Izolacja, synteza i charakteryzacja CD47- i integrin α4/β1–zmodyfikowanych makrofagów pokrytych membraną (mlekowo-ko-glikolowy) nanocząstek

Summary

Protokół ten umożliwia przygotowanie i charakteryzację CD47- i integrinowych α4/β1–komodyfikowanych makrofagów pokrytych membraną (kwas ko-glikolowy) nanocząstek do zastosowań ukierunkowanych na dostarczanie leków.

Abstract

Miażdżyca to przewlekła choroba zapalna i główny czynnik przyczyniający się do zachorowalności i śmiertelności układu krążenia. Ukierunkowane podawanie środków przeciwzapalnych do miejsc miażdżycowych pozostaje istotnym wyzwaniem. Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania i charakteryzacji CD47- i integrinowych α4/β1–współmodyfikowanych makrofagów pokrytych błoną kolchicyną (nanocząsteczek MMM/CO-glikolowych) nanocząstek (MMM/COL NP). Protokół obejmuje modyfikację makrofagów poprzez transfekcję plazmidów i stymulację endotelin-1, izolację błony, wytwarzanie NP oraz powłokę błonową. Uzyskane wartości NP MMM/COL są oceniane za pomocą charakterystyki fizykochemicznej, analizy ekspresji białek oraz testów in vitro i in vivo . Walidacja funkcjonalna obejmuje ocenę powiązania komórkowego z aktywowanymi komórkami śródbłonka, pobieranie makrofagów, działanie przeciwzapalne w komórkach piankowych oraz biodystrybucję w modelu myszy miażdżycy. Dodatkowo podkreślane są kluczowe parametry eksperymentalne i kroki kontroli jakości, aby zapewnić powtarzalność i spójność w różnych laboratoriach. Protokół ten zapewnia solidne i skalowalne podejście do generowania biomimetycznych NP do ukierunkowanych zastosowań podawania leków w badaniach nad miażdżycą.

Introduction

Miażdżyca to przewlekła choroba zapalna, która prowadzi do śmiertelnych zdarzeń sercowo-naczyniowych i udaru poprzez stenozę światła tętnicy i niestabilne pęknięcie płytki, co stanowi znaczące globalne obciążenie zdrowotne ^1,2,3. Zmniejszenie regulacji odpowiedzi zapalnych w miejscu miażdżycowym jest głównym celem terapeutycznym ^4,5. Kolchicyna, silny lek przeciwzapalny, wykazała obiecujące możliwości w ograniczaniu niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych ^6,7. Jednak jego użyteczność kliniczna jest ograniczona przez wąskie okno terapeutyczne i ogólnoustrojowe skutki uboczne, co wymaga ukierunkowanych systemów dostarczania w celu zwiększenia gromadzenia się w miejscu płytki przy jednoczesnym minimalizowaniu toksyczności⁸.

Nanocząstki pokryte błoną komórkową (NP) stały się potężną platformą do celowanego dostarczania leków, wykorzystując naturalne funkcje biologiczne komórek źródłowych ^9,10,11. Wśród typów komórek zaangażowanych w miażdżycę makrofagi odgrywają kluczową rolę 12,13,14. Integryna α4/β1, wyrażana na makrofagach, pośredniczy w rekrutacji do blaszek miażdżycowych poprzez wiązanie się z cząsteczką adhezji komórek-naczyniowej-1 (VCAM-1) eksprimowaną na aktywowanych komórkach śródbłonka (EC). CD47, sygnał "nie jedz mnie", umożliwia uniknięcie fagocytozy przez układ monojądrowy fagocytów^15,16. Poprzez inżynierię membran makrofagów tak, aby nadekspresowały te białka w porównaniu z natywnymi błonami makrofagowymi, można tworzyć NP z lepszym celowaniem dzięki interakcji integrin α4/β1–VCAM-1 oraz zmniejszonej fagocytozie dzięki sygnalizacji CD47⁶. Strategia podwójnej modyfikacji ulepsza natywne membranowe NP oraz systemy celowania oparte na ligandach, jednocześnie wzmacniając celowanie na aktywowane EC i zmniejszając oddzielenie fagocytów. W przeciwieństwie do natywnych makrofagów, które wyrażają jedynie podstawowe poziomy tych białek, nasza inżynieryjna membrana zapewnia zwiększoną funkcjonalność bez wprowadzania syntetycznych ligandów celujących, które mogą wywołać immunogenność.

Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie i charakterystykę NP (COL NP) obciążonych kolchicyną (COL NPs) pokrytych membranami makrofagów CD47- i integrinowymi α4/β1–komodyfikowanymi, generując zmodyfikowane makrofagi pokryte błoną (NP MMM/COL). Opisujemy metody modyfikacji genetycznej i farmakologicznej makrofagów RAW 264.7, izolację zmodyfikowanych błon, przygotowanie i powlekanie NP PLGA oraz kompleksowe testy funkcjonalne in vitro i in vivo . Metoda ta zapewnia powtarzalne ramy do przygotowania i oceny biomimetycznych NP do zastosowań celowanego podawania leków w badaniach nad miażdżycą.

Protocol

Wszystkie procedury zwierzęce opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Drum Tower w Nankinie i zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych ustanowionymi przez Narodowe Instytuty Zdrowia.

1. Modyfikacja makrofagów RAW 264.7

1. Przygotuj komórki RAW 264,7, uzupełnij Dulbecco Modified Eagle Medium uzupełnione o 10% surowicę płodową bydła (FBS) i 1% penicylin-streptomycynę, plazmid nadekspresji CD47, reagent transfekcyjny Lipofectamine 3000, endotelin-1 (ET-1), sól fizjologiczną buforowaną fosforanową (PBS) oraz materiały do hodowli tkanek sterylnych.
2. Hodować komórki RAW 264,7 w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C z zawartością 5% CO₂ i utrzymywać komórki do momentu, gdy osiągną około 4–5 × 10^{5 komórek} na dołek w płytkach 6-dołkow.
3. Wykonaj modyfikację CD47
   1. Przygotuj roztwór DNA plazmidowego, mieszając 2,5 μg DNA plazmidowego z 5 μL odczynnika P3000 w medium wolnym od surowicy Opti-MEM o pojemności 125 μL.
   2. Przygotuj roztwór odczynnika transfekcyjnego, rozcieńczając 3,75 μL odczynnika transfekcyjnego w 125 μL medium wolnego od surowicy.
   3. Użyj tych woluminów do formatu płyty 6-dołkowej. Skaluj wszystkie składniki proporcjonalnie dla innych formatów, utrzymując stosunek DNA:P3000 1:2 (μg:μL) oraz stosunek odczynników DNA:transfekcja 1:1,5 (μg:μL).
      UWAGA: Na przykład do talerzy o średnicy 10 cm należy użyć 10 μg DNA, 20 μL P3000 oraz 15 μL odczynnika transfekcyjnego.
   4. Połącz roztwór DNA z roztworem odczynnika transfekcyjnego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 25°C.
   5. Dodaj kompleksy transfekcyjne do komórek w DMEM wolnym od antybiotyków, uzupełnionym 10% FBS w ilości około 2–2,5 × 10^{6 komórek} na naczynie o średnicy 10 cm.
   6. Zamień podłoże na świeże, kompletne pożywki zawierające antybiotyki 6 godzin po transfekcji.
4. Wykonaj modyfikację integryny α4/β1
   1. Stymulować komórki transfekowane lub nietransfekowane 100 nM ET-1 w medium wolnym od surowicy przez 24 godziny, aby zwiększyć ekspresję integriny α4/β1.
      UWAGA: Zweryfikować efektywność modyfikacji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) oraz analizy Western blot dla CD47, integriny α4 i integriny β1.

2. Izolacja zmodyfikowanej błony makrofagowej (MMM)

1. Zmodyfikowane komórki RAW 264.7 pozyskaj za pomocą skrobaka komórek.
2. Wiruj ogniwa w 900 × g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
3. Umyj pellet komórkowy trzy razy zimnym 1× PBS.
4. Ponownie zawiesz pellet komórkowy w 2 mL wcześniej schłodzonego buforu hipotonicznego (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 i 1 mM fenylometylosulfonylowofluorku) i inkubuj zawiesinę na lodzie przez 15 minut.
5. Zamroź zawiesinę w ciekłym azocie na 2 minuty, a następnie rozmroź w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 5 minut. Powtórz cykl zamrażania i rozmrażania pięć razy, aby całkowicie zlizować komórki.
   UWAGA: Ciekły azot może powodować poważne kriogeniczne oparzenia. Obchodzić się z odpowiednimi rękawicami izolacyjnymi i ochroną twarzy.
6. Wiruj lizat w dawce 850 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C, aby usunąć jądra i nieuszkodzone komórki.
7. Wirówka zebranego supernatantu w dawce 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Aby uzyskać wyższą czystość membrany, przenieś supernatant uzyskany po 15 000 × g wirowania do rurek ultrawirówek i wirować w 100 000 × g przez 1 godzinę w 4°C za pomocą ultrawirówki.
   UWAGA: Upewnij się, że rury ultrawirówek są odpowiednio wyważone i przystosowane do wirowania wysokiej prędkości, aby zapobiec nierównowadze lub awarii wirnika.
   UWAGA: Ultrawirowanie daje oczyszczone błony plazmatyczne z obniżonym zanieczyszczeniem organelli wewnątrzkomórkowymi.
8. Pobierz granulki zawierające fragmenty MMM i ponownie zawiesij je w 300 μL buforu 1× PBS lub lizy, aby uzyskać stężenie białka około 1–2 mg/mL.
9. Określ stężenie białka błonowego za pomocą zestawu do ilościowego testu BCA.
   UWAGA: Izolowane membrany można przechowywać w temperaturze −80°C do późniejszego użytku.

3. Przygotowanie NP PLGA (COL NPs) z kolchicyną

1. Rozpuścić 10 mg PLGA (50:50, MW 90 000) oraz 1 mg kolchicyny w 1 ml dimetylosulfoklenku (DMSO).
   UWAGA: DMSO może przenikać skórę i zwiększać wchłanianie innych substancji. Podczas obchodzenia się z nimi należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i gogle ochronne). Zbieraj roztwory zawierające DMSO jako organiczne rozpuszczalniki i utylizuj je za pośrednictwem licencjonowanych usług utylizacji odpadów niebezpiecznych. Kolchicyna jest toksyczna i potencjalnie teratogenna. Zbierać wszystkie materiały skażone kolchicyną (roztwory, rękawiczki i tubki) jako niebezpieczne odpady farmaceutyczne i utylizować je za pośrednictwem licencjonowanych usług utylizacji odpadów niebezpiecznych zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
2. Mieszaj roztwór z częstotliwością 500 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego z batynem powlekanym teflonem o średnicy 10 mm w temperaturze 25°C.
3. Dodaj 4 mL ultraczystej wody kroplami o częstotliwości około 1 mL/min za pomocą pompki strzykawkowej wyposażonej w strzykawkę 5 mL i igłę 26G w temperaturze 25°C.
4. Kontynuuj mieszankę przez 3 godziny, aby umożliwić powstanie NP.
5. Przenieś zawieszenie NP do worka dializacyjnego (MWCO 3 500 Da).
6. Dializuj przy 2 litrach destylowanej wody w temperaturze 4°C przy delikatnym mieszaniu przy 200 obr./min.
7. Kontynuuj dializę przez 24 godziny i całkowicie wymień bufor dializowy po 6, 12 i 24 godzinach, aby usunąć wolną kolchicynę i DMSO.
   UWAGA: Zbieraj wszystkie rozpuszczalniki organiczne i odczynniki, w tym te z dializ, jako organiczne odpady chemiczne. Nie wyrzucaj jej do odpływu. Przestrzegaj procedur utylizacji odpadów niebezpiecznych w instytucjach.
8. Pobierz zdializowaną zawieszkę COL NP i przechowuj ją w temperaturze 4°C.
   UWAGA: Środki Tlenu Węgla można przechowywać w temperaturze 4°C do krótkoterminowego użytku (do 3 dni). Do znakowania fluorescencyjnego włącz 0,1% barwnika 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetrametyloindokarbocyanin perchloranu (DiI) do roztworu PLGA podczas kroku 3.1.
9. Zweryfikować usunięcie DMSO i darmowej kolchicyny
   1. Pobierz ostatni dializat (bufor po ostatniej zmianie po 24 godzinach) i analizuj go za pomocą spektrofotometrii ultrafioletowo-widzialnej (UV–vis).
   2. Skanuj dializat od 200 do 400 nm i porównaj go z próbką kontrolną (świeży bufor dializy).
   3. Potwierdź, że nie występuje pik absorpcji przy około 210 nm (charakterystyczne dla DMSO) ani przy 345 nm (charakterystyczne dla kolchicyny), co wskazuje na skuteczne usunięcie resztkowego rozpuszczalnika i leku wolnego.
   4. Alternatywnie, można określić stężenie pozostałości DMSO za pomocą zestawu testowego DMSO zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że resztkowy DMSO jest poniżej 0,1% (v/v), aby uniknąć cytotoksyczności w dalszych testach.

4. Wytwarzanie membranowych NP (MM/COL)

1. Sonikować izolowaną zawiesinę MMM (od kroku 2,7) przez 20 minut za pomocą sonikatora w kąpieli wodnej o temperaturach 40 kHz i 110 W. Utrzymuj objętość próbki na poziomie 1 mL w probówce 1,5 mL i temperaturę poniżej 25°C, stosując kąpiel lodową w razie potrzeby.
2. Wytłaczaj sonikowaną zawiesinę błonową przez filtr membranowy poliwęglanowy o porach 400 nm za pomocą mini ekstrudera, aby utworzyć pęcherzyki błonowe.
3. Zmieszaj NP COL (od kroku 3.5) z pęcherzykami MMM w stosunku mas białka membranowego do PLGA 1:1.
   1. Użyj zawiesiny błonowej zawierającej 10 mg białka dla 10 mg PLGA, zgodnie z testem ilościowym białka.
   2. Delikatnie pipetuj NP COL z pęcherzykami MMM 15 razy w górę i w dół, używając pipety o pojemności 1 mL.
4. Wspólnie wytłaczaj mieszaninę przez filtr membranowy poliwęglanowy o porach 200 nm i powtarzaj wytłaczanie przez 15 przejść.
5. Zbierz powstałą zawiesinę zawierającą NP MMM/COL i przechowuj ją w temperaturze 4°C do natychmiastowego użycia.

5. Charakterystyka NP

1. Zmierz średnicę hydrodynamiczną, wskaźnik polidyspersji (PDI) oraz potencjał zeta za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) w następujących warunkach: temperatura, 25°C; kąt rozpraszania wstecznego, 173°; czas równowagi, 2 minuty; oraz trzy pomiary replikacyjne na próbkę.
2. Rozcieńcz próbki 20-krotnie w wodzie dejonizowanej (końcowe stężenie około 0,1 mg/mL).
   UWAGA: Rozcieńczenie minimalizuje efekty wielokrotnego rozpraszania.
3. Wizualizuj strukturę rdzeni–powłoka NP MMM/COL za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
   1. Umieść 5 μL zawiesiny NP (około 0,1 mg/mL) na miedzianą siatkę wyładowaną przez żar i pokrytą węglem (siatka 300).
   2. Pozwól próbce adsorbować przez 2 minuty w temperaturze 25°C.
   3. Usuń nadmiar płynu, delikatnie dotykając krawędzi kratki papierem filtracyjnym.
   4. Nałóż 5 μL roztworu octanu uranylu o stężeniu 1% na siatkę i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze 25°C.
   5. Usuń nadmiar bejc za pomocą papieru filtracyjnego.
   6. Pozwól kratce całkowicie wyschnąć na powietrzu przez co najmniej 10 minut przed wykonaniem obrazowania.
      UWAGA: Octan uranilu jest toksyczny i radioaktywny. Obchodzić się z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochrona oczu) oraz utylizować odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi materiałów niebezpiecznych.
4. Oznaczać błonę barwnikiem 3,3′-diokcylokoksakarbocyaniny (DiO) podczas kroku 2 lub oznaczając nienaruszone komórki przed izolacją błony, a rdzeń PLGA oznaczyć DiI.
5. Analizuj współlokalizację sygnałów DiO (zielony) i DiI (czerwony) za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej skanującej (CLSM).
   1. Ustaw parametry wzbudzenia/emisji następująco: DiO (zielona), wzbudzenie 488 nm, emisja 550 nm; DiI (czerwony), wzbudzenie 561 nm, emisja 620 nm.
   2. Użyj obiektywu immersyjnego o średnicy 60× oleju (przysłona numeryczna, 1,4).
   3. Ustaw otworek na 1 jednostkę Airy.
   4. Reguluj wzmocnienie detektora, aby uniknąć nasycenia pikseli.
   5. Pobieraj obrazy w rozdzielczości 1024 × 1024 pikseli ze średnią liniową 2×.
   6. Utrzymuj moc lasera poniżej 5%, aby zminimalizować fotobielenie.
6. Przeanalizuj obecność CD47, integriny α4 i integriny β1 na powierzchni MMM/COL NP za pomocą analizy Western blot.
7. Określenie załadunku i uwalniania leku
   1. Rozlew objętość NP o pojemności 100 μL w DMSO i mierzenie absorbancji kolchicyny przy 345 nm, aby określić ładowanie leku i efektywność enkapsulacji.
   2. Włóż 1 mL zawiesiny MMM/COL NP (zawierającej około 100 μg kolchicyny) do worka dializacyjnego (MWCO, 3 500 Da).
   3. Zamknij woreczek i zanurz go w 50 mL PBS (pH 7,4) zawierającego 20% FBS w szklanej zlewce o pojemności 100 mL.
   4. Utrzymuj medium uwalniającego na 37°C przy stałym mieszaniu przy 100 obr./min, używając mieszadła magnetycznego z 20 mm mieszanką pokrytą teflonem.
   5. Utrzymuj stan zlewu przez cały eksperyment.
      UWAGA: Rozpuszczalność kolchicyny w PBS przy 20% FBS wynosi >1 mg/mL; Maksymalne stężenie kolchicyny w ośrodku uwalniającym wynosi <10% nasycenia.
   6. W wyznaczonych punktach czasowych (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 i 62 h) pobierz 500 μL medium uwalniającego.
   7. Zamień pobraną objętość na równą ilość świeżego, podgrzanego PBS (37°C) zawierającego 20% FBS.
   8. Zmierz stężenie kolchicyny w pobranych próbkach za pomocą spektrofotometrii UV–Vis na 345 nm.
   9. Wszystkie pomiary wykonuj w trzech egzemplarzach.

6. Funkcjonalne testy in vitro

1. Nasiać ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Stymuluj komórki czynnikiem nekrotyzującym 10 ng/mL (TUNF-α) przez 24 godziny, aby zwiększyć poziom VCAM-1.
2. Komórkowe powiązanie NP MMM/DiI z HUVEC
   1. Inkubuj komórki z oznakowanymi DiI MM/COL NP (MMM/DiI NPs) w stężeniu 50 μg/mL (na podstawie masy rdzenia PLGA) przez 4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze z 5% CO₂.
   2. Umyj komórki trzy razy za pomocą schłodzonego PBS. Po każdym myciu wiruj ogniwa w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
   3. Ponownie zawiesij umyte komórki w PBS zawierające 0,5% surowicowej albuminy bydłej (BSA). Dostosuj końcowe stężenie komórek do 1× 10^{6 komórek} /mL.
   4. Ustaw parametry instrumentu dla cytometrii przepływowej lub CLSM. Wykrywaj fluorescencję DiI za pomocą wzbudzenia przy 549 nm i emisji przy 565 nm (kanał PE).
   5. Zbieraj dane z próbek. Pobierz co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę do cytometrii przepływowej lub uchoć reprezentatywne pola dla CLSM.
   6. Wybierz pięć reprezentatywnych pól na próbkę z różnych regionów, z wyłączeniem krawędzi, używając soczewki immersyjnej olejowej o średnicy 60×. Upewnij się, że komórki są nienaruszone i nie nakładają się na siebie.
   7. Przed akwizycją zaślepiaj próbki. Wybieraj pola, losowo przesuwając etap, zamiast ręcznie wybierać konkretne obszary.
   8. Zastosowanie identycznych parametrów progowych i analizy do wszystkich próbek w warunkach zaślepienia.
   9. Wyklucz odpadki komórkowe za pomocą bramek FSC-A/SSC-A. Wybierz komórki singletowe za pomocą bramki FSC-A/FSC-H.
   10. Wybieraj żywe komórki za pomocą barwienia żywotnego. Dodaj 7-aminoaktinomycynę D (7-AAD) w dawce 1 μg/mL, inkubuj przez 5 minut w temperaturze 4°C w ciemności i użyj do odkrycia komórek żywych.
   11. Przeanalizuj intensywność fluorescencji, aby ilościowo określić powiązania komórkowe. Użyj średniej intensywności fluorescencji jako metryki ilościowej. Przeprowadz analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej FlowJo (v10.8.1).
3. Komórkowe pobieranie NP MMM/DiI przez makrofagi RAW 264,7
   1. Inkubuj znakowane MM/COL NP (MMM/DiI NPs) z niezmodyfikowanymi makrofagami RAW 264,7 w stężeniu 50 μg/mL (na podstawie masy rdzenia PLGA) przez 4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze o zawartości 5% CO₂.
   2. Przygotuj komórki do analizy zgodnie z krokami 6.2.2–6.2.3.
   3. Ustaw parametry instrumentu do wykrywania DiI, wykorzystując wzbudzenie przy 549 nm i emisję przy 565 nm (kanał PE).
   4. Zbieraj dane z próbek. Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę.
   5. Wyklucz odpadki komórkowe za pomocą bramek FSC-A/SSC-A. Wybierz komórki singletowe za pomocą bramki FSC-A/FSC-H.
   6. Wybieraj żywe komórki za pomocą barwienia żywotnego. Dodaj 7-AAD w dawce 1 μg/mL, inkubuj przez 5 minut w temperaturze 4 °C w ciemności i użyj do aktywnego blokowania komórek.
   7. Analizuj intensywność fluorescencji, aby ilościowo określić pobieranie przez komórki. Użyj średniej intensywności fluorescencji jako metryki ilościowej. Przeprowadz analizę danych za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
4. Test komórek piankowych
   1. Różnicuj komórki RAW 264,7 w komórki piankowe poprzez inkubację z utlenioną lipoproteiną o niskiej gęstości (oxLDL) w stężeniu 50 μg/mL przez 48 godzin. Potwierdź powstawanie komórek piankowych poprzez barwienie Oil Red O, co wskazuje na nagromadzenie lipidów wewnątrzkomórkowych.
   2. Komórki piankowe traktuj wolną kolchicyną, NP COL lub NP MMM/COL przy równoważnym stężeniu kolchicyny 1 μM. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37°C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂.
      UWAGA: Wybierz to stężenie na podstawie wstępnych eksperymentów dawka–odpowiedź oceniających żywotność komórek i skuteczność przeciwzapalną.
   3. Zmierz poziom cytokiny zapalnej za pomocą enzymatycznego testu immunosorbentnego (ELISA).
      1. Pobierz supernatanty hodowli komórkowych bezpośrednio po leczeniu (24 godziny po zabiegu).
      2. Wiruj płytki w 300 × g przez 5 minut w 4°C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
      3. Przenieś klarowane supernatanty do czystych lamp i przechowywać w temperaturze −80°C do czasu analizy.
      4. Mierz poziomy TNF-α i interleukiny-6 za pomocą zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.
      5. Wszystkie pomiary wykonuj w potrójnych dołkach i powtarzaj eksperyment trzy niezależne razy.
      6. Podawaj stężenia cytokin jako wartości bezwzględne (pg/mL) bez dodatkowej normalizacji, ponieważ gęstość zasiewów komórkowych i warunki leczenia są spójne we wszystkich grupach.

7. Terapeutyczne zastosowanie in vivo w modelu miażdżycy

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach muszą zostać zatwierdzone przez odpowiednią Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Ustalenie modelu zwierzęcego
   1. Ustalenie podatnego modelu płytki miażdżycowej u 8-tygodniowych samców myszy z knockoutem apolipoproteinowym E (ApoE⁻/⁻) (tło C57BL/6).
   2. Karm myszy dietą wysokotłuszczową zawierającą 15% tłuszczu i 0,25% cholesterolu przez tydzień przed operacją i kontynuuj przez 4 tygodnie po zabiegu.
   3. Znieczulanie myszy izofluranem (2%–3% podczas indukcji i 1,5%–2% w trybie podtrzymującym) oraz podawanie buprenorfiny (0,1 mg/kg, podskórnie) w leczeniu przeciwbólowym podczas operacji zwężenia tętnicy szyjnej.
   4. Zwęż lewą tętnicę szyjną za pomocą igły o średnicy 0,3 mm umieszczonej obok tętnicy. Zawiąż jedwabną ligaturę 6-0 wokół tętnicy i igły, a następnie usuń igłę, aby uzyskać częściowe zwężenie.
   5. Potwierdzenie powstania podatnej płytki na 4 tygodnie po operacji poprzez ocenę histologiczną.
   6. Wykonaj barwienie hematoksyliny i eozyny (H&E), Oil Red O oraz barwienia trójchromowego Masson, aby ocenić morfologię płytki, osadzanie lipidów oraz zawartość kolagenu.
   7. Zdefiniuj wrażliwe płytki według powierzchni płytki > 40% przekroju poprzecznego naczynia, grubości włóknistej nasadki < 120 μm, powierzchni rdzenia lipidowego > 40% całkowitej powierzchni płytki oraz znacznej infiltracji makrofagów z dodatkiem CD68.
2. Wstrzyknąć 100 μL NP znakowanych DiI dożylnie przez żyłę ogonową w dawce 2 mg/kg (na podstawie masy rdzenia PLGA).
   1. Obrazowanie myszy 1 dzień po wstrzyknięciu za pomocą systemu obrazowania in vivo do oceny biodystrybucji całego ciała.
      1. Znieczulać myszy izofluranem (3% do indukcji i 1,5%–2% do utrzymania się, z przepływem tlenu odpowiednio 1 i 0,5 L/min). Monitoruj głębokość znieczulenia według częstości oddechu i odruchu szczypania palców.
      2. Umieść myszy na plecach na podgrzewanej stóli o temperaturze 37°C, aby utrzymać temperaturę ciała podczas obrazowania.
      3. Uzyskuj obrazy fluorescencyjne przy użyciu ustawień DiI (wzbudzenie 549 nm i emisja 565 nm) za pomocą zestawu filtrów CY3 lub TRITC. Stosuj tryb autoekspozycji (zazwyczaj 50–200 ms) oraz akwizycję epifluorescencji.
      4. Jednocześnie rejestrować odpowiadające obrazy w jasnym polu do odniesienia anatomicznego w rozdzielczości 1024 × 1024 pikseli.
   2. Pobranie głównych narządów i tętnic szyjnych do badania obrazowego fluorescencji ex vivo.
      1. Znieczulanie myszy izofluranem (3% podczas indukcji i 2,5%–3% dla podtrzymywania pacjentów).
      2. Przeprowadź myszy 20 mL lodowatego PBS (pH 7,4) przez nakłucie lewej komory z przepływem 5 mL/min, aby usunąć pozostałą krew i niezwiązane NP.
      3. Pobieranie narządów (serce, aortę, wątrobę, śledzionę, nerki i płuca) natychmiast po perfuzji, 24 godziny po wstrzyknięciu.
      4. Płucz pobrane organy lodowatym PBS, aby usunąć krew z powierzchni.
      5. Otwórz aortę podłużnie i przypiąć ją płasko (śródbłonka do góry) na czarnej silikonowej płycie za pomocą stalowych szpilek.
      6. Przechowywać tkanki w lodowatym PBS i wykonać badania fluorescencyjne ex vivo w ciągu 30 minut od pobrania. Usuń nadmiar PBS z powierzchni tkanki tuż przed wykonaniem obrazowania.
3. Przeprowadz dawkowanie i leczenie
   1. Określ dawkę kolchicyny na podstawie wstępnego badania dawka-odpowiedź (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/grupa). Wybierz dawkę terapeutyczną 0,05 mg/kg kolchicyny.
   2. Podaj 100 μL przez zastrzyk do żyły ogonowej, co odpowiada dawce NP 2 mg/kg (masa rdzenia PLGA) i dawce kolchicyny 0,05 mg/kg. Wstrzykuj raz dziennie przez 14 kolejnych dni.
   3. Losowo przydziel myszy do grup leczenia (PBS, wolna kolchicyna i NP MMM/COL) za pomocą generatora liczb losowych. Wszystkie ilościfikacje wykonują dwaj obserwatorzy nieświadomi grup leczenia.
   4. Stosuj humanitarne punkty końcowe, takie jak >20% utrata masy ciała, upośledzona sprawność ruchu lub oznaki stresu.
4. Wykonaj analizę punktów końcowych
   1. Uśpienie myszy 24 godziny po ostatnim zastrzyku. Pobierz tętnice szyjne i aortę. Oceń obciążenie blaszką nazębną poprzez barwienie aorty olejowo-czerwonej O.
   2. Ilościowo określ powierzchnię płytki
      1. Ilościowo określ powierzchnię płytki jako Oil Red O-dodatnia powierzchnia całkowitej powierzchni światła aorty w przekrojach (pięć sekcji na mysz) za pomocą oprogramowania do analizy obrazów.
      2. Otwórz obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu ImageJ.
      3. Kliknij Obraz → wpisz → 8-bitowy, aby przekonwertować obraz na skalę szarości.
      4. Kliknij obraz → dostosuj → próg. Wybierz metodę Otsu i zastosuj próg, aby zidentyfikować obszary olejowo-czerwone O-dodatnie.
      5. Stosuj te same parametry progowe do wszystkich przykładowych obrazów i zapisuj ustawienia progu do weryfikacji.
      6. Kliknij Analizuj → Ustaw pomiary i wybierz Obszar.
      7. Kliknij Analizuj → Mierz, aby ilościowo określić wybrane regiony.
      8. Eksportuj dane ilościowe.
   3. Ocena stabilności płytki nazębnej
      1. Oceń stabilność blaszki poprzez histologiczne barwienie przekrojów szyjnych za pomocą H&E, barwienia Oil Red O oraz barwienia trójchromowego Massona. Określ kolagen jako procent trójchromowo-dodatniego niebieskiego obszaru płytki Masson.
      2. Przygotować przekroje z parafiną o grubości 5 μm i optymalnej temperaturze cięcia – zamurowane sekcje o grubości 8 μm.
      3. Wykonaj barwienie H&E poprzez odparafinizowanie i nawilżenie fragmentów, następnie barwienie hematoksyliną przez 5 minut oraz barwienie eozyną przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Wykonaj barwienie Oil Red O na mrożonych fragmentach, inkubując roztworem roboczym Oil Red O przez 15 minut w RT. Rozróżnij sekcje w 60% izopropanolu przez 2 sekundy i spłukuj wodą destylowaną.
      5. Wykonaj barwienie trójchromowe Massona zgodnie z instrukcjami zestawu, inkubując sekcje z hematoksyliną Weigerta przez 10 minut, fuchsyną kwasu Ponceau przez 5 minut, kwasem fosfolibdowym przez 5 minut oraz błękitem anilinowym przez 5 minut w RT.
      6. Otwieraj obrazy histologiczne w oprogramowaniu do analizy obrazów.
      7. Zastosuj progi kolorowe, aby zidentyfikować obszary z kolagenem dodatnie. Wykonaj automatyczne progowanie i zastosuj te same parametry do wszystkich przykładowych obrazów.
      8. Zapisz ustawienia progów do weryfikacji.
      9. Zdefiniuj całkowitą powierzchnię blaszki jako sumę wszystkich obszarów blaszki wewnątrz naczyń intymnych.
      10. Mierz powierzchnię płytki, ręcznie śledząc jej granice lub stosując automatyczne segmentowanie progowe do identyfikacji wszystkich obszarów płytki.
      11. Zmierz obszar o wartości dodatniej na kolagen.
      12. Obliczaj zawartość kolagenu jako powierzchnię dodatnią kolagenu podzieloną przez całkowitą powierzchnię płytki × 100%.
   4. Ocena zawartości makrofagów
      1. Wykonaj barwienie immunofluorescencji CD68 w celu oceny zawartości makrofagów. Ilościowo określ zawartość makrofagów jako procent powierzchni płytki nazębnej o dodatnim poziomie CD68.
      2. Przygotuj przekroje tkanek (o grubości 5 μm dla sekcji z parafiną). Wykonaj pobieranie antygenów za pomocą buforu cytrynianowego (pH 6,0) pod wysokim ciśnieniem przez 2 minuty.
      3. Blokuj odcinki z 5% BSA przez 30 minut w RT.
      4. Inkubuj sekcje z króliczym przeciwmysim przeciwciałem przeciw myszom CD68 (klon D4B9C, rozcieńczenie 1:200 w 1% BSA) przez noc w temperaturze 4°C.
      5. Inkubuj sekcje przeciwciałem przeciw kozom IgG z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:500) przez 1 godzinę w RT.
      6. Koloruj jądra przeciwbarwne 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) przez 5 minut.
      7. Otwarte obrazy fluorescencji w oprogramowaniu do analizy obrazów.
      8. Zidentyfikuj obszary z dodatnim statusem CD68 za pomocą progowania. Wykonaj automatyczne progowanie i zastosuj te same parametry do wszystkich przykładowych obrazów.
      9. Zapisz ustawienia progów do weryfikacji.
      10. Zmierz obszar CD68 dodatni.
      11. Obliczaj zawartość makrofagów jako powierzchnię dodatnią na poziomie CD68 podzieloną przez całkowitą powierzchnię blaszki × 100%.

Results

Pomiary DLS wykonywano za pomocą systemu Zetasizer Nano ZS przy temperaturze 25°C i kącie rozpraszania wstecznego 173°. Próbki były rozcieńczane 20 razy w wodzie dejonizowanej (końcowe stężenie około 0,1 mg/mL) i wyrównywane przez 2 minuty przed pomiarem. Każda próbka była mierzona w trzech egzemplarzach, a wyniki przedstawiono jako średnią ± SD. DLS i TEM wykazują wzrost rozmiaru NP po powleknięciu błony i potwierdzają utworzenie struktury rdzeń–powłoka (Rysunek 1). Temperatury COL NP wykaz...

Discussion

Protokół ten zapewnia kompleksową metodę konstruowania i stosowania NP z membraną pokrytymi makrofagami z mikrofagów CD47 i integrin α4/β1–modyfikowanych do celowanej terapii miażdżycy. Główne zalety tego systemu to aktywne celowanie poprzez interakcję integriny α4/β1–VCAM-1 oraz zmniejszone pobieranie makrofagów związane z sygnalizacją CD47, co potwierdzają testy in vitro (rysunek 3) oraz wyniki biodystrybucji in vivo (rysunek 4). Zastosowanie zmodyfik...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoaktinomycyna D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (USA)	A1310	Barwnik żywotności do cytometrii przepływowej – rozróżnianie żywych/martwych
Alexa Fluor 488-sprzężony antykróliczy antykróliczy IgG	Thermo Fisher Scientific (USA)	A-11008	Przeciwciało wtórne do barwienia immunofluorescencji CD68
Przeciwciało przeciwmysze CD47	Abcam (USA)	ab214453	Wykorzystywany do analizy Western blot w celu weryfikacji ekspresji CD47
Integryna antymysza i alfa; Przeciwciała 4 (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-376334	Wykorzystywany do analizy Western blot w celu weryfikacji integriny i alfa; Ekspresja 4
Integryna antymysza i beta; 1 przeciwciało (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (USA)	SC-374429	Wykorzystywany do analizy Western blot w celu weryfikacji integriny i beta; Wyrażenie 1
ApoE-/- myszy	Laboratorium Jacksona (USA)	Nie ma	Stosowane w modelu miażdżycy in vivo
Zestaw do testowania BCA	Thermo Fisher Scientific (USA)	23225	Wykorzystywane do określania stężenia białka
płyta silikonowa	Nie ma	Nie ma	Używany do montażu aorty podczas obrazowania ex vivo
Plazmid CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Chiny)	G0177361-1	Zawiera myszy gen Cd47 do nadmiernej ekspresji
Kolchicyna	Sigma-Aldrich (USA)	C9754	Ładunek terapeutyczny w nanocząstkach
Konfokalny mikroskop laserowy skanujący	Leica Microsystems	TCS SP8	Wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego i analizy współlokalizacji
Bufor cytrynowy (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (USA)	Nie ma	Wykorzystywany do pobierania antygenów w barwieniu immunofluorescencyjnym
Rurki dializacyjne (MWCO 3 500 Da)	Sigma-Aldrich (USA)	PURD35030	Wykorzystywane do oczyszczania nanocząsteczek
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich (USA)	D2447	Rozpuszczalnik do przygotowania nanocząstek
DiI (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-nadchloran tetrametyloindokarbocyaniny)	Beyotime (Chiny)	C1036	Znakowanie fluorescencyjne rdzenia nanocząsteczkowego
DiO (3,3′-dioctadecyloxakarbocyanin nadchloran)	Beyotime (Chiny)	C1038	Znakowanie fluorescencyjne błony makrofagów
DiR	Beyotime (Chiny)	Y239280	Wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (USA)	D3571	Jądrowe barwienie przeciwbarwne do obrazowania fluorescencyjnego
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	11965092	Pożywka hodowla komórkowa
Dynamiczny analizator rozpraszania światła (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Wielka Brytania)	Nie ma	Wykorzystywany do pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS) wielkości nanocząstek, PDI i potencjału zeta
Zestaw ELISA	R& D Systems (USA)	To zależy od cytokiny docelowej	Wykorzystywane do ilościowego określania cytokin zapalnych
Endothelin-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (USA)	E7764	Używa się do stymulacji integriny i alfa; 4/β Wyrażenie 1
Serum bydła płodu (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, USA)	10091148	Suplement do pożywki do hodowli komórkowej
Cytometr przepływowy	BD Biosciences (USA)	FACSCalibur	Wykorzystywane do pozyskiwania sygnału fluorescencyjnego
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej (FlowJo v10.8.1)	BD Biosciences (USA)	Nie ma	Wykorzystywane do analizy danych cytometrii przepływowej
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (Chiny)	FH1122	Stosowane do testów celowania in vitro
Oprogramowanie do analizy obrazów (ImageJ)	Narodowe Instytuty Zdrowia (USA)	Nie ma	Wykorzystywane do ilościowej analizy obrazów
System obrazowania in vivo	PerkinElmer (USA)	IVIS Lumina III	Stosowane do obrazowania fluorescencji całego ciała
Izopropanol (60%)	Sigma-Aldrich (USA)	34863	Stosowane do różnicowania podczas barwienia Oil Red O
Lipofektamina 3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Odczynnik transfekcyjny
Mieszadło magnetyczne i pręt mieszający	Nie ma	Nie ma	Wykorzystywane do przygotowania nanocząstek
Masson' Zestaw do bejcowania Trichrome	Abcam (USA)	ab150686	Stosowane do barwienia kolagenu
Mini ekstruder	Avanti Polar Lipids (USA)	610000	Stosowane do wyciągania membranowego
Linia komórkowa Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (Chiny)	FH0328	Źródło makrofagów
Linia komórkowa mięśni gładkich myszy	FuHeng Biotechnologies (Chiny)	FH-Y063	Wykorzystywane do oceny bezpieczeństwa
Olej czerwony O	Sigma-Aldrich (USA)	O0625	Stosowany do barwienia lipidów
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (USA)	31985062	Medium o obniżonej surowicy do transfekcji
Utleniona lipoproteina o niskiej gęstości (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (Chiny)	YB-002	Wykorzystywane do indukowania powstawania komórek piankowych
Penicylina– Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific (USA)	15140122	Suplement antybiotykowy do hodowli komórek
Fenylosulfonylofluorek (PMSF)	Sigma-Aldrich (USA)	78830	Inhibitor proteazy
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Thermo Fisher Scientific (USA)	10010023	Bufor płukania i rozcieńczania
Poli(kwas ko-glikolowy) (PLGA, 50:50; MW 90 000)	Dalian Meilun Biotechnology (Chiny)	MB5649-1	Polimer do produkcji nanocząstek
Filtry membranowe poliwęglanowe (200 nm, 400 nm)	Whatman (Wielka Brytania)	800282	Wykorzystywane do wyciągania
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich (USA)	P9333	Składnik buforu lizy
Odczynnik P3000	Thermo Fisher Scientific (USA)	L3000001	Wzmacniacz transfekcji
Mikrotom obrotowy	Leica Biosystems (Niemcy)	RM2235	Używany do sekcjonowania parafiny
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvarda (USA)	70-3007	Wykorzystywane do kontrolowanego tworzenia nanocząstek
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)	Thermo Fisher Scientific (USA)	Talos F200S	Wykorzystywane do obrazowania nanocząstek
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (USA)	T2663	Komponent bufora
Czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-&alfa;)	R& D Systems (USA)	410-MT	Wykorzystywane do aktywacji komórek śródbłonka
Woda ultraczysta	Milli-Q (Merck, USA)	ZMQSV0T01	Wykorzystywane do przygotowania nanocząstek i dializ