Budowanie wydajnych modeli blastocyst mysich pochodzenia komórkowego macierzystych dla badań środowiskowych

Sergi Junyent; Manasvi Pinnaka; Magdalena Zernicka-Goetz

doi:10.3791/70796

Method Article

Budowanie wydajnych modeli blastocyst mysich pochodzenia komórkowego macierzystych dla badań środowiskowych

DOI:

10.3791/70796

⸱

July 14th, 2026

Sergi Junyent^*¹ , Manasvi Pinnaka¹ , Magdalena Zernicka-Goetz^*¹

¹Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje generację i analizę iGATA4-blastoidów, skalowalny model oparty na komórkach macierzystych, który odzwierciedla kluczowe cechy blastocysty myszy, w tym organizację linii komórkowych i kawitację oraz umożliwia powtarzalną, wysokowydajną ocenę wpływu czynników środowiskowych i molekularnych na wczesny rozwój zarodkowy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zarodków oparte na komórkach macierzystych oferują potężną platformę do badania wczesnego rozwoju ssaków i ich wrażliwości na zaburzenia środowiskowe. Przedstawiono tutaj solidny i łatwy dostępny protokół generowania wysokiej wierności blastoidów mysich z wykorzystaniem komórek macierzystych zarodkowych (ESC), komórek macierzystych trofoblastu (TSC) oraz komórek macierzystych zarodkowych zmodyfikowanych do indukowanego ekspresji GATA4 (iGATA4-ESC). System ten produkuje iGATA4-blastoidy, które dokładnie naśladują naturalną morfologię blastocyst E4.5, proporcje linii komórkowych oraz podpisy transkrypcyjne, zapewniając niezawodny in vitro model komórtka zarodkowego (PE), epiblastu (EPI) i trofoblastu (TE). Ten protokół najpierw pokazuje, jak utrzymywać i przygotowywać trzy populacje komórek macierzystych wymagane do formowania blastoidów. Następnie opisano krok po kroku montaż iGATA4-blastoidów w warunkach hodowli przedimplantacyjnej, podkreślając kluczowe parametry eksperymentalne. Aby umożliwić rygorystyczną charakteryzację, przedstawiono przetestowany proces utrwalania, barwienia i obrazowania blastoidów. Wreszcie przedstawiono przykład, który pokazuje, jak iGATA4-blastoidy mogą być wykorzystywane do wysoko przepuszczalnych analiz. Poprzez narażenie dużych grup blastoidów na określone czynniki środowiskowe, zmiany w morfologii, przydziale linii komórkowych i postępie rozwoju mogą być szybko i powtarzalnie ilościowo określane. Razem, ten protokół ustanawia skalowalną platformę do modelowania rozwoju przedimplantacyjnego, rozdzielania wczesnych decyzji linii komórkowych oraz przeprowadzania wieloparametrowy wyszukiwań do oceny wpływów środowiskowych lub molekularnych na formowanie blastocyst.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozumienie tego, jak wczesne zarodka ssaków samoodtwarzają się i jak typowe czynniki środowiskowe mogą negatywnie wpływać na ich tworzenie, wymaga systemów modelowych, które są powtarzalne, dostępne eksperymentalnie i skalowalne. Zintegrowane modele przypominające zarodki, stworzone przez łączenie komórek macierzystych zarodkowych i pozazarodkowych, zapewniają taką platformę¹^,². Ten protokół opisuje, jak komórki macierzyste zarodkowe (ESC), komórki macierzyste trofoblastu (TSC) oraz ESC modyfikowane do indukowanego wyrażania GATA4 (iGATA4-ESC) mogą być złożone w warunkach przedimplantacyjnych, aby wytworzyć blastoidy z liniakami zarodkowymi prymitywnymi endodermami (PE), epiblastami (EPI) i trofoblastami (TE) o odpowiednich proporcjach. Ostatnie prace wykazały, że te struktury, nazywane iGATA4-blastoidami³, przypominają blastocysty E4.5 pod względem proporcji linii komórkowych, sygnatur transkrypcyjnych i ekspresji markerów funkcjonalnych. Kiedy są hodowane in vitro, 12,5% tych struktur przechodzi w morfologię postimplantacyjną. Co ważne, są one przystosowane do badań toksykologicznych i środowiskowych.

Rozwój tej techniki był motywowany ograniczeniami istniejących systemów blastoidowych²^,⁴^,⁵. Chociaż wiele protokołów⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹ generuje struktury z wnęką przypominającą wczesne blastocysty, większość robi to z stosunkowo niską wydajnością lub tworzy struktury z niekompletną formą PE, nieokreślonymi tożsamościami komórek lub niewłaściwymi proporcjami linii. Te niekonsekwencje zmniejszają ich przydatność do badań mechanistycznych i wysokowydajnych badań perturbacyjnych. Ponieważ specyfikacja PE in vivo następuje po aktywacji GATA6, SOX17, GATA4 i SOX7²², a defekty w PE lub jego pochodnym, czyli w endodermie trzewnym (VE), spowalniają rozwój okołoimplantacyjny²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷, wdrażanie tego programu transkrypcyjnego in vitro poprawia wiarygodność blastoidów. ESC zawierające uwarunkowane transgeny GATA4 mogą się mocno zróżnicować w VE i, w połączeniu z ESC i TSC w warunkach postimplantacyjnych, generować zintegrowane modele zarodka, które przechodzą gastrulację i inicjują organogeneszę²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹. Tutaj zasada ta jest dostosowana do warunków przedimplantacyjnych, pokazując, że iGATA4-ESC niezawodnie generują PE i wydają blastoidy, które bardzo przypominają naturalne blastocysty³.

Ta metoda pozwala pokonać poprzednie ograniczenia modelowania blastocyst przy użyciu komórek macierzystych i oferuje wysoką wydajność tworzenia blastoidów (80% utworzonych struktur to blastoidy, 75% z nich wykazuje właściwą organizację i proporcje linii) oraz wysoki stopień przypominania zarodka. Ponadto modułowe złożenie iGATA4-blastoidów, w którym każda linia blastocysty pochodzi z niezależnie hodowane populacji komórek macierzystych, zapewnia bezpośredni dostęp eksperymentalny do każdego kompartmentu zarodka. Te właściwości sprawiają, że system jest szczególnie przystosowany do wieloparametrowy aplikacji przesiewowe. Ponieważ daje duże grupy morfologicznie spójnych struktur o dokładnie proporcjonalnych liniach TE, EPI i PE, umożliwia równoległe zakłócenia i ilościowe określenie reakcji specyficznych dla linii z mocą statystyczną nieosiągalną przy użyciu naturalnych zarodków.

Jako dowód na zasadność, zmierzono wpływ typowych czynników środowiskowych prezentowanych w zakresach fizjologicznych³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸ na rozwój blastoidów. Oceniano wpływ kofeiny, nikotyny, alkoholu etylowego i modyfikacji aminokwasów na wskaźnik kawitacyjny, morfologię, sprawność i proporcje linii w różnym zakresie stężeń i okresów leczenia. Większość warunków (kofeina, alkohol etylowy, nikotyna i te imitujące niskie białko) skutkowała nieprawidłowym tworzeniem blastoidów i upośledzoną jakością struktury. W przeciwieństwie do tego, zwiększenie stężenia aminokwasów rozgałęzio

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w tym protokole obejmują udokumentowane linie komórek i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego na California Institute of Technology. Nie przeprowadzano żadnych badań na żywych zwierzętach ani ludziach.

Testowano wiele linii ESC i TSC, które okazały się wspierać formowanie blastoidów iGATA4. ESC, iGATA4-ESC i TSC z poprzednich badań²⁸ zostały pomyślnie wykorzystane do wykonania wszystkich kroków opisanych w tym protokole. Ci sami autorzy opisują wytwarzanie iGATA4-ESC z wcześniej ustanowionej linii komórek macierzystych mysich CD1 (ICR).

TSC są hodowane na komercyjnie dostępnych fibroblastach zarodkowych mysich (MEF). Wszystkie chemikalia, reagenty, zestawy, sprzęt i oprogramowanie użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórek macierzystych myszy w celu formowania blastoidów

Przygotowanie naczyń hodowlania na fibroblastach macierzystych (MEF)
1. Pokąt 6-dołkową płytę hodowlania komórek pokryj 1,5 ml 0,2% (w/v) żelatyny w wodzie odjonizowanej (DI) na dołek. Inkubuje się w 37 °C w normoksji przez co najmniej 45 min.
2. Podczas inkubacji przygotuj 15 ml probówkę do wirowania z 4 ml pożywki FC (Tabela 1) podgrzanej do 37 °C.
3. Roztapiaj fiolkę MEF w kąpieli wodnej, używając figury ósemki, aż pozostanie tylko mała kula lodu. Przelej zawartość do przygotowanej probówki, a następnie pipetą wlecz do góry i w dół, aby dokładnie wymieszać. Wiruj przez 4 min w 500 × g.
4. Odstaw nadstan i zawieś pellet w 1 ml pożywki FC. Dostosuj do odpowiedniej objętości, aby osadzić około 160 000 komórek na dołek w 1,5 ml na dołek.
5. Odstaw żelatynę i osadz 1,5 ml MEF na dołek. Inkubuje się w normoksji przez noc bez zakłóceń.
6. Następnego dnia wymień pożywkę na świeżą pożywkę FC w ilości 1,5 ml na dołek. Zmieniaj pożywkę co 48 h. Używaj MEF 2–7 dni po osadzniu. MEF mogą pozostać zdrowe dłużej, ale ich zdolność do wspierania wzrostu TSC może być osłabiona.

UWAGA: Przeprowadzaj całą hodowlę komórek mysich w szafkach z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 1, stosując technikę BSL-2.

Roztapianie i przesiewanie komórek macierzystych zarodkowych myszy (WT ESC i iGATA4-ESC)
1. Roztapiaj WT ESC lub iGATA4-ESC zgodnie z krokami 1.1.1–1.1.3. Po wirowaniu, zawieś komórki w 1 ml pożywki N2B27/2i/LIF (Tabela 1) i osadz około 50 000 komórek na dołek w 6-dołkowej płytce pokrytej żelatyną z około 1,5 ml na dołek. Inkubuje się w 37 °C w normoksji i zmienia pożywkę co 48 h.
2. Upewnij się, że kolonie są ciasno upakowane i okrągłe z minimalnymi wypustkami przed przesiewaniem. Przesiewaj co 2–3 dni.
  UWAGA: WT ESC i iGATA4-ESC są nieodróżnialne morfologicznie do czasu indukcji doksycykliną (DOX).
3. Pokąt 6-dołkową płytkę pokryj 1,5 ml 0,2% żelatyny w wodzie odjonizowanej na dołek. Inkubuje się w 37 °C przez co najmniej 45 min.
4. Dodaj 500 μL reagentu do dysocjacji komórek na dołek i inkubuje przez 3 min. Dodaj 2 ml pożywki FC, delikatnie pipetując wzdłuż krawędzi. Potwierdź odczepianie >90% pod mikroskopem. Jeśli komórki pozostają przyczepione, delikatnie pipetuj, aby pomóc w resuspendacji.
5. Przenieś zawiesinę komórek do 15 ml probówki do wirowania i wiruj przez 4 min w 500 × g.
6. Odstaw nadstan i zawieś pellet w 1 ml pożywki N2B27/2i/LIF. Określ koncentrację komórek za pomocą 10 μL na hemocytometry. Dostosuj objętość, aby osadzić około 50 000 komórek na dołek.
7. Odstaw żelatynę i osadz komórki. Inkubuje się w normoksji. Zmień pożywkę następnego dnia i co 48 h później.
Roztapianie i przesiewanie komórek macierzystych trofoblastu mysiego (TSC)
1. Roztapiaj TSC zgodnie z krokami 1.1.1–1.1.3. Po wirowaniu, zawieś komórki w 1 ml pożywki TSF4H (Tabela 1) i osadz około 20 000 komórek na dołek w 6-dołkowej płytce pokrytej MEF. Inkubuje się w 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (hipoksja) i zmienia pożywkę co 24 h.
2. Upewnij się, że kolonie są duże (>75 μm średnicy) i spłaszczone przed przesiewaniem. Dodaj 500 μL reagentu do dysocjacji komórek na dołek i inkubuje przez 5 min

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymywanie ESC i iGATA4-ESC (normoksja) oraz TSC (hipoksja) w odpowiednich warunkach kultury jest niezbędne do udanego wygenerowania blastoidów. Kiedy są kultywowane zgodnie z opisem, ESC i iGATA4-ESC powinny być w większości nie do odróżnienia, tworząc po 3 dniach kolonie średniej wielkości, okrągłe i dobrze zdefiniowane. Pojawianie się spłaszczonych kolonii lub wystających krawędzi wskazuje na początkową różnicowanie, a takie kultury nie powinny być używane do formowania blastoidów. TSC powinny tworzyć płaskie, nabrzmiałe kolonie z lekko uniesionymi krawędziami i płaskimi środkami. Przerośnięte lub zlany kolonie TSC (zwykle po >3 dniach w kulturze) często prowadzą do słabych wyników blastoidów (Rysunek 1).

Podczas montażu iGATA4-blastoidu kilka wczesnych cech charakterystycznych wskazuje na sukces protokołu (Rysunek 2A, B). Około 6 godzin po agregacji ESC i iGATA4-ESC, ciasne agregaty komórkowe powinny być widoczne na dnie mikrodołeczków. Luźne agregaty sugerują nadmierną ekspozycję na reagent dysocjacji komórek, co zmniejsza przyleganie komórka-komórka. Przejście do następnego kroku (dodanie TSC; Sekcja 2.4) powinno nastąpić tylko wtedy, gdy zaobserwuje się ciasne agregaty (Rysunek 2B, punkt czasowy D0.5). Barwienie immunologiczne na tym etapie powinno wykazać jednorodne agregaty SOX2⁺ i GATA4⁻ (Rysunek 2B, punkt czasowy D0.5).

Po dodaniu TSC i inkubacji przez noc, powinna być widoczna pojedyncza spójna agregata otoczona komórkami CDX2⁺ (Rysunek 2B). Obecność dużych, nieasymilowanych komórek na powierzchni agregatów często wskazuje na pozostałe MEF. Zanieczyszczenie MEF może zmniejszyć wydajność formowania blastoidów; dlatego adekwatne wyczerpanie MEF jest kluczowe, aby uzyskać przeważającą populację TSC przed agregacją. Aby usunąć pozostałe MEF, można użyć sita komórkowego o średnicy 40 μm, chociaż może to zmniejszyć wydajność TSC. Niepełne lub nadmiernie CDX2⁺ pokrycie można skorygować poprzez dostosowanie liczby dodanych TSC na mikrodołeczek (zalecany zakres: 10–15).

Po dodaniu DOX i 8Br-cAMP, jamki są zazwyczaj obserwowane do dnia 2 i mogą utrzymywać się do dnia 3. Pod mikroskopem jasnopolowym jamki wyglądają jak przejrzyste, puste przestrzenie wewnątrz blastoidów (Rysunek 2B, C; kreskowana linia biała). Komórki GATA4⁺ pojawiają się wkrótce po indukcji DOX i stopniowo sortują się na powierzchnię przedziału przypominającego ICM (Rysunek 2B). Sukces formowania blastoidów charakteryzuje się wysoką wydajnością kawitacji (zwykle ~80% struktur na płytce skupiającej mikrodołki; Rysunek 2D), jednowarstwowy epitelium zewnętrznym przypominającym TE, jamką przypominającą blastocel oraz zaokrąglonym przedziałem przypominającym ICM zawierającym komórki EPI-like SOX2⁺ nakładane przez komórki PE-like GATA4⁺ (Rysunek 2C–E).

Typowymi nieoptymalnymi wynikami są struktury bez kawitacji, nieregularnie ukształtowane blastoidy z wieloma jamkami lub przedziałami przypominającymi ICM oraz dołeczki zawierające niewiele struktur lub szczątków komórkowych. Podczas gdy oczekuje się około 20% nienormalnych struktur (Rysunek 2C), wyższe współczynniki mogą wskazywać na problemy takie jak niewłaściwa preparacja medium TX, niska jakość początkowych komórek, niedodanie DOX lub 8Br-cAMP w dniu 1 lub przemieszczenie struktur podczas zmiany medium.

Dla zastosowań wysokowydajnego przesiewania, nietraktowane i kontrolne dołeczki pojazdu powinny dać blastoidy porównywalne z warunkami kontroli pozytywnej (Rysunek 3A,B). Leczenia eksperymentalne mogą wpływać na wiele wskaźników jakości, w tym wielkość blastoidu (Rysunek 3C), wydajność kawitacji, całkowite i specyficzne dla linii liczby komórek (Rysunek 3D), sortowanie PE i ogólną morfologię (Rysunek 3E). Na przykład leczenie kofeiną, nikotyną lub alkoholem w trakcie formowania blastoidów prowadziło do mniejszych struktur o niższej wydajności kawitacji, niższych liczbach komórek całkowitych lub ICM, upośledzonego sortowania PE i gorszej morfologii. Z kolei zwiększenie stężenia rozgałęzionych aminokwasów łańcuchowych prowadziło do większych, bardziej kawitowanych blastoidów o większej liczbie komórek i lepszej morfologii (Rysunek 3C–E). Oczekuje się zmienności biologicznej między eksperymentami, co podkreśla znaczenie włączenia zarówno kontroli pustych, jak i pojazdowych w każdym eksperymencie.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iGATA4-blastoidy zapewniają wysoce wydajny, przypominający zarodek, oparty na komórkach macierzystych model zarodka mysiego poprzez samoorganizację trzech kultur komórek in vitro: ESC, indukcyjnych GATA4-ESC (iGATA4-ESC) i kultivowanych w hipoksji TSC. Struktury te odzwierciedlają kluczowe cechy zarodka E4.5, w tym odpowiednie proporcje linii komórkowych i tożsamość transkrypcyjną, i mogą być wykorzystywane do wieloparametrowej selekcji środowiskowej, niezawodnie odzwierciedlając niedorozwój na etapie zarodka³. Niedawne badanie pokazuje ponadto, że agregacja ESC, iGATA4-ESC i TSC w podstawowym podłożu blastoidowym również daje wysoką efektywność tworzenia blastoidów, co podkreśla wytrzymałość i przystosowanie tej metody w różnych laboratoriach i warunkach hodowli³⁹. Wcześniej wykazano, że iGATA4-ESC odzwierciedlają funkcje komórek VE w opartych na komórkach macierzystych modelach zarodków po implantacji²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹. Razem wyniki te pokazują, jak iGATA4-ESC mogą służyć jako elastyczne i niezawodne zamienniki dla komórek PE/VE w modelowaniu zarodków opartych na komórkach macierzystych na różnych etapach rozwoju.

Kilka kroków w protokołach jest kluczowych dla osiągnięcia wysokiej jakości blastoidów. Należą do nich jakość początkowych populacji komórek, szczególnie kultivowanych w hipoksji TSC (Rysunek 1); przygotowanie podłoża TX, które powinno być świeże przygotowane w dniu 0 (Tabela 2; Sekcja 2.3); i ostrożne obchodzenie się z płytkami po agregacji. Kluczowe wskaźniki sukcesu protokołu obejmują efektywność kawitacyjną (zazwyczaj ~80%), odpowiednią morfologię (~100 μm średnicy struktur z jamą przypominającą blastocele, warstwa zewnętrzna podobna do CDX2⁺ TE i posortowany SOX2⁺ i GATA4⁺ masę komórek wewnętrznych z przybliżonym stosunkiem 3 TE:1 EPI:1 PE) oraz obecność odpowiednio posortowanej warstwy przypominającej GATA4⁺ PE. Są to wskaźniki powszechnie stosowane w tej dziedzinie¹^,²^,⁴^,⁵. Wśród kawitowane blastoidów, około 75% struktur wykazuje wszystkie te cechy. Te wskaźniki mogą służyć jako początkowe wskazówki do rozwiązywania problemów. Nieodpowiednia jakość komórek zwykle przekłada się na nieprawidłową morfologię kolonii, prowadząc do słabo zagregowanych lub niekawitowanych struktur. Niewłaściwa przygotowanie podłoża może prowadzić do niepełnej agregacji lub wad linii komórkowych, podczas gdy nieostrożne obchodzenie się może prowadzić do wielu agregatów na jednej mikrokomórce lub pustych dołkach.

Dalsza optymalizacja może obejmować dostosowanie liczby wysiewanych komórek (zalecane początkowe zakresy: 4–7 ESC i iGATA4-ESC oraz 10–15 TSC na mikrokomórkę), doskonalenie metod wyczerpania MEF (np. filtracja przez 40 μm sitko komórkowe) oraz modyfikowanie składu podłoża TX. Na przykład, usunięcie FGF4 i heparyny nadal może wspierać efektywne tworzenie blastoidów, jednocześnie promując bardziej murusalną tożsamość TE. iGATA4-blastoidy mogą być utrzymywane w kulturze przez maksymalnie 6 dni; jednak struktury z dnia 4–6 często zwiększają się w rozmiarze, zachowując zarodkowe proporcje linii. Protokół daje spójne wyniki w różnych replikowanych eksperymentach biologicznych, ale odpowiednie kontrole powinny być zawarte w każdym eksperymencie.

W porównaniu z innymi systemami blastoidów mysich, które różnią się początkowymi populacjami komórek i warunkami hodowli⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰, iGATA4-blastoidy osiągają zarówno wysoką efektywność formowania, jak i dokładne przedstawienie linii. Podczas gdy wiele istniejących protokołów generuje kawitowane struktury i są cenne dla określonych zastosowań biologicznych, często wykazują niekompletne tworzenie PE, heterogeniczne lub nieokreślone tożsamości komórek lub niewłaściwe proporcje linii. Łącząc trzy linii-dyrekcyjne populacje komórek macierzystych w sposób stopniowy, iGATA4-blastoidy pokonują te ograniczenia i zapewniają powtarzalny, modułowy i dostępny eksperymentalnie system.

Mimo tych zalet, kilka ograniczeń pozostaje. Przedłużona kultura in vitro w podłożu TX poza 4–6 dni prowadzi do przerostu, nawet

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Christophowi Häfelfingerowi, Victorii Jorgensen, Min Bao, Lenji Fluetsch oraz członkom laboratorium Zernicka-Goetz za pomoc w rozwijaniu i ulepszaniu iGATA4-blastoidów. Ta praca była wspierana przez Nagrodę Pioneer National Institute of Health (5DP1HD104575-04 dla M.Z.-G.), Nagrodę Open Philanthropy (M.Z.-G.), Program Human Frontiers Science Program (LT-0022/2022 dla S.J.), NSFC (82301873 dla M.B.), Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2024YFA1107002 dla M.B.), Szwajcarski Fundusz Studiów (C.M.H.), Fundusz Werenfels Wolnego Towarzystwa Akademickiego (Freie Akademische Gesellschaft) w Bazylei (C.M.H.) oraz Fundację Claudine i Hans-Heinera Zaeslin-Bustany (C.M.H.).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Używane do przygotowania ogólnego podłoża
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Używane do przygotowania podłoża TX i kawitacji blastoid
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Mikroplateta agregacyjna; Używane do przygotowania blastoid
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Używane do przygotowania blastoid
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Szerokie struny piporek do przemieszczania blastoidów podczas immunobarwienia.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Używane do przygotowania podłoża
Kofein	Sigma	58-08-2	Używane jako czynnik środowiskowy do testowania w iGATA4-blastoid
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:200
CellXpert (normoksyczny inkubator)	Eppendorf	6731010015	Inne marki/modele mogą również działać.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Używane do przygotowania podłoża
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Używane do ogólnych celów hodowli tkankowej
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Używane do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	Używane do przygotowania podłoża FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Używane do przygotowania N2B27 i podłoża TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Używane do suplementacji DMEM-LM z proszkiem Ham's F-12 Nutrient Mix do końcowego stężenia 1x w celu uzyskania podłoża DMEM/F12 bez Met i Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Używane do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Używane do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Używane do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Używane do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Używane do immunofluorescencji. Rozmrażanie w 4°C; przechowywać porcjonowane w -20°C.
Doksycyklina	Sigma	D9891-5G	Do indukcji iGATA4 podczas przygotowania blastoid
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	Używane w naszym laboratorium, inne będą działać. Wymaga adapterów do probówek i płytek.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Używane do immunofluorescencji
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Używane do przygotowania podłoża
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Używane do analizy obrazów
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Używane do immunofluorescencji, używane w stężeniu 1:500
Roztwór żelatyny, 2%	Sigma	G1393	Używane do ogólnych celów hodowli tkankowej
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Do immunofluorescencji i obrazowania
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Suplement L-alanyl-L-glutaminy; Używane do przygotowania podłoża
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Używane jako suplement do DMEM-LM, w warunkach niskoprzebiegowej diety.
Heparyna	Sigma	H3149	Używane do przygotowania podłoża
Heracell VIOS 160i (inkubator hipoksemiczny)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Inne marki/modele mogą również działać.
Holo-transferryna	Sigma	T4132	Używane do przygotowania podłoża TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Używane do przygotowania podłoża TX.
IL-11	PeproTech	200-11	Używane do przygotowania podłoża TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Używane do analizy obrazów i przygotowania obrazów.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Używane do przygotowania podłoża
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Linia komórkowa dostępna w laboratorium Zernicka-Goetz na żądanie
Insulin	Sigma	I9278	Używane do przygotowania podłoża TX.
Opromienione fibroblasty mezenchymalne zarodka myszy C57bl/6	Thermo Fisher Scientific	A34960	Używane jako warstwa podtrzymująca do hodowli TSC. Rozmrażanie zgodnie z protokołem i używanie w ciągu tygodnia.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Budowanie wydajnych modeli blastocyst mysich pochodzenia komórkowego macierzystych dla badań środowiskowych

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles