiczne CC zostały zidentyfikowane za pomocą Herb 2.0¹⁷ za pomocą słowa kluczowego "CC". Chemikalia bez identyfikatora PubChem lub o tym samym identyfikatorze zostały odfiltrowane. Następnie połącz i usuń duplikaty, aby uzyskać docelowe miejsca odpowiadające CC. Przeprowadź wstępne przesiewanie z bazą danych PubChem¹⁸ według zasady pięciu Lipińskiego (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Autorzy korzystają z bazy danych PubChem do określenia reprezentacji SMILES dla każdego związku chemicznego. Korzystając z bazy danych SwissADME, autorzy wybierają związki z ograniczeniem "wysokiego" wchłaniania przewodu pokarmowego oraz ≥2 wartości "Tak" w Druglikeness²⁰. Wykorzystaj bazę danych Swiss-Target Prediction²¹ do wyodrębnienia białek docelowych o prawdopodobieństwie wyższym niż zero. Następnie połącz i usuń duplikaty, aby uzyskać docelowe miejsca odpowiadające CC.

Kompilacja celów genowych związanych z SONFH
Cele związane z SONFH pozyskano z baz danych: baza DisGeNET²²; baza danych GeneCards²³; OMIM database²⁴ oraz GEO^{database 25}. Autorzy pobrali i zdeduplikowali geny SONFH z baz danych OMIM i DisGeNET. Łącznie 233 cele związane z chorobą uzyskano z bazy GeneCards po usunięciu duplikatów. Wszystkie odzyskane cele miały wskaźniki relewancji wyższe niż 0 i zostały uwzględnione w kolejnych analizach. Minimalny wynik relewancji wśród odzyskanych genów wyniósł 6,48. Geny różnicowo ekspresyjne (DEG) związane z SONFH zostały uzyskane z serii GSE123568 na platformie GPL15207 w bazie danych GEO. Efekty grupowe zostały skorygowane za pomocą pakietu limma w R, a geny różnicowo ekspresyjne (DEG) zidentyfikowano według kryteriów |logFC| > 1 i P < 0,05²⁶. Pakiet ggplot2 został wykorzystany do stworzenia wykresu wulkanicznego do wizualizacji rozkładu DEG, a następnie sporządzono mapę cieplną prezentującą wyniki. Biblioteka celów SONFH powstała poprzez usunięcie zduplikowanych celów za pomocą pakietu Venn w języku R.

Utworzenie sieci PPI
Na podstawie przewidywanych celów aktywnych komponentów celów związanych z CC i SONFH, Venny 2.1.0²⁷ stworzył diagram Venna. W celu uzyskania danych PPI autorzy zaimportowali cele do bazy danych STRING²⁸. Ograniczeniem kryterium przesiewowego organizmu był "Homo sapiens" o indeksie ufności ≥0,4. Autorzy wykorzystali Cytoscape 3.7.2 do ustalenia kluczowych celów sieci PPI. Centralność stopnia (DC) została wykorzystana do analizy kluczowych celów sieci PPI. Filtr parametrów jest ponad dwukrotnie większy niż mediana. Aby precyzyjniej określić kluczowe cele, zastosowano dodatek do Cytoscape.

Analizy wzbogacania przeprowadzono przy użyciu ontologii genów (GO) oraz baz danych Encyklopedii genów i Genomów z Kioto (KEGG)
Wspólne cele CC i SONFH zostały przeanalizowane pod kątem analiz wzbogacenia GO i KEGG za pomocą bazy danych DAVID²⁹. Aby zobrazować 10 najważniejszych terminów GO oraz 20 najlepszych ścieżek KEGG, do narysowania wykresu bąbelkowego kropki wzbogacenia użyto Wei^{Sheng Xin 30} .

Budowa sieci
Molekularne mechanizmy CC w łagodzeniu SONFH zostały wyjaśnione za pomocą sieci zioło-związek-cel (H-C-T) oraz związk-cel-szlak (C-T-P). Oprogramowanie Cytoscape 3.10.3 ilustrowało te sieci. Sieć H-C-T została opracowana z wykorzystaniem aktywnych związków z CC i ich wspólnych celów. Następnie użyj narzędzia Analizuj Sieci. Aby lepiej zrozumieć zależności między szlakami, związkami i celami, 20 najważniejszych szlaków wraz z powiązanymi celami i związkami zostało zorganizowanych w sieć C-T-P przez Network Tools.

Weryfikacja MD
Główne cele: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 i EGFR zostały uzyskane na podstawie analizy PPI. Cel został przeszukany przez bazę danych Uniport³¹ z ograniczeniem ludzkim i przejrzany przez bazę danych RCSB PDB³². Wybrano ludzkie struktury białkowe o stosunkowo wysokiej rozdzielczości. Składniki aktywne zostały zidentyfikowane z sieci C-T-P. Odpowiadające im struktury 3D zostały pobrane w formacie mol2 z bazy danych PubChem. Każdy plik został otwarty w Chem3D i zminimalizowany energią. Następnie autorzy użyli oprogramowania AutoDockTools³³ do przeprowadzenia odwodnienia, uwodornienia i obliczenia ładunków Gasteigera białka receptorowego. Zarówno ligandy, jak i receptory były przechowywane w formacie PDBQT. Na podstawie lokalizacji przestrzennej i zdolności wiązania autorzy oceniają wykonalność i stabilność dokowania. Za pomocą AutoDock Vina przewidziano siatkę dokowania i makrocząsteczkę. W tych badaniach wszystkie obrotowe wiązania ligandu mogły swobodnie się obracać, podczas gdy receptory były ustawione jako sztywne. Wynik dokowania wskazuje na powinowactwa wiązania między receptorem a ligandem; Im niższy wynik, tym większa więź. Zgodnie z tą zasadą autorzy wybierają konformacje o najbardziej korzystnej energii wiązania, aby zbadać interakcje wiązania ligandów z białkami. Efekty wizualne zostały zaprezentowane przez PyMOL.

Symulacja dynamiki molekularnej
Symulacje dynamiki molekularnej przeprowadzono przy użyciu GROMACS³⁴ z CHARMM36 polem siłowym. Kompleks białko-ligand został skoncentrowany w sześciennym pudełku symulacyjnym okresowym o minimalnej odległości między pudełkiem rozpuszczonym 1,0 nm, a system rozwiązano za pomocą modelu wodnego SPC216. System został zneutralizowany przez dodanie odpowiednich kontrionów Na⁺ i Cl⁻. Minimalizacja energii była przeprowadzana sekwencyjnie za pomocą algorytmu najstromszego opadania, a następnie metody sprzężonego gradientu, aby usunąć niekorzystne kontakty atomowe. Dalekosiężne oddziaływania elektrostatyczne obliczono metodą siatki cząstek Ewalda (PME) z odległością odcięcia 10 Å. Wszystkie wiązania kowalencyjne z atomami wodoru zostały ograniczone za pomocą algorytmu LINCS. Temperatura była utrzymywana na poziomie 300 K za pomocą termostatu V-rescale, a ciśnienie regulowano na 1 bar za pomocą barostatu Berendsena z izotropowym sprzężeniem izotropowym. Na ligand zastosowano ograniczenia pozycyjne ze stałą siły 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² podczas fazy równowagi. Po minimalizacji energii system został wyrównany za pomocą symulacji NVT o długości 2 ns i 2 ns NPT, a następnie symulacji dynamiki molekularnej produkcji o długości 100 ns z krokiem czasowym 2 fs. Współrzędne atomowe były rejestrowane co 10 ps do dalszej analizy trajektorii.

Walidacja eksperymentalna w modelu myszy SONFH
Zwierzęta i modelowe osadnictwo SONFH
Dwadzieścia samic myszy C57BL/6J, w wieku 10 tygodni i ważących od 20 do 22 g, pozyskano z centrum zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang. Myszy przeszły 7-dniowy okres aklimatyzacji w kontrolowanym środowisku i miały nieograniczony dostęp do jedzenia i wody. Wszystkie myszy zostały losowo przydzielone do grup (n = 5 na grupę): grupy kontrolnej, grupy SONFH, grupy SONFH + CC niskodawkowej (CC-Low, 7,5 g/kg/d) oraz grupy SONFH + CC wysokiej dawki (CC-High, 15 g/kg/d). Model SONFH został ustanowiony zgodnie z opisaniem wcześniej. Krótko mówiąc, myszy z grup SONFH, SONFH + CC-Low oraz SONFH + CC-High otrzymały dwa dożylne zastrzyki lipopolisacharydu (LPS; 20 μg/kg) w dniu 0. Następnie podano trzy intramięśniowe zastrzyki metyloprednizolonu (MPS; 40 mg/kg) co 24 godziny, rozpoczynając się 24 godziny po iniekcjach LPS. Myszom w grupach leczonych podawano ekstrakt CC doustnie przez 6 tygodni, począwszy od dnia ostatniego zastrzyku MPS. Myszy z grupy kontrolnej otrzymały równoważne objętości soli fizjologicznej w odpowiednich momentach.

Pobieranie próbek i przygotowanie
Po 6-tygodniowym okresie leczenia myszy zostały uśpione. Obustronne głowy kości udowej zostały starannie rozcięte i pobrane. Dla każdego zwierzęcia lewa główka kości udowej była utrwalona przez 48 godzin w temperaturze 4 °C, co umożliwiło dalszą dewaccyfikację i osadzenie parafiny. Prawy główek kości udowej został naprawiony, a następnie bezpośrednio użyty do badania mikro-CT bez odwapnienia.

Analiza histologiczna (barwienie ABH)
Po odwapnieniu i osadzeniu parafiny, przekroje głowy kości udowej zostały zabarwione protokołem Alcian Blue/Hematoxylin (ABH) w celu oceny zmian związanych z martwicą kościową. Krótko przekroje barwiono 1% błękitem alcyjskim (pH 2,5) przez 30 minut, płukano, a następnie kontrbarwiono hematoksyliną Harrisa. Po odwodnieniu i montażu preparaty były obrazowane pod mikroskopem świetlnym. Ilościowe określenie martwicy kostnotycznej przeprowadzono przez dwóch oślepionych obserwatorów przy użyciu oprogramowania ImageJ. Stosunek pustych pękł obliczono jako (liczba pustych pękłek/całkowita liczba braków) × 100% w trzech losowo wybranych polach o wysokiej mocy na próbkę w obrębie obszaru podchrząsniowego. Stosunek jąder pignotycznych został wyznaczony podobnie.

Analiza mikrotomografii komputerowej (Micro-CT)
Trójwymiarowa mikrostruktura kości głowy kości udowej została przeanalizowana za pomocą wysokorozdzielczego mikro-tomografa komputerowego. Stałe próbki skanowano z rozdzielczością 10 μm (70 kV, 114 μA). Zrekonstruowano i przeanalizowano ustandaryzowaną sferyczną objętość zainteresowania (VOI) obejmującą główny obszar nośny za pomocą oprogramowania CTAn. Zidentyfikowano następujące parametry morfometryczne: objętość kości/objętość całkowita (BV/TV), grubość trabekularnej (Tb.Th) oraz rozdzielenie trawekłu (Tb.Sp).

Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
Aby ocenić mikrośrodowisko kości, wykonano barwienie immunofluorescencyjne na przekrojach parafiny. Po pobraniu i blokowaniu antygenów sekcje były wysybywane przez noc w temperaturze 4 °C z następującymi głównymi przeciwciałami: króliczym anty-HIF-1α (1:200), króliczym anty-ALP (1:300) oraz króliczym anty-VEGF (1:150). Po przemyciu sekcje inkubowano mieszaniną przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluoroforem: anty-króliczego IgG znakowanego przez kozy Alexa Fluor 488, anty-króliczego IgG znakowanego przez kozy Alexa Fluor 555. Jądra były barwione DAPI. Obrazy były wykonywane mikroskopem fluorescencyjnym przy stałych ustawieniach ekspozycji. Względna intensywność fluorescencji dla każdego markera była ilościowano za pomocą oprogramowania ImageJ w trzech polach na próbkę.

Analiza statystyczna
Wszystkie dane ilościowe przedstawiane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya, została przeprowadzona za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (wersja 9.0) w celu określenia istotności statystycznej między grupami. Wartość P poniżej 0,05 uznano za statystycznie istotną.

Wyniki

Identyfikacja aktywnych komponentów i przewidywanych celów CC oraz rozwój sieci "H-C-T".
Aby zbadać mechanizmy kluczowych komponentów i celów CC w amelioracji SONFH, autorzy wykorzystali bazę danych HERB 2.0 do identyfikacji wszystkich przesiewanych komponentów CC. Spośród 209 kandydatów na aktywne składniki CC (Tabela Uzupełniająca 1) wykryto 85 prawdopodobnych związków bioaktywnych. Korzystając z platformy Swiss Target Prediction i eliminując duplikaty i nieprawidłowe wpisy, uzyskano 563 potencjalne cele odpowiadające tym komponentom CC (Tabela Uzupełniająca 2). Autorzy zidentyfikowali aktywne składniki i cele CC.

Badanie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w rozwój i postęp SONFH oraz identyfikacja potencjalnych celów biomarkerów. Analiza GSE123568 zbioru danych w bazie GEO zidentyfikowała DEG powiązane z SONFH, w tym 207 genów zwiększonej i 216 obniżonej regulacji. Wykres wulkanu 425 DEG przedstawiono na Rysunku 2A, natomiast wzorce ekspresji górnych 60 DEG uszeregowane według poziomu ekspresji przedstawiono jako mapę cieplną na Rysunku 2B, gdzie intensywność koloru odzwierciedla wartości wyrażenia przekształcone logarytmicznie. Bazy danych DisGeNET, OMIM i GeneCards dostarczyły 711 celów powiązanych z SONFH. Łącząc 425 DEG z bazy danych GEO, łącznie 1136 celów jest powiązanych z SONFH. Po eliminacji duplikatów potwierdzono 1115 celów związanych z SONFH, jak pokazano na Rysunku 2C. Autorzy wstępnie ustanowili bibliotekę docelową chorób dla SONFH.

Aby zidentyfikować cele i komponenty podstawowe, analiza przecięcia między 563 celami CC a 1115 celami powiązanymi z SONFH wykazała 61 wspólnych celów (Rysunek 3A i Tabela Uzupełniająca 3), które zostały włączone do Cytoscape 3.10.3 w celu budowy sieci "H-C-T" (Rysunek 3B). Sieć ta składała się ze 147 węzłów i 413 krawędzi. Analiza topologiczna wykazała, że (s)-4-nonanolid (stopień:16), izohomogenol (stopień:15), octan nerylu (stopień:14), melilotokarpan A (stopień:14), 3-metoksycynamaldehyd (stopień:13) wykazywały najwyższą łączność z celami białkowymi.

Rozwój i ocena topologiczna sieci PPI.
Aby dalej badać cele CC w zakresie poprawy SONFH. Cytoscape 3.10.3 był używany do przeglądania sieci PPI po umieszczeniu 61 identycznych celów w bazie STRING. W sieci było 463 krawędzi i 60 węzłów. Na Rysunku 4A węzły przechodzą kolorem i rozmiarem od jaśniejszych i mniejszych do ciemniejszych i większych, co wskazuje na wzrost stopnia od niskiego do wysokiego. Wtyczka MCODE ułatwiała klastrzenie tych celów w dwa moduły funkcjonalne (rysunek 4A), z których klaster 1 zawierał 23 węzły i 216 krawędzi, z wynikiem 19,636. Aby lepiej scharakteryzować architekturę sieci, jako metryki topologiczne użyto DC, BC i CC. Przy ustawieniu mediany tych parametrów jako punktów granicznych, autorzy zidentyfikowali 8 aktywnych celów (Rysunek 4B). Wtyczka CytoHubba wykorzystywała algorytm MCC do szeregowania węzłów, identyfikując 10 najlepszych genów. (Rysunek 4C).

Analiza wzbogacania GO
Aby dalej zbadać mechanizmy CC w poprawie ONFH, przeprowadzono analizę wzbogacenia GO na 61 potencjalnych celach, wykorzystując BP, CC i MF. Łącznie wzbogacono 435 semestrów GO, w tym 293 terminy BP, 41 semestrów CC i 101 semestrów MF. Wyniki te przedstawiono w Tabelach Uzupełniających 4, 5 i 6. Rysunek 5A wizualnie przedstawia 10 najwyżej wzbogaconych składników BP, CC i MF za pomocą wykresu bąbelkowego. Wyniki wskazywały, że wyrazy BP były głównie związane z transdukcją sygnału, dodatnią regulacją transkrypcji przez polimerazę RNA II, negatywną regulacją procesu apoptotycznego, dodatnią regulacją transkrypcji opartej na szablonie DNA oraz negatywną regulacją transkrypcji przez polimerazę RNA II. Analiza wykazała, że składniki MF były głównie zaangażowane w wiązanie białek, wiązanie jonów metali oraz identyczne wiązanie białek. Wyniki CC wykazały, że większość celów znajdowała się głównie w cytoplazmie, błonie i błonie plazmatycznej.

Analiza KEGG
Aby dostarczyć informacji o potencjalnych mechanizmach biochemicznych, dzięki którym CC może poprawić SONFH, przeprowadzono analizę wzbogacenia szlaku KEGG, aby wyjaśnić mechanizmy biochemiczne, dzięki którym CC może łagodzić SONFH. Korzystając z kryterium przesiewowego P < 0,05 i FDR < 0,05, zidentyfikowano 48 wpisów wzbogacających KEGG (Tabela Uzupełniająca 7). 20 najwyżej znacząco wzbogaconych szlaków, określonych przez wzbogacenie fałdów i liczbę, zostało zwizualizowanych za pomocą wykresów bąbelkowych i słupkowych (Tabela 1, Rysunek 5B i 5C). Korzystając z Cytoscape 3.10.3, zbudowano sieć C-T-P z 167 węzłami i 589 krawędziami (rysunek 5D). Wpływ CC na SONFH jest głównie powiązany z zakażeniem mięsakiem Kaposi wirusem opryszczki, szlakiem sygnalizacyjnym HIF-1 oraz lipidami i miażdżycą, co potwierdzają analizy funkcjonalne GO i wzbogacenia szlaku KEGG.

Weryfikacja MD
Aby ocenić potencjalne interakcje między aktywnymi związkami a kluczowymi celami, 10 związków z sieci C-T-P, w tym anetyl, melilotokarpan A, acetan nerylu, kwas kaprylowy, izohomogenol, 3-metoksycynamaldehyd, (s)-4-nanolid, mirystycyna, borneol i octan cynamylu, zostało połączonych z kluczowymi celami AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC i EGFR. Pełne wyniki dokowania dla wszystkich par złożonych–cel są podsumowane w Tabeli Uzupełniającej 8, a szczegółowe informacje o związkach, celach i parametrach dokowania zawarte są w Tabeli Uzupełniającej 9. Rysunek 6 przedstawia mapę ciepła rozkładu energii wiązania.

Ogólnie rzecz biorąc, kilka par złożony-cel wykazywało stosunkowo korzystne powinowactwa wiązania, przy czym niższe wartości energii wiązania wskazywały na bardziej stabilne przewidywane interakcje. Warto zauważyć, że wyniki dokowania wykazały wyraźną heterogeniczność powinowactw wiązań zarówno między związkami, jak i celami. Niektóre związki, takie jak melilotokarpan A, konsekwentnie wykazywały stosunkowo silne powinowactwa wiązawcze na wielu celach, podczas gdy inne wykazywały bardziej umiarkowane lub słabe interakcje, co sugeruje, że różne związki mogą nierówno przyczyniać się do przewidywanych efektów farmakologicznych.

Ponadto zaobserwowano zmienność między celami. Na przykład niektóre cele, takie jak STAT3 i EGFR, wykazywały stosunkowo umiarkowane lub słabe powinowactwa wiązania z wieloma związkami, z niektórymi wartościami zbliżającymi się do -5,0 kcal/mol, w porównaniu do celów takich jak AKT1 czy SRC. Ten wzorzec wskazuje, że nie wszystkie główne cele muszą pełnić funkcję bezpośrednich partnerów wiążących o wysokiej afinitecie zidentyfikowanych związków i mogą pełnić pośrednie role regulacyjne w sieci interakcji. Takie różnice mogą być związane z różnicami w zgodności strukturalnej między ligandami a miejscami wiązania białek, a także z wrodzonymi cechami celów.

Spośród ocenianych par AKT1 wykazał najniższą energię wiązania z melotokarpanem A (-9,6 kcal/mol), co sugeruje potencjalnie korzystną interakcję. Rysunek 7 ilustruje przewidywany tryb wiązania tego kompleksu. Konkretnie, SER205 z AKT1 tworzy wiązania wodorowe z melotokarpanem A, anetołką i mirystycyną. Ponadto przewidywano, że melotokarpan A będzie tworzył wiązania wodorowe z GLY309 z HIF-1α, LEU438 i THR440 ze STAT3, SER433 i ARG412 z ESR1 oraz ARG500 i GLU510 z SRC.

Aby zidentyfikować reprezentatywne związki kandydatów, użyto najniższej energii wiązania dla każdego celu oraz ustalono próg energii wiązania ≤ -5,0 kcal/mol, aby wskazać na stosunkowo stabilne interakcje. Na podstawie tych kryteriów zidentyfikowano melotokarpan A, anetol i mirystycyna jako potencjalne kluczowe związki. Ogólnie rzecz biorąc, większość aktywnych składników CC wykazywała potencjalne interakcje z wybranymi celami terapeutycznymi, przy czym niektóre związki wykazywały stosunkowo silniejsze trendy wiązania w wielu celach. Należy jednak zauważyć, że MD to uproszczone podejście obliczeniowe, które dostarcza wstępnych prognoz potencjalnych interakcji i może nie uwzględniać w pełni elastyczności białek oraz złożonych środowisk biologicznych. Dlatego te wyniki należy interpretować ostrożnie, a obserwowane interakcje nie stanowią ostatecznego dowodu na bezpośrednie wiązanie.

Symulacja dynamiki molekularnej
Aby dokładniej ocenić stabilność kompleksów, autorzy wybrali kompleksy AKT1-melilotokarpan A, HIF-1α-melilotokarpan A oraz STAT3-melilotokarpan A do symulacji dynamiki molekularnej. Wśród przewidywanych celów wybrano STAT3 i HIF-1α do symulacji MD na podstawie ich centralnej roli w sieci PPI oraz biologicznego znaczenia dla patologii SONFH. STAT3 wykazał jeden z najwyższych stopni łączności w sieci PPI, co wskazuje na potencjalną rolę regulacyjną w wielu szlakach sygnalizacji. HIF-1α został wybrany, ponieważ analiza wzbogacenia KEGG zidentyfikowała szlak sygnalizacyjny HIF-1 jako jeden z najważniejszych szlaków związanych z angiogenezą i adaptacją do hipoksji w osteonekrozie.

Jednocześnie autorzy skupili się na AKT1 jako reprezentatywnym celu ze względu na jego silne wyniki dokowania oraz bezpośrednie znaczenie dla cech patologicznych SONFH, szczególnie angiogenezy wywołanej przez hipoksję i regeneracji kości. Ze względu na ograniczenia zasobów obliczeniowych wybrano trzy reprezentatywne kompleksy do szczegółowych symulacji MD, co jest powszechnie stosowaną strategią w badaniach molekularnych symulacji opartych na farmakologii sieciowej. Średnie odchylenie kwadratowe (RMSD) skutecznie ocenia stabilność konformacyjną kompleksów białko-ligand, gdzie niższe wartości wskazują na większą stabilność strukturalną. Jak pokazano na Rysunku 8A, kompleks AKT1-melilotokarpanu A zakończył relaksację w ciągu pierwszych 12 ns i następnie osiągnął stabilny plateau, z jedynie przejściowymi wahaniami obserwowanymi w ciągu około 50-55 ns, po czym szybko wrócił do równowagi. Całkowity przepływ RMSD podczas symulacji wynosił około 0,369 nm. Rysunek 8B ilustruje, że kompleks HIF1A-melilotokarpanu A przeszedł rozluźnienie w ciągu pierwszych 16 ns, po czym nastąpiło utrzymanie stabilnego płaskowyżu. Wystąpiła krótka fluktuacja między 38 a 42 ns, po czym zaobserwowano szybkie przywrócenie stabilizacji. Całkowite RMSD dla tego kompleksu wynosiło 0,25 nm. Na Rysunku 8C kompleks STAT3-melilotokarpanu A przeszedł rozluźnienie w ciągu 0,3 ns, a następnie osiągnął stabilny plateau. Krótka wahania występowała między 5 ns a 80 ns. Całkowita symulacja wynosiła około 0,21 nm. Jak pokazano w The AKT1-melilotocarpan A, kompleksy HIF-1α-melilotokarpan A oraz STAT3-melilotokarpan utrzymywały stabilność bez znaczących zmian, co wskazuje na stosunkowo stabilną kombinację.

Elastyczność reszt aminokwasowych w białkach oceniano za pomocą fluktuacji średniej kwadratowej (RMSF). Rysunek 9A, średnia globalna fluktuacja reszt wynosiła około 0,17 nm, co sugeruje, że stabilność była utrzymywana głównie przez strukturalne jądro i kieszeń wiązającą. Większa elastyczność była w dużej mierze ograniczona do obszarów wewnętrznie ruchomych, takich jak segmenty końcowe i obszary pętli, a nie do rdzenia kieszonkowego. Powszechnie wiadomo, że te regiony są elastyczne z natury. Rysunek 9B pokazuje, że około 94% reszt wykazywało wartości RMSF poniżej 0,20 nm, a tylko około 6% przekraczało 0,30 nm, co wskazuje, że całkowity szkielet białka i reszty wewnętrzne wahały się w stabilnym zakresie. Rysunek 9C pokazuje, że średnia globalna reszta wynosiła około 0,17 nm. W danych nie zidentyfikowano fluktuacji przekraczających 0,15 nm, co wskazuje, że kieszeń wiązania utrzymywała stabilną konformację przez cały czas symulacji. Wykazano, że zarówno kompleksy AKT1-melilotokarpanu A, jak i HIF-1α-melilotokarpanu A oddziałują silnie i stabilnie.

Wiązania wodorowe są kluczowe dla wspierania interakcji białko-ligand. Rysunek 10A pokazuje, że kompleksy AKT1-melilotokarpanu A zazwyczaj tworzyły jedno wiązanie wodorowe, a liczba wiązań wodorowych wahała się od 0 do 2. Między melilotokarpanem A a HIF-1α oddalone są o mniej niż 0,35 nm. AKT1 często wchodzi w interakcje w pobliżu melotokarpanu A. Kompleksy HIF-1α-melilotokarpanu A tworzą od 0 do 2 wiązań wodorowych, głównie jedno wiązanie wodorowe, jak pokazano na rysunku 10B. Na rysunku 10 C liczba wiązań wodorowych kompleksu STAT3-melilotokarpanu A wynosi od zera do czterech. Najczęściej atomy A pomiędzy melilotokarpanem A a HIF-1α są oddalone o mniej niż 0,35 nm. Kompleksy HIF-1α-melilotokarpanu A ustanawiają 1-3 pary bliskich kontaktów, a czasem nawet 7-9 par. Sugeruje to skuteczne interakcje wiązań wodorowych między małą cząsteczką a białkami docelowymi. Podsumowując, zarówno kompleksy AKT1-melilotokarpan A, jak i HIF-1α-melilotokarpan A wykazują stabilność i wytrzymałość.

CC hamuje reakcję zapalną i apoptozę myszy SONFH
Analiza histologiczna z użyciem barwienia ABH wykazała wyraźne zmiany osteomartyzujące w grupie SONFH, charakteryzujące się zwiększonym pękłem pustymi, jądrami piętnymi oraz zaburzeniami architektury trawekowej, podczas gdy te cechy patologiczne zostały wyraźnie złagodzone po leczeniu CC (Rysunek 11A). Analiza ilościowa potwierdziła, że stosunek pustych luk i jąder pignotycznych był istotnie zmniejszony w grupach leczonych CC w porównaniu z grupą SONFH (Rysunek 11B–C). Analiza mikro-tomografii komputerowej wykazała poważną utratę kości trabekularnej w grupie SONFH, która została częściowo zniwelowana przez podanie CC (rysunek 11D). Konsekwentnie leczenie CC znacząco zwiększało BV/TV i TB. Przy jednoczesnym zmniejszaniu Tb.Sp względem grupy SONFH (Rysunek 11E–G). Barwienie immunofluorescencyjne wykazało podwyższoną ekspresję HIF-1α oraz obniżony poziom ALP w grupie SONFH, wraz ze zmianą ekspresji VEGF. Leczenie CC modulowało ekspresję HIF-1α i VEGF oraz wzmacniało sygnały ALP, co wskazuje na poprawę mikrośrodowiska kostnego i aktywności osteogennej (Rysunek 11H).

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zbiory danych użyte lub przeanalizowane podczas obecnego badania są dostępne pod linkiem: https://zenodo.org/records/19730455.

Rysunek 1: Schemat przepływowy strategii badań farmakologii sieciowej dla poprawy CC w SONFH. Rysunek 1 pokazuje, że badanie wskazuje potencjalne cele aktywnych składników CC z bazy danych, przy czym SONFH jest chorobą podstawową. Po połączeniu tych z celami związanymi z chorobą, skonstruowano sieć "komponent–cel–szlak" oraz terminy GO, KEGG. Następnie stosuje się dokowanie molekularne i symulację dynamiki molekularnej do oceny powinowactwa wiązań między kluczowymi komponentami a celami rdzeniowymi, a ostateczne potwierdzenie przeprowadza się poprzez weryfikację eksperymentalną. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Przesiewowe przesiewowe cele związane z SONFH. (A) Wykres wulkanu przedstawiający rozkład genów różnicowo ekspresowanych w próbkach chorobowych. Czerwone punkty oznaczają geny o zwykłej regulacji, niebieskie oznaczają obniżenie aktywacji, a szare punkty oznaczają geny o braku istotnej różnicy ekspresji. (B) Mapa ciepła pokazująca wzorce ekspresji 60 genów różnicowo ekspresowanych, z kolumnami odpowiadającymi próbkom i wierszami odpowiadającymi genom. (C) Diagram Venna pokazujący nakładanie się celów związanych z chorobą uzyskanych z różnych baz danych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Przesiewowe przesiewowe cele przecinające się między CC a SONFH. (A) Diagram Venna ilustrujący rozkład 61 wspólnych celów dzielonych pomiędzy przewidywanymi celami związków aktywnych w CC (żółty) i chorobowych związanych z SONFH (fioletowy). (B) Sieć Zioło-Związk-Cel (H-C-T) ilustruje interakcje między związkami a odpowiadającymi im celami. Niebieski kwadratowy węzeł oznacza chorobę, zielone kwadratowe oznaczają aktywne związki, a pomarańczowe kwadratowe oznaczają wspólne cele. Krawędzie oznaczają interakcje między związkami a ich celami. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Identyfikacja kandydata na cel poprzez analizę PPI. (A) Sieć PPI klastrowana z wtyczką MCODE. (B) Schematyczny przepływ pracy topologicznego przesiewania w sieci PPI. (C) Geny kluczowe wyodrębniane z sieci PPI za pomocą wtyczki CytoHubba. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Wyniki analizy wzbogacenia GO oraz analiza wzbogacenia szlaku KEGG dla 61 wspólnych celów. (A) Wykres bańkowy przedstawiający 10 najważniejszych terminów analizy wzbogacania GO dla BP, CC i MF. (B) Wykres bańków przedstawiający 20 najwyżej wzbogaconych szlaków KEGG. (C) Rozkład 20 najwyżej wzbogaconych szlaków na podstawie klasyfikacji funkcjonalnej KEGG. (D) Ilustracyjna sieć C-T-P ukazująca potencjalne mechanizmy, dzięki którym CC może poprawić martwicę głowicy kości udowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Mapa ciepła energii wiązania interakcji między aktywnymi związkami CC a kluczowymi celami (kcal/mol). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Tryby wiązania kluczowych celów z konkretnymi związkami aktywnymi. AKT1-melilotokarpan A (A1), HIF-1α-melilotokarpan A (B1), STAT3-melilotokarpan A (C1), ESR1-melilotokarpan A (D1), CASP3-melilotokarpan A (E1), SRC-melilotokarpan A (F1), EGFR-melilotokarpan A (G1), AKT1-anetohola (H1), AKT1-myristotyna (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) i (H2) ilustrują odpowiednio swoje tryby wiązania 2D. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 8: RMSD wartości MD. (A) RMSD dla kompleksów AKT1-Melilotokarpanu A. (B) Wartości RMSD kompleksów HIF-1α-Melilotokarpana A. (C) Wartości RMSD kompleksów STAT3-Melilotokarpanu A. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 9: RMSF MD. (A) Wartości RMSF kompleksów AKT1-melilotokarpanu A. (B) Wartości RMSF kompleksów HIF-1α-Melilotokarpanu A. (C) Wartości RMSF kompleksów STAT3-Melilotokarpan A. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 10: Wiązania H w MD. (A) Wartości wiązań H kompleksów AKT1-melilotokarpanu A. (B) Wartości wiązań H kompleksów HIF1A-Melilotokarpanu A. (C) Wartości wiązań H kompleksów AKT1-Melilotokarpan. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 11: CC hamuje odpowiedź zapalną i apoptozę w głowie kości udowej, poprawiając tym samym SONFH. (A) Reprezentatywne sekcje głowy udowej zabarwione ABH. Puste luki oznaczają czarne groty strzał, a jądra pignotyczne strzałkami. (B–C) Analiza ilościowa stosunku pustych luk (B) i liczby jąder pignotycznych (C). n = 5. (D) Reprezentatywne trójwymiarowe mikro-tomografie głow kości udowej. (E–G) Ilościowa analiza parametrów mikro-CT, w tym frakcji objętości kości (BV/TV), rozdzielenia traweka (Tb.Sp) oraz grubości traweka (Tb.Th). (H) Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne HIF-1α, VEGF i ALP w przekrojach głowy kości udowej; jądra były barwione DAPI. Dane przedstawiane są jako średnia ± SD (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Kadencja		Wzbogacenie fałdów	Wartość P	Hrabia	ID użytkowników
Rak pęcherza moczowego		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NO2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
Szlak sygnalizacyjny HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
Oporność na inhibitor tyrozyny EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1,CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
Węzeł Adherens		12.54	1.64E-05	7	CREBBP, ABCB1, CASP3, ERBB2, STAT3, PDCD4, EP300, PTGS2, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA
Oporność hormonalna		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NR 2,NR 3,ERBB2,STAT3, SERPINE1, EP300, HIF1A, EGFR, MTOR, VEGFA
Szlak sygnalizacyjny AGE-RAGE w powikłaniach cukrzycowych		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Proteoglikany w nowotworach		11.43	1.19E-10	14	CXCL8, SRC, NOS3, CASP3, STAT3, PPARG, MMP9, BCL2L1, NFE2L2
Szlak sygnalizacji relaksyny		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NO2,NO3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
Zakażenie mięsakiem Kaposi związane z wirusem opryszczki		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
Szlak sygnalizacyjny hormonów tarczycy		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
Naprężenia ścinania płynu i miażdżyca		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
Wirusowe zapalenie wątroby typu B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP, STAT3, EP300, PTPN6, TYK2, EGFR, MTOR, BCL2L1
Szlak sygnalizacyjny JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
Zakażenie ludzkim cytomegalowirusem		7.34	6.2E-06	10	CREBBP, CASP3, EP300, TYK2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Lipidy i miażdżyca		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
MikroRNA w nowotworach		6.25	2.06E-06	12	CREBBP, SRC, ERBB2, EP300, PTPN6, PTPRF, EGFR
Chemiczna rakotwórczość – aktywacja receptorów		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
Szlaki w nowotworach		5.94	6.64E-10	19	CXCL8, NO3, CASP3, MMP2, STAT3, SERPINE1, VEGFA
Szlak sygnalizacji wapnia		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego		4.00	0.00324	8	SRC,NOS3,MMP2,KDR,MMP9,NFE2L2,VEGFA

Tabela 1: Wyniki wzbogacania KEGG dla 20 najlepszych wzbogaconych ścieżek.

Tabela uzupełniająca 1: Podstawowe informacje o związkach aktywnych w CC.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Cele 85 aktywnych składników w CC.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Informacje o 61 wspólnych celach CC-SONFH.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Wyniki terminów kategorii procesów biologicznych z analizy wzbogacenia GO.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Wyniki kategoryzacji składników komórkowych z analizy wzbogacania GO.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 6: Wyniki terminów kategorii funkcji molekularnych z analizy wzbogacenia GO.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 7: Wyniki szlaków z analizy wzbogacenia KEGG.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 8: Energie wiązania dokowania molekularnego (kcal/mol) par złożony-cel.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 9: Szczegóły dotyczące celów i komponentów do dokowania molekularnego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym badaniu autorzy pozyskali 85 związków bioaktywnych z CC za pośrednictwem kilku baz danych i przeprowadzili badania przesiewowe, wśród których główne składniki chemiczne to anetoł, melilotokarpan A oraz myristicyna. Aby zidentyfikować cele, autorzy przecięli 563 cele CC leków z 1116 celami związanymi z SONFH, ostatecznie uzyskując 61 celów. Autorzy zaimportowali 61 wspólnych celów do baz danych STRING i DAVID, aby zbudować sieć PPI i zbadać możliwe szlaki farmakologiczne. Wyniki ujawniły 10 kluczowych celów w sieci PPI, w tym HIF-1α i STAT3. Niedokrwienie i niedotlenienie to dwie główne cechy patogenne SONFH, według wcześniejszych badań³⁵. CC może wywierać pozytywne efekty w SONFH poprzez wiele procesów biologicznych, w tym angiogenezę i regulację transkrypcyjną. Można to osiągnąć poprzez szlak sygnalizacyjny HIF-1α, naprężenie ścinające płyny i miażdżycę, lipidy i miażdżycę, szlak sygnalizacyjny AGE-RAGE w powikłaniach cukrzycowych oraz inne szlaki sygnalizacyjne, według analizy wzbogacenia KEGG. Sugeruje to, że CC może działać na SONFH poprzez te kluczowe cele i powiązane szlaki. Aby dodatkowo wyjaśnić, czy składniki CC są ściśle powiązane z celami, opierając się na powyższych wynikach badań farmakologii sieci, czyli wynikach przesiewowych aktywnych składników przepisanego związku oraz wyników przesiewowych celów w sieci PPI, autorzy przeprowadzili symulacje dynamiki molekularnej melotokarpanu A-AKT1, melotokarpanu A-HIF-1α, oraz kompleksy STAT3-melilotokarpanowe. Pokazuje to, że melilotokarpan A wiąże się stabilnie z AKT1, HIF-1α i STAT3, więc CC może rzeczywiście wywierać pozytywne efekty, działając na te kluczowe cele. Podsumowując, dzięki mechanizmowi wieloskładnikowym, wielocelowym i wieloszlakowym, CC może wywierać ochronny wpływ na jakość życia pacjentów z SONFH.

Grupa badawcza koncentruje się na wyjaśnieniu mechanizmów, dzięki którym YGP wywierają efekt terapeutyczny w chorobach związanych z kośćmi. Poprzednie badania wskazywały, że YGP zwiększają formowanie kości i poprawiają mikroarchitekturę trabekularną w głowie kości udowej poprzez aktywację β-kateniny, która hamuje osteoklastogenezę i wspiera osteogenezę podczas królika SONFH³⁶. Ponadto naukowcy odkryli, że YGP wywierają terapeutyczne działanie na SONFH przede wszystkim poprzez łagodzenie stanu zapalnego i wspieranie angiogenezy¹². YGP mogą nie tylko łagodzić SONFH, ale także poprawiać osteoporozę. Poprzez hamowanie szlaku sygnalizacyjnego IL-17/NF-κB i zmniejszenie odpowiedzi immunologicznych Th17, YGP skutecznie zatrzymują utratę kości wywołaną przez owarianektomię³⁷. Dzięki eksperymentom na zwierzętach naukowcy potwierdzili, że Cornus officinalis, jeden ze składników YGP, działa na SONFH poprzez hamowanie wydzielania mediatorów zapalnych oraz apoptozy komórek kostnych³⁸. CC, które może rozgrzewać yang i wspierać qi oraz odblokowywać meridiany, jest głównym ziołem w YGP, odgrywając kluczową rolę w poprawie SONFH i łagodzeniu cierpienia pacjentów. Podsumowując, badania te odzwierciedlają długoletnie skupienie na wyjaśnieniu mechanizmów YGP w osteonekrozie oraz na wskazaniu CC jako głównej zioły wartej mechanistycznych badań w SONFH.

Wśród przewidywanych składników aktywnych anetylka, myristicyna i inne składniki wykazują aktywność biologiczną przeciwko chorobom związanym z kośćmi. Wykazano, że anetylka hamuje podnoszenie markerów resorpcji kości. Anetyl ostatecznie ogranicza różnicowanie osteoklastu i funkcję resorpcyjną poprzez hamowanie dalszych szlaków i kluczowych czynników regulacyjnych³⁹. Badania wskazują, że anetołka wykazuje właściwości przeciwzapalne i hamuje adipogeniczną różnicowanie w ludzkich komórkach macierzystych szpiku kostnego (hBMSC)⁴⁰. Mirystycyna hamuje stan zapalny i chroni komórki mięśni gładkich naczyń poprzez hamowanie szlaków PI3K/Akt i NF-κB⁴¹. Ferroptoza jest jednym z kluczowych mechanizmów leżących u podstaw patogenezy SONFH. Ferroptoza to rodzaj zaprogramowanej śmierci komórkowej spowodowanej peroksydacją lipidów zależną od żelaza. Mirystycyna zapobiega ferroptozie, chroniąc tym samym homeostazę redoksową błon komórkowych osteoblastów⁴². Pozostałym składnikiem borneolu potwierdzono, że hamuje tworzenie pierścieni aktynowej, co jest cechą resorbujących osteoklasty odzwierciedlającą polaryzację komórek, w ciągu 30 minut^{i 43 minut}. Wyniki te wskazują, że te składniki mogą być bardzo istotne dla ochronnego efektu CC w SONFH i zasługują na dalsze badania. Spośród wszystkich tych składników Melilotokarpan A został wybrany jako ligand reprezentacyjny, ponieważ wykazywał najbardziej stabilne powinowactwa wiązania z wieloma głównymi celami w analizie MD. Wśród najwyżej ocenianych związków Melilotokarpan A wykazywał konsekwentnie silne interakcje wiązania z kilkoma kluczowymi białkami w sieci PPI, co sugeruje, że może stanowić główny bioaktywny składnik CC.

Ponadto wyniki sieci PPI ujawniły, że szczególnie HIF-1α i STAT3 mogą być głównymi celami. HIF-1α jest centralnym mediatorem komórkowej odpowiedzi na hipoksję. W eksperymentach SONFH aktywacja HIF-1α zwiększa angiogenezę i naprawę kości, tym samym łagodząc martwicę głowy kości^{udowej 44}. Dodatkowo badania wykazały, że HIF-1α może wywierać ochronny wpływ na tkankę chrząstki w warunkach hipoksyjnych⁴⁵. Zwiększenie regulacji HIF-1α hamuje ferroptozę i aktywuje STAT3, aby przyspieszyć różnicowanie monocytów szpiku kostnego do osteoklastu⁴⁶. STAT3 jest aktywatorem transdukcji i transkrypcji sygnału. HBMSC sprzyja konwersji STAT3 do p-STAT3, tym samym wzmacniając proliferację, migrację i działanie antyapoptotyczne chondrocytów w warunkach hipoksycznych⁴⁷. STAT3 zwiększa zróżnicowanie osteogenne i działanie antyapoptotyczne hBMSC, jednocześnie zwiększając wydzielanie ich czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), co sprzyja regeneracji mikronaczyń kostnych⁴⁸. AKT1 to kinaza białkowa, która pełni rolę kluczowego mediatora sygnalizacji angiogenezy. AKT1 bierze udział w sprzężeniu angiogenezy kości z osteogenezą oraz w formowaniu kości trawekowej⁴⁹. Podsumowując, te cele hubowe łączą się pod względem angiogenezy, adaptacji do hipoksji, stanu zapalnego i remodelacji kości, co sugeruje, że CC może wywierać działanie ochronne przeciwko SONFH poprzez modulację tych celów i powiązanych szlaków sygnalizacyjnych.

Aby zbadać mechanizm CC w poprawie SONFH, badacze przeprowadzili analizę GO oraz analizę wzbogacenia KEGG. Wyniki GO pokazują, że geny docelowe są głównie wzbogacone w funkcje biologiczne, takie jak reakcja na hipoksję, komórkowa odpowiedź na lipopolisacharyd oraz pozytywna regulacja angiogenezy. Analiza wzbogacenia KEGG sugerowała, że farmakologiczne efekty CC w SONFH są głównie powiązane ze szlakiem sygnalizacji AGE-RAGE w powikłaniach cukrzycowych, szlakiem sygnalizacyjnym HIF-1α, lipidami i miażdżycą oraz innymi szlakami sygnalizacyjnymi. SONFH występuje, gdy przepływ krwi do głowy kości udowej zostaje przerwany, co prowadzi do braku wsparcia żywieniowego dla głowy kości udowej i wywołuje apoptozę komórek⁵⁰. HIF-1 składa się z HIF-1α i HIF-1β, przy czym HIF-1α odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi transkrypcyjnej na środowiska hipoksyczne i niedokrwienne⁴⁷. Wcześniejsze badania wykazały, że poprzez kaskadę sygnalizacji VEGF/AKT/mTOR HIF-1α koordynuje osteogenezę i angiogenezę, co krytycznie zwiększa różnicowanie osteogenne komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu. Po wystąpieniu niedokrwienia rozwija się niedotlenienie tkankowe, prowadzące do wyraźnego wzrostu HIF-1α wewnątrz komórek. co zwiększa poziom ekspresji VEGF, a w konsekwencji wspiera naprawę i regenerację naczyń⁵¹. Hipoksja zakłóca produkcję energii mitochondrialnej i zwiększa powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS). Zmiany te sprzyjają osteoklasogenezie, hamują aktywność osteoblastów i ostatecznie wywołują apoptozę osteocytów. Wysoka ekspresja HIF-1α przesuwa metabolizm energii komórkowy z fosforylacji oksydacyjnej na glikolizę, zmniejsza produkcję ROS, a tym samym tłumi apoptozę w osteoblastach i osteocytach^52,53. Kość gniecikowata wspiera funkcję hematopoetyczną szpiku kostnego i magazynuje minerały, takie jak wapń. Zwiększona aktywność HIF-1α może bezpośrednio zwiększyć formowanie się kości gębkowatej⁵⁴. Dodatkowo HIF-1α utrzymuje przeżywalność i homeostazę chondrocytów w warunkach hipoksycznych⁴⁵. W konsekwencji szlak sygnalizacyjny HIF-1α stał się celem terapeutycznym dla ONFH, z potencjalnym zastosowaniem terapeutycznym dla ONFH.

W szlaku sygnalizacji AGE-RAGE zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE) powstają w wyniku nieenzymatycznego kowalencyjnego sieciowania węglowodanów z białkami, tłuszczami lub innymi makrocząsteczkami biologicznymi⁵⁵. AGE mogą uszkadzać komórki i tkanki poprzez uszkodzenia zapalne i utleniające. Poprzez cztery ścieżki sygnały są przenoszone przez interakcję AGE-RAGE. Są to: 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK oraz (4) oksydaza NADPH-ROS⁵⁶. Ostatecznie fosforylowany NF-κB trafia do jądra, aby transkrybować ekspresję prozapalnych cytokin, czynników wzrostu, cytokin profibrotycznych oraz stresu oksydacyjnego. Badanie wykazało, że AGE-RAGE sprzyja apoptozie osteoblastów poprzez szlak sygnalizacyjny MAPK oraz aktywację stresu oksydacyjnego, a także hamuje różnicowanie osteogenowe poprzez tłumienie poziomów czujników stresu siatkaczki endoplazmatycznej, a także poprzez metylację DNA/szlak Wnt⁵⁷. Ponadto badania wykazały, że AGE i RAGE biorą udział w zwapnieniu naczyń⁵⁸.

W szlaku sygnalizacji lipidów i miażdżycy utlenione lipidy aktywują PPARγ. Jest głównym regulatorem adipogenezy, który hamuje różnicowanie osteogenne⁵⁹. Ponadto kilka badań wykazało, że lipidy wpływają na różnicowanie i dojrzewanie osteoklastu i osteoblastów, zaburzając tym samym homeostazę kości⁶⁰. Wiele badań podstawowych wykazało istotne zaangażowanie apoptozy w mechanizmy fizjologiczne i patologiczne SONFH. Kolejne eksperymenty na zwierzętach in vivo dodatkowo potwierdziły, że aktywna frakcja CC skutecznie tłumi apoptozę i stan zapalny w SONFH, co hamuje postęp choroby.

Zgodnie z tymi wynikami, farmakologia sieciowa i analizy eksperymentalne sugerują, że CC może poprawić SONFH poprzez koordynację adaptacji do hipoksji, regulację angiogenezy oraz modulację procesów metabolicznych. Ilościowa analiza mikro-tomografii wykazała, że interwencja CC istotnie przywróciła frakcję objętości kości (BV/TV), zmniejszyła rozdzielenie trawekłu (Tb.Sp, Tb.Th) oraz sprzyjała odbudowie mikrostruktury kości. Analiza wzbogacenia KEGG dodatkowo podkreśliła szlak sygnalizacji HIF-1α jako kluczowy mechanizm leżący u podstaw tych efektów. Łącznie te eksperymenty na zwierzętach wskazują, że CC może łagodzić SONFH poprzez regulację procesów biologicznych związanych z hipoksją i zapaleniem oraz promowanie angiogenezy i przebudowy kości, potencjalnie poprzez kluczowe szlaki, takie jak szlak sygnalizacyjny HIF-1α.

Chociaż uzyskano pewne ważne wstępne ustalenia, badanie to nadal ma pewne ograniczenia. Autorzy opierali się wyłącznie na nowoczesnych metodach bioinformatycznych, w tym farmakologii sieciowej i MD, a także na niektórych eksperymentach na zwierzętach, aby zbadać rolę CC w SONFH. Dlatego wiarygodność i dokładność prognoz muszą być dodatkowo weryfikowane w eksperymentach in vivo oraz in vitro . Badanie to dostarcza wstępnych wskazówek dotyczących mechanizmów, dzięki którym CC łagodzi SONFH, co wymaga dalszej weryfikacji eksperymentalnej. Integrując farmakologię sieciową z MD, autorzy systematycznie mapowali kandydatów na bioaktywne składniki, kluczowe cele oraz wzbogacone szlaki CC w SONFH. Podsumowując, badanie to badało potencjalne ochronne efekty CC w SONFH poprzez integratywną farmakologię sieciową oraz walidację in vivo . Wyniki wskazują, że mechanizmy te były przede wszystkim związane z modulacją szlaku sygnalizacyjnego HIF-1 oraz promowaniem regeneracji osteogennej. Jak ilustruje odpowiadający ilustrator, poprawa CC istotnie modulowała ekspresję kluczowych białek, w tym HIF-1α, VEGF i ALP, w sposób zależny od dawki, co dodatkowo wspiera jego rolę w koordynacji adaptacji do hipoksji, angiogenezy i aktywności osteogennej. Wyniki te potwierdziła analiza mikro-CT, która wykazała, że interwencja CC skutecznie przywróciła frakcję objętości kości i poprawiła mikrostrukturę trabekularną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% PFA	biosharp	BL539A
Absolutny ethenol	Grupa Sinopharm Co.Ltd	10009218
Zestaw do bejcy Alcian Blue	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Badania Scripps		Wersja 1.2.7
AutoDockTools	Badania Scripps		Wersja 1.5.7
Platforma online bioinformatyki			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 pole siłowe			Wykorzystywane do parametryzacji MD
CTD			https://ctdbase.org
Cytoscape	Konsorcjum Cytoscape		Wersja 3.10.3; wtyczki: CytoHubba, CytoNCA
Roztwór barwienia DAPI	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Wizualizacja dokowania
DisGeNET			https://disgenet.com
Dekalcyfikacja EDTA	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Endogenny roztwór blokujący nadoksydazę	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
kozi antykrólik IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Serum koziego	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		Wersja 10; Analiza statystyczna i wykresy
GROMACOWIE	GROMACOWIE		Wersja 2022; CHARMM36 pole siłowe
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	Hangzhou Huaan	HA721997
Sprzęt mikro-CT o wysokiej rozdzielczości	Bruker	SkyScan
Filtr reguły Lipińskiego			Mw ≤ 500; miLogP ≤ 5; HBD ≤ 5; HBA ≤ 10
lipopolisacharyd	Sigma-Aldrich	L4516
Metyloprednizolon	Grupa Sinopharm Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Balsam neutralny	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Parafina	Grupa Sinopharm Co.Ltd	C416770020
Siatka cząsteczkowa Ewalda (PME)			Elektrostatyczność dalekiego zasięgu
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö Uderzenie		Wizualizacja i przygotowanie białek
R	CRAN		Wersja 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Szwajcarski Instytut		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Szwajcarski Instytut		http://www.swisstargetprediction.ch
Model wody TIP3P			Używane do solvacji
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Wykorzystywane do przetwarzania danych, dokowania molekularnego oraz symulacji MD
Ksylen	Grupa Sinopharm Co.Ltd	10023418