Budowanie wydajnych modeli blastocyst mysich pochodzenia komórkowego macierzystych do badań środowiskowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wytwarzanie i analizę iGATA4-blastoidów, skalowalny model oparty na komórkach macierzystych, który odwzorowuje kluczowe cechy blastocysty myszy, w tym organizację linii komórkowych i kawitację, oraz umożliwia powtarzalną, wysokoskalowaną ocenę perturbacji środowiskowych i molekularnych wpływających na wczesny rozwój zarodkowy.

Streszczenie

Modele zarodków oparte na komórkach macierzystych oferują potężną platformę do badania wczesnego rozwoju ssaków i ich wrażliwości na zaburzenia środowiskowe. Przedstawiamy tutaj solidny i dostępny protokół do generowania wysokiej wierności blastoidów mysich za pomocą komórek macierzystych zarodkowych (ESC), komórek macierzystych trofoblastu (TSC) oraz komórek macierzystych zarodkowych zmodyfikowanych pod kątem indukowanego ekspresji GATA4 (iGATA4-ESC). System ten produkuje iGATA4-blastoidy, które dokładnie odzwierciedlają naturalną morfologię blastocyst w dniu E4.5, proporcje linii komórkowych oraz podpisy transkrypcyjne, zapewniając niezawodny in vitro model prymitywnego endodermy (PE), epiblastu (EPI) oraz trofoblastu (TE). Protokół ten najpierw pokazuje, jak utrzymywać i przygotowywać trzy populacje komórek macierzystych wymagane do formowania blastoidów. Następnie opisano krok po kroku montaż iGATA4-blastoidów w warunkach hodowli przedimplantacyjnej, podkreślając kluczowe parametry eksperymentalne. Aby umożliwić rygorystyczną charakteryzację, dostarczono przetestowany proces utrwalania, barwienia i wykonywania obrazów blastoidów. Wreszcie przedstawiono przykład, który pokazuje, jak iGATA4-blastoidy można wykorzystać do wysoko przepustowości testów. Poprzez narażenie dużych grup blastoidów na określone czynniki środowiskowe, zmiany w morfologii, alokacji linii komórkowych oraz progresji rozwojowej można szybko i powtarzalnie zmierzyć. Łącznie, protokół ten ustanawia skalowalną platformę do modelowania rozwoju przedimplantacyjnego, analizowania wczesnych decyzji linii komórkowych oraz wykonywania wieloparametrycznych przesiewów w celu oceny wpływu czynników środowiskowych lub molekularnych na formowanie blastocyst.

Wprowadzenie

Zrozumienie, jak wczesne zarodki ssaków samoodtwarzają się i jak typowe czynniki środowiskowe mogą negatywnie wpływać na ich tworzenie, wymaga modeli, które są powtarzalne, dostępne eksperymentalnie i skalowalne. Zintegrowane modele przypominające zarodki, stworzone przez łączenie komórek macierzystych zarodkowych i pozazarodkowych, zapewniają taką platformę^1,2. Ten protokół opisuje, jak komórki macierzyste zarodkowe (ESCs), komórki macierzyste trofoblastu (TSCs) oraz komórki ESCs zmodyfikowane na indukcyjne wytwarzanie GATA4 (iGATA4-ESCs) mogą być ułożone w warunkach przedimplantacyjnych, aby wytworzyć blastoidy z solidnymi i odpowiednio proporcjonowanymi liniami komórek endodermy pierwotnej (PE), epiblastu (EPI) i trofoblastu (TE). Ostatnie prace wykazały, że te struktury, zwane iGATA4-blastoidami³, przypominają blastocysty E4.5 pod względem proporcji linii, podpisów transkrypcyjnych i ekspresji markerów funkcjonalnych. Kiedy są hodowane in vitro, 12,5% tych struktur przechodzi w morfologię post-implantacyjną. Co ważne, są one przystosowane do badań toksykologicznych i środowiskowych.

Rozwój tej techniki był motywowany ograniczeniami istniejących systemów blastoidowych^2,4,5. Chociaż wiele protokołów^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} tworzy struktury z jamkami przypominające wczesne blastocysty, większość z nich ma stosunkowo niską efektywność lub produkuje struktury z niekompletną formą PE, nieokreślonymi tożsamościami komórek lub niewłaściwymi proporcjami linii. Te niespójności zmniejszają ich przydatność do badań mechanistycznych i wysokowydajnych badań perturbacyjnych. Ponieważ specyfikacja PE in vivo następuje po aktywacji GATA6, SOX17, GATA4 i SOX7²², a defekty w PE lub jego pochodnych, endodermie wiotkiej (VE), upośledzają rozwój okołoimplantacyjny^{23,24,25,26,27}, wdrażanie tego programu transkrypcyjnego in vitro poprawia wiarygodność blastoidów. Komórki ESCs zawierające warunkowe transgeny GATA4 z dużą skutecznością transdyferencjując się w VE i, gdy są łączone z ESCs i TSCs w warunkach postimplantacyjnych, generuje zintegrowane modele zarodków, które przechodzą gastrulację i inicjują organogeneszę^28,29,30,31. Tutaj ta zasada jest dostosowana do warunków przedimplantacyjnych, co wykazuje, że iGATA4-ESCs niezawodnie generują PE i wytwarzają blastoidy, które bardzo przypominają naturalne blastocysty³.

Ta metoda pozwala na przekroczenie wcześniejszych ograniczeń modelowania blastocyst za pomocą komórek macierzystych i oferuje wysoką efektywność tworzenia blastoidów (80% utworzonych struktur to blastoidy, z czego 75% wykazuje prawidłową organizację i proporcje linii) i wysoką podobieństwo do zarodków. Ponadto modułowa budowa iGATA4-blastoidów, w której każda linia blastocysty pochodzi z niezależnie hodowanej populacji komórek macierzystych, zapewnia bezpośredni dostęp eksperymentalny do każdego składnika zarodka. Te właściwości sprawiają, że system ten jest szczególnie przydatny do zastosowań w wieloparametrowym przesiewaniu. Ponieważ daje duże grupy morfologicznie spójnych struktur z dokładnie proporcjonowanymi liniami TE, EPI i PE, umożliwia równoległe zakłócenia i ilościową ocenę odpowiedzi specyficznych dla linii z mocą statystyczną nieosiągalną przy użyciu naturalnych zarodków.

Jako dowód na zasadność, zmierzono wpływ typowych czynników środowiskowych, przedstawionych w zakresach fizjologicznych^{32,33,34,35,36,37,38} na rozwój blastoidów. Ocena wpływu kofeiny, nikotyny, alkoholu i modyfikacji aminokwasów na szybkość kawitacyjną, morfologię, przystosowanie się i proporcje linii została przeprowadzona w różnym zakresie stężeń i czasowych okresach leczenia. Większość warunków (kofeina, etanol, nikotyna i te imitujące niskie białko) skutkowała nieprawidłowym tworzeniem blastoidów i upośledzoną jakością strukturalną. W przeciwieństwie do

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym protokole dotyczą uznanych linii komórkowych i zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego na California Institute of Technology. Nie przeprowadzono żadnych prac na żywych zwierzętach ani ludziach.

Testowano wiele linii ESC i TSC i stwierdzono, że wspierają one formowanie iGATA4-blastoidów. ESC, iGATA4-ESC i TSC z poprzednich badań²⁸ zostały pomyślnie wykorzystane do zakończenia wszystkich kroków opisanych w tym protokole. Ci sami autorzy opisują wytwarzanie iGATA4-ESC z uprzednio uznanej linii ESC myszy CD1 (ICR).

TSC są hodowane na komercyjnie dostępnych fibroblastach zarodkowych myszy (MEF). Wszystkie chemikalia, reagenty, zestawy, sprzęt i oprogramowanie użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla mysich komórek macierzystych w celu formowania blastoidów

1. Przygotowanie naczyń z MEF jako karmy
   1. Nakładnij 6-dołkową płytkę hodowlańczą 1,5 mL 0,2% (w/v) żelatyny w wodzie dejonizowanej (DI) na dołek. Inkubacja w temperaturze 37 °C w normoksji przez co najmniej 45 min.
   2. Podczas inkubacji przygotuj 15 mL tubki do wirowania z 4 mL pokarmu FC (Tabela 1) podgrzanego do 37 °C.
   3. Roztapiaj fiolkę z MEF w łaźni wodnej za pomocą ruchów w kształcie ósemki, aż pozostanie tylko mała kula lodu. Przenieś zawartość do przygotowanej tubki, a następnie pipetą wzbijaj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Wiruj przez 4 min przy 500 × g.
   4. Aspiruj nadstan i ponownie zawieś pellet w 1 mL pokarmu FC. Wymieszaj do objętości wystarczającej, aby wysiewać ~160 000 komórek na dołek w 1,5 mL na dołek.
   5. Aspiruj żelatynę i zasiej 1,5 mL MEF na dołek. Inkubacja w normoksji przez noc bez zaburzeń.
   6. Następnego dnia wymień pokarmem na świeże 1,5 mL na dołek pokarmu FC. Zmieniać pokarmem co 48 godzin. Używaj MEF 2–7 dni po zasiewie. MEF mogą pozostać zdrowe dłużej, ale ich zdolność do wspierania wzrostu TSC może być osłabiona.

UWAGA: Przeprowadzaj całą hodowlę komórek mysich w szafach laminarnych poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 1 stosując technikę BSL-2.

2. Roztapianie i przesiewanie mysich komórek macierzystych zarodkowych (WT ESC i iGATA4-ESC)
   1. Roztapiaj WT ESC lub iGATA4-ESC zgodnie z krokami 1.1.1–1.1.3. Po wirowaniu zawieś komórki w 1 mL pokarmu N2B27/2i/LIF (Tabela 1) i zasiej ~50 000 komórek na dołek w żelatynowo pokrytej 6-dołkowej płytce z ~1,5 mL na dołek. Inkubacja w temperaturze 37 °C w normoksji i zmiana pokarmu co 48 godzin.
   2. Upewnij się, że kolonie są ciasno spakowane i zaokrąglone z minimalnymi wypustkami przed przesiewaniem. Przesiewaj co 2–3 dni.
      UWAGA: WT ESC i iGATA4-ESC są nierozróżnialne morfologicznie aż do indukcji doksycykliną (DOX).
   3. Nakładnij 6-dołkową płytkę 1,5 mL 0,2% żelatyny w wodzie dejonizowanej na dołek. Inkubacja w temperaturze 37 °C przez co najmniej 45 min.
   4. Dodaj 500 µL środka do dysocjacji komórek na dołek i inkubacja przez 3 min. Dodaj 2 mL pokarmu FC, delikatnie pipetując wokół krawędzi. Potwierdź ponad 90% oddzielenie pod mikroskopem. Jeśli komórki pozostają przyczepione, delikatnie pipetuj, aby pomóc w ponownym zawieszeniu.
   5. Przenieś zawiesinę komórek do 15 mL tubki do wirowania i wiruj przez 4 min przy 500 × g.
   6. Aspiruj nadstan i ponownie zawieś pellet w 1 mL pokarmu N2B27/2i/LIF. Określ koncentrację komórek za pomocą 10 µL na hemocytometrie. Wymieszaj objętość, aby zasiewać ~50 000 komórek na dołek.
   7. Aspiruj żelatynę i zasiej komórki. Inkubacja w normoksji. Zmień pokarmem następnego dnia i co 48 godzin później.
3. Roztapianie i przesiewanie mysich komórek macierzystych trofoblastu (TSC)
   1. Roztapiaj TSC zgodnie z krokami 1.1.1–1.1.3. Po wirowaniu zawieś komórki w 1 mL pokarmu TSF4H (Tabela 1) i zasiej ~20 000 komórek na dołek w pokrytej MEF 6-dołkowej płytce. Inkubacja w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (hipoksja) i zmiana pokarmu co 24 godziny.
   2. Upewnij się, że kolonie są duże (>75 µm średnicy) i spłaszczone przed przesiewaniem. Dodaj 500 µL środka do dysocjacji komórek na dołek i inkubacja przez 5 min. Dodaj 2 mL pokarmu FC, delikatnie

Wyniki

Utrzymanie ESC i iGATA4-ESC (normoksja) oraz TSC (hipoksja) w odpowiednich warunkach hodowlanych jest niezbędne do pomyślnego wytworzenia blastoidów. Przy hodowli zgodnie z opisem, ESC i iGATA4-ESC powinny być w dużej mierze nieodróżnialne, tworząc po 3 dniach średniej wielkości, okrągłe i wyraźnie zarysowane kolonie. Pojawienie się spłaszczonych kolonii lub wypukłych krawędzi świadczy o rozpoczynającej się dyferencjacji i takie kultury nie powinny być wykorzystywane do tworzenia blastoidów. TSC powinny tworzyć płaskie kolonie nabłonkowe z lekko uniesionymi krawędziami i bardziej płaskimi centrami. Przerośnięte lub zlewające się kolonie TSC (zazwyczaj po >3 dniach hodowli) często skutkują niską jakością otrzymanych blastoidów (Rysunek 1).

Podczas procesu tworzenia blastoidów iGATA4 kilka wczesnych cech wskazuje na powodzenie protokołu (Rysunek 2A, B). Około 6 h po agregacji ESC i iGATA4-ESC na dnie mikrowycieków powinny być widoczne zwarte agregaty komórkowe. Luźne agregaty sugerują zbyt długą ekspozycję na odczyn do dysocjacji komórek, co zmniejsza adhezję międzykomórkową. Przejście do kolejnego etapu (dodanie TSC; sekcja 2.4) powinno nastąpić dopiero po zaobserwowaniu zwartych agregatów (Rysunek 2B, punkt czasowy D0.5). Immunobarwienie na tym etapie powinno wykazać jednorodne agregaty SOX2⁺ i GATA4⁻ (Rysunek 2B, punkt czasowy D0.5).

Po dodaniu TSC i inkubacji przez noc powinien stać się widoczny pojedynczy, spójny agregat otoczony przez komórki CDX2⁺ (Rysunek 2B). Obecność dużych, niezagregowanych komórek na powierzchni agregatów często wskazuje na pozostałości MEF. Kontaminacja MEF może obniżyć wydajność tworzenia blastoidów; dlatego odpowiednie usunięcie MEF jest kluczowe dla uzyskania populacji zdominowanej przez TSC przed agregacją. Do usunięcia pozostałych MEF można użyć sitka komórkowego o oczkach 40 µm, choć może to zmniejszyć uzysk TSC. Niepełne lub nadmierne pokrycie komórkami CDX2⁺ można skorygować poprzez dostosowanie liczby dodanych TSC na mikrootwór (zalecany zakres: 10–15).

Po dodaniu DOX oraz 8Br-cAMP jamki są zazwyczaj widoczne w 2. dniu i mogą utrzymywać się do 3. dnia. W mikroskopii w jasnym polu jamki widoczne są jako przeźroczyste, puste przestrzenie wewnątrz blastoidów (Rysunek 2B, C; biała przerywana linia). Komórki GATA4⁺ pojawiają się wkrótce po indukcji DOX i stopniowo przemieszczają się na powierzchnię przedziała przypominającego ICM (Rysunek 2B). Prawidłowe tworzenie blastoidów charakteryzuje się wysoką wydajnością kawitacji (zazwyczaj ~80% struktur na płytce agregacyjnej Microwell; Rysunek 2D), jednowarstwowym nabłonkiem zewnętrznym przypominającym TE z ekspresją CDX2⁺, jamką przypominającą blastocelę oraz zaokrąglonym przedziałem przypominającym ICM, zawierającym komórki przypominające EPI z ekspresją SOX2⁺, pokryte komórkami przypominającymi PE z ekspresją GATA4⁺ (Rysunek 2C–E).

Typowe nieoptymalne wyniki obejmują struktury bez jam, blastoidy o nieregularnym kształcie z wieloma jamami lub przedziałami przypominającymi ICM, a także studzienki zawierające niewiele struktur lub szczątki komórkowe. Chociaż spodziewane jest wystąpienie około 20% nieprawidłowych struktur (Rysunek 2C), wyższy odsetek może wskazywać na problemy takie jak nieprawidłowe przygotowanie pożywki TX, słaba jakość wyjściowych komórek, pominięcie dodania DOX lub 8Br-cAMP w 1. dniu lub przemieszczenie struktur podczas wymiany pożywki.

W zastosowaniach do wysokoprzepustowego przesiewania studzienki niepoddane działaniu czynnika oraz studzienki z kontrolą nośnika powinny generować blastoidy porównywalne z warunkami kontroli pozytywnej (Rycina 3A,B). Zabiegi eksperymentalne mogą wpływać na wiele wskaźników jakości, w tym na rozmiar blastoidów (Rycina 3C), wydajność kawitacji, całkowitą liczbę komórek oraz liczbę komórek linii specyficznych (Rycina 3D), sortowanie PE oraz ogólną morfologię (Rycina 3E). Na przykład traktowanie kofeiną, nikotyną lub etanolem podczas formowania blastoidów prowadziło do powstania mniejszych struktur o obniżonej wydajności kawitacji, mniejszej całkowitej liczbie komórek lub liczbie komórek ICM, zaburzonym sortowaniu PE i gorszej morfologii. Z kolei zwiększające się stężenia aminokwasów rozgałęzionych prowadziły do powstania większych, silniej kawitowanych blastoidów z większą liczbą komórek i lepszą morfologią (Rycina 3C–E). Przewiduje się występowanie zmienności biologicznej między eksperymentami, co podkreśla znaczenie uwzględniania zarówno kontroli pustej, jak i kontroli nośnika w każdym doświadczeniu.

Rysunek 1: Przykłady WT ESC, iGATA4-ESC i TSC dobrej i złej jakości.Mikrografie w świetle widzialnym WT ESC, iGATA4-ESC oraz TSC, przedstawiające oczekiwaną morfologię kolonii po 2–3 dniach hodowli w pośrodku N2B27/2i/LIF (ESC) lub pośrodku TSF4H (TSC). Panel zatytułowany „WT ESCs – bad quality” pokazuje komórki o nieoptymalnej morfologii, w tym spłaszczone kolonie z wystającymi krawędziami (czerwone groty strzałek). Panel „TSC overgrown” przedstawia zlane i powiększone kolonie TSC po 4 dniach hodowli. Pasek skali: 100 µm dla wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Schemat i oczekiwana morfologia blastoidów iGATA4. Przedrukowano z Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Efficient stem cell-derived mouse embryo models for environmental studies, pp. 193–207.e6, Copyright (2025)³, za zgodą wydawnictwa Elsevier. (A) Schematyczna reprezentacja naturalnego rozwoju blastocysty myszy (góra) oraz modelowania blastocysty w oparciu o komórki macierzyste z użyciem WT ESCs, iGATA4-ESCs i TSCs.
(B) Mikrografie przedstawiające oczekiwaną morfologię i ekspresję markerów na różnych etapach protokołu. Projekcja maksymalnej intensywności (MIP); linie przerywane wyznaczają jamę. Pasek skali: 20 µm. (C) Obraz w jasnym polu blastoidów iGATA4 w 3. dniu. Pasek skali: 100 µm.
(D) Wskaźniki kawitacji blastoidów iGATA4 generowanych przy użyciu TSCs hodowanych wstępnie w normoksji lub hipoksji; agregaty hodowano w warunkach hipoksji. n ≥ 4; słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej. (E) Immunobarwienie blastocyst E4.5 oraz blastoidów iGATA4 w 3. dniu pod kątem markerów linii komórkowych (CDX2, cyjan; OCT4, czerwony; GATA4, zielony). Projekcja maksymalnej intensywności (MIP); w indicated pokazano pojedynczą płaszczyznę Z. Pasek skali: 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Wpływ czynników środowiskowych na tworzenie i jakość blastoid. (A) Reprezentatywne trójwymiarowe obrazy immunofluorescencyjne (góra) oraz rekonstrukcje powierzchni IMARIS (dół) blastoid iGATA4 traktowanych czynnikami środowiskowymi (kofeiną, nikotyną, etanolem oraz warunkami imitującymi dietę wysokobiałkową i niskobiałkową). Paski skali: 25 µm dla wszystkich obrazów. (B) Schemat przebiegu eksperymentu. (C) Średnica blastoid w różnych warunkach traktowania. Zakres reprezentuje percentyle 10.–90.; pola oznaczają rozstęp międzykwartylowy; linia oznacza medianę. Analizę statystyczną wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z porównaniami wielokrotnymi. (D) Ilościowe oznaczenie całkowitej liczby komórek (szary), trofektodermy (cyjan), epiblastu (czerwony) i pierwotnej endodermy (zielony) w blastoidach kontrolnych i traktowanych. Słupki reprezentują średnią; słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Analizę statystyczną wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z porównaniami wielokrotnymi. (E) Ilościowe oznaczenie proporcji blastoid zaklasyfikowanych jako „dobre” (prawidłowa segregacja linii komórkowych z minimalnymi anomaliami morfologicznymi), „przeciętne” (w dużej mierze prawidłowa morfologia z drobnymi anomaliami, w tym niepełna segregacja EPI–PE) lub „złe” (poważnie zaburzona morfologia z rozregulowaną organizacją linii komórkowych) w warunkach kontrolnych i traktowania. Analizę statystyczną wykonano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w odniesieniu do warunków kontrolnych. Dla wszystkich paneli n ≥ 3. Istotność statystyczną oznaczono jako *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pożywka	Odczynnik	Stężenie końcowe
FC
	DMEM	n.d.
	Inaktywowana ciepłem FBS (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-merkaptoetanol (2-ME)	0.1 mM
	Nieessentialne aminokwasy (NEAA)	1x
	Piwczan sodu	1x
	Penicylina–Streptomycyna	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	Suplement B27	1x
	Suplement N2	0.5x
	2-ME	100 µM
	Penicylina–Streptomycyna	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 µM
	CHIR99021	3 µM
	Rekombinowany LIF mysi	10 ng/mL
TSF4H
	Pożywka Megacell RPMI-1640	n.d.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Piwczan sodu	1x
	Penicylina–Streptomycyna	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Heparyna	1 μg/mL

Tabela 1: Składy pożywek FC, N2B27/2i/LIF i TSF4H. Składy niezbędne do przygotowania pożywek FC, N2B27/2i/LIF oraz TSF4H, wraz z końcowymi stężeniami.

Składnik	Stężenie końcowe	Stężenie roztworu stokowego	Rozpuszczalnik i przechowywanie	Objętość do ~20 mL
8Br-cAMP	25 µM	5 mM	PBS, przechowywać w -20 °C	100 µL
CHIR99021	3 µM	10 mM	DMSO, przechowywać w -20 °C	6 µL
DMEM/F12	N/D	N/D	Przechowywać w 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 µg/mL	0,1% BSA w PBS, przechowywać w -20 °C	5 µL
Suplement L-alanyl-L-glutaminy	2 mM	200 mM	Przechowywać w 4 °C	200 µL
Heparyna	1 µg/mL	1 mg/mL	PBS, przechowywać w -20 °C	20 µL
Holo-transferyna	10,7 µg/mL	10,7 mg/mL	Woda destylowana, przechowywać w -20 °C	20 µL
Ludzki TGF-β1	15 ng/mL	20 µg/mL	4 mM HCl + 0,1% BSA, przechowywać w -20 °C	15 µL
IL-11	30 ng/mL	25 µg/mL	0,1% BSA w PBS, przechowywać w -20 °C	24 µL
Insulina	19,4 µg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	Stężenie zależy od partii, przechowywać w 4 °C	33,7–40,8 µL, dostosować objętość do stężenia roztworu stokowego.
Magnez kwasu L-askorbinowego-2-fosforanowego	64 µg/mL	32 mg/mL	Woda destylowana, przechowywać w -20 °C	40 µL
Mysi rekombinowany LIF	10 ng/mL	10 µg/mL	PBS + 0,1% BSA, przechowywać w -20 °C	20 µL
NaHCO3	543 µg/mL	45,25 mg/mL	Woda destylowana, przechowywać w -20 °C	240 µL
Penicylina/Streptomycyna	1x	100x	Przechowywać w -20 °C	200 µL
Selenian sodu	14 ng/mL	14 µg/mL	Woda destylowana, przechowywać w -20 °C	20 µL
Y27632	20 µM	20 mM	DMSO, przechowywać w -20 °C	20 µL

Tabela 2: Skład pożywki TX. Receptura przygotowania pożywki TX, wraz ze szczegółami dotyczącymi przygotowania i przechowywania małych cząsteczek oraz innych odczynników, a także stężeniami końcowymi.

Dyskusja

iGATA4-blastoidy zapewniają bardzo wydajny, przypominający zarodek, oparty na komórkach macierzystych model blastocysty mysich, poprzez samoorganizację trzech kultur in vitro: ESC, indukowanych GATA4-ESC (iGATA4-ESC) i uprawianych w hipoksji TSC. Struktury te odzwierciedlają kluczowe cechy blastocysty E4.5, w tym odpowiednie proporcje linii komórkowych i tożsamość transkrypcyjną oraz mogą być używane do wieloparametrycznego przesiewania środowiskowego, niezawodnie odzwierciedlającego wady rozwojowe na etapie blastocysty³. Niedawny badania pokazuje dodatkowo, że agregacja ESC, iGATA4-ESC i TSC w podstawowym środowisku blastoidowym również daje wysoką efektywność tworzenia blastoidów, podkreślając niezawodność i przystosowawczy charakter tego podejścia w różnych laboratoriach i warunkach hodowli³⁹. Wcześniej wykazano, że iGATA4-ESC odzwierciedlają funkcje komórek VE w modelach zarodkowych opartych na komórkach macierzystych po implantacji^28,29,30,31. Razem wyniki te pokazują, jak iGATA4-ESC mogą służyć jako elastyczne i niezawodne zamienniki dla komórek PE/VE w modelowaniu zarodkowym opartym na komórkach macierzystych na różnych etapach rozwoju.

Kilka kroków w protokole jest kluczowych dla osiągnięcia wysokiej jakości blastoidów. Obejmują one jakość początkowych populacji komórek, szczególnie uprawianych w hipoksji TSC (Rysunek 1); przygotowanie medium TX, które powinno być świeżo przygotowane w dniu 0 (Tabela 2; Sekcja 2.3); i ostrożne traktowanie płytek po agregacji. Kluczowymi wskaźnikami sukcesu protokołu są efektywność kawitacji (zwykle ~80%), odpowiednia morfologia (~100 µm średnicy struktur z jamą przypominającą blastocel, CDX2⁺ podobną do TE warstwą zewnętrzną oraz posortowaną SOX2⁺ i GATA4⁺ masą komórek wewnętrznych z stosunkowo 3 TE:1 EPI:1 PE) oraz obecność odpowiednio posortowanej warstwy podobnej do PE GATA4⁺. Są to metryki powszechnie stosowane w dziedzinie^1,2,4,5. Wśród kawitowanych blastoidów około 75% struktur wyświetla wszystkie te cechy. Te metryki mogą być używane jako początkowe wskaźniki do rozwiązywania problemów. Nieodpowiednia jakość komórek jest zazwyczaj odzwierciedlana w nieprawidłowej morfologii kolonii, co prowadzi do słabo zaagregowanych lub niekawitowanych struktur. Niewłaściwa przygotowanie medium może prowadzić do niekompletnej agregacji lub wad linii komórkowych, podczas gdy niedbałe traktowanie może prowadzić do wielu agregatów na mikrodołku lub pustych dołków.

Dalsza optymalizacja może obejmować dostosowanie liczby wysiewanych komórek (zalecane początkowe zakresy: 4–7 ESC i iGATA4-ESC oraz 10–15 TSC na mikrodołek), udoskonalanie metod wyczerpywania MEF (np. filtracja przez sitko komórkowe 40 µm) i modyfikowanie składu medium TX. Na przykład usunięcie FGF4 i heparyny nadal może wspierać wydajne tworzenie blastoidów, jednocześnie promując bardziej muralną tożsamość TE. iGATA4-blastoidy mogą być utrzymywane w kulturze do 6 dni; jednakże struktury z dnia 4–6 często zwiększają się rozmiarem, zachowując blastocystowe proporcje linii. Protokół daje spójne wyniki w różnych repliki biologicznych, ale w każdym eksperymencie należy uwzględnić odpowiednie kontrole.

W porównaniu z innymi systemami blastoidów mysich, które różnią się początkowymi populacjami komórek i warunkami kultury^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}, iGATA4-blastoidy osiągają zarówno wysoką efektywność tworzenia jak i dokładne reprezentowanie linii komórkowych. Podczas gdy wiele istniejących protokołów generuje kawitujące struktury i jest cennych dla specyficznych zastosowań biologicznych, często wykazują niekompletne formowanie PE, heterogeniczne lub nieokreślone tożsamości komórek lub niewłaściwe proporcje linii komórkowych. Łącząc trzy sterowane liniami komórkami macierzystymi populacje w sposób stopniowy, iGATA4-blastoidy pokonyją te ograniczenia i zapewniają powtarzalny, modułowy i dostępny eksperymentalnie system.

Mimo tych zalet, istnieją jeszcze kilka ograniczeń. Przedłużona hodowla in vitro w medium TX powyżej 4–6 dni prowadzi do nadmiernego wzrostu, nawet jeśli proporcje linii komórkowych pozostają przypomin

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-Merkaptoetanolol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Używane do ogólnego przygotowania pożywki
8-BromocAMP	STEMCELL Technologies	73602	Używane do przygotowania pożywki TX i kawitacja blastoid
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Mikrodołki do agregacji; Używane do przygotowania blastoid
Anty-adhezyjny roztwór do płukania	STEMCELL Technologies	7010	Używane do przygotowania blastoid
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Szeroko ścienne pipety do przemieszczania blastoid podczas immunobarwienia.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Używane do przygotowania pożywki
Kofein	Sigma	58-08-2	Używane jako czynnik środowiskowy do testów w blastoidach iGATA4
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:200
CellXpert (normoksyczny inkubator)	Eppendorf	6731010015	Inne marki/modele również mogą działać.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Używane do przygotowania pożywki
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Używane do ogólnego przeznaczenia kultury tkankowej
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Używane do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	Używane do przygotowania pożywki FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Używane do przygotowania N2B27 i pożywki TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Suplement DMEM-LM z mieszaniną składników odżywczych Ham's F-12 w proszku do końcowej stężenia 1x, aby uzyskać DMEM/F12 wolne od Met i Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Używane do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Używane do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Używane do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Używane do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Używane do immunofluorescencji. Rozmrażać w 4°C;, i przechowywać alikwotowane w -20°C;.
Doksycyklina	Sigma	D9891-5G	Do indukcji iGATA4 podczas przygotowania blastoid
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	używane w naszym laboratorium, inne również będą działać. Wymaga adaptorów do probówek i płytek.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Używane do immunofluorescencji
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Używane do przygotowania pożywki
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Używane do analizy obrazu
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Używane do immunofluorescencji, używane w proporcji 1:500
Roztwór żelatyny, 2%	Sigma	G1393	Używane do ogólnego przeznaczenia kultury tkankowej
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Do immunofluorescencji i obrazowania
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Dodatek L-alanyl-L-glutaminy; Używane do przygotowania pożywki
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Używane jako suplement dla DMEM-LM, dla warunków niskobiałkowej diety.
Heparyna	Sigma	H3149	Używane do przygotowania pożywki
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Inne marki/modele również mogą działać.
Holo-transferryna	Sigma	T4132	Używane do przygotowania pożywki TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Używane do przygotowania pożywki TX.
IL-11	PeproTech	200-11	Używane do przygotowania pożywki TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Używane do analizy obrazu i przygotowania obrazu.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Używane do przygotowania pożywki
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Linie komórkowe dostępne w laboratorium Zernicka-Goetz na żądanie
Insulina	Sigma	I9278	Używane do przygotowania pożywki TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Używane jako warstwa podtrzymująca dla kultury TSC. Rozmrażać zgodnie z protokołem i używać w ciągu tygodnia.
L