Zintegrowana farmakologia sieci, metabolomika oraz in vivo walidacja dekokcji Liangxue Dihuang u myszy wywołanych przez DSS wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego

Podsumowanie

Protokół ten opisuje powtarzalny przepływ pracy integrujący farmakologię sieci, metabolomikę nieukierunkowaną oraz walidację in vivo , aby wyjaśnić wieloskładnikowe mechanizmy wywaru Liangxue Dihuang w myszim modelu wrzodziejącego zapalenia jelita grubego indukowanego siarczanem sodu.

Streszczenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to przewlekła zapalna choroba jelit charakteryzująca się utrzymującym się zapaleniem jelit oraz zaburzeniami metabolizmu. Formuły tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) są szeroko stosowane w praktyce klinicznej w leczeniu zaburzeń zapalnych; Jednak systematyczne podejścia eksperymentalne do wyjaśnienia ich mechanizmów wieloskładnikowych i wielocelowych pozostają ograniczone. Niniejszy artykuł przedstawia powtarzalny protokół eksperymentalny integrujący farmakologię sieci, nieukierunkowaną metabolomikę oraz walidację in vivo , aby zbadać przeciwzapalne działanie dekokcji Liangxue Dihuang (LXDHD) w myszim modelu UC indukowanym przez dextran siarczan sodu (DSS). Workflow obejmuje przygotowanie wywaru ziołowego, modelowanie zapalenia jelita grubego wywołanego DSS, ocenę aktywności chorobowej, ocenę histopatologiczną i hematologiczną, pomiar cytokiny w surowicy, profilowanie metabolomiczne oparte na LC–MS oraz analizę sieci obliczeniowej. Dzięki temu zintegrowanemu podejściu pomyślnie zidentyfikowano zapalenie jelita grubego wywołanego DSS, a leczenie LXDHD przyniosło mierzalne poprawy wskaźnika aktywności choroby, długości jelita grubego, uszkodzeń histologicznych, poziomu cytokin zapalnych oraz profilów metabolicznych. Analizy farmakologii sieciowej i metabolomiki wykazały również, że protokół ten umożliwia identyfikację kluczowych celów, szlaków i metabolitów związanych z interwencją terapeutyczną. Ten wizualizowany i ustandaryzowany workflow stanowi praktyczne ramy metodologiczne do badania farmakologicznych mechanizmów wieloskładnikowych formuł TCM w chorobach zapalnych jelit i może być dostosowany do innych ziołowych recept i modeli chorób.

Wprowadzenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to przewlekła zapalna choroba jelit charakteryzująca się ciągłym zapaleniem błony grubej¹, prowadzącym do objawów takich jak ból brzucha, biegunka, krwawienie z odbytu oraz utrata masy^{ciała 2}. Częstość występowania UC rośnie na całym świecie, nakładając znaczne obciążenia na systemy opieki zdrowotnej i znacząco pogarszając jakość życia pacjentów³. Chociaż etiologia UC pozostaje niedo do końca poznana, narastające dowody wskazują, że zaburzenia odpowiedzi immunologiczne, nadmierna produkcja zapalnych cytokin, stres oksydacyjny oraz zaburzenia metaboliczne odgrywają centralne role w patogenezie choroby ^4,5.

Obecne strategie terapeutyczne dla UC obejmują głównie aminosalicylany, kortykosteroidy, leki immunosupresyjne oraz leki biologiczne ukierunkowane na cytokiny zapalne⁶. Chociaż te terapie mogą łagodzić objawy i wywoływać remisję, ich długotrwałe stosowanie często wiąże się z efektami niepożądanymi, wysokimi kosztami oraz zmiennymi odpowiedziami terapeutycznymi ^7,8,9. Co więcej, znaczna część pacjentów nie osiąga trwałej remisji, co podkreśla potrzebę alternatywnych lub komplementarnych podejść terapeutycznych o zwiększonym bezpieczeństwie i skuteczności wielocelowej.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) jest szeroko stosowana w leczeniu zaburzeń przewodu pokarmowego od wieków i coraz częściej doceniana ze względu na potencjalne korzyści w złożonych chorobach zapalnych, takich jak UC¹⁰. W przeciwieństwie do terapii jednocelowych, formuły TCM zazwyczaj wywierają efekt terapeutyczny poprzez działanie wielu składników na różne cele i szlaki, co może lepiej odpowiadać na wieloczynnikowy charakter UC¹¹. Badania kliniczne i eksperymentalne sugerują, że niektóre recepty TCM mogą modulować odpowiedzi immunologiczne, tłumić stan zapalny, chronić integralność bariery jelitowej oraz regulować homeostazę metaboliczną 12,13,14,15.

Wywar Liangxue Dihuang (LXDHD) to klasyczna formuła TCM tradycyjnie stosowana do "chłodzenia krwi i oczyszczania ciepła" i była klinicznie stosowana w leczeniu chorób zapalnych i krwotocznych¹⁶. Recepta obejmuje wiele ziół, w tym Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis oraz Glycyrrhiza uralensis. Współczesne badania farmakologiczne wykazały, że kilka ziół i ich aktywnych związków posiada właściwości przeciwzapalne, antyoksydacyjne i immunomodulujące 17,18,19. Jednak ogólne efekty terapeutyczne i mechanizmy leżące u podstaw LXDHD w UC nie zostały jeszcze systematycznie wyjaśnione.

Farmakologia sieciowa stała się skutecznym podejściem do badania złożonych interakcji między wieloskładnikowymi formułami ziołowymi a molekularnymi celami związanymi z chorobą²⁰. Integrując informacje z wielu baz danych, farmakologia sieciowa może przewidywać potencjalne aktywne związki, cele terapeutyczne oraz szlaki sygnalizacyjne, zapewniając systemowe zrozumienie mechanizmów TCM²¹. Niemniej jednak farmakologia sieciowa opiera się głównie na prognozach z baz danych i nie odzwierciedla bezpośrednio zmian metabolicznych in vivo .

Metabolomika, jako potężne narzędzie do profilowania globalnych zmian metabolicznych, oferuje uzupełniające wglądy w patofizjologię chorób oraz odpowiedzi terapeutyczne²². W UC analizy metabolomiczne wykazały istotne zaburzenia metabolizmu lipidów i aminokwasów, a także szlaki związane ze stresem oksydacyjnym 23,24,25. Integracja metabolomiki z farmakologią sieciową może pomóc zniwelować lukę między przewidywanymi celami molekularnymi a rzeczywistymi fenotypami metabolicznymi, poprawiając tym samym wiarygodność interpretacji mechanistycznych.

W niniejszym badaniu zastosowano zintegrowaną strategię łączącą farmakologię sieci, metabolomikę nieukierunkowaną oraz walidację eksperymentalną do zbadania przeciwzapalnych efektów i potencjalnych mechanizmów LXDHD w myszim modelu UC indukowanym przez dextran siarczan sodu (DSS) (Rysunek 1A). Ten ogólny projekt metodologiczny, integrujący przewidywania in silico z walidacją metabolomiczną i fenotypową in vivo , jest zgodny z ustalonymi, rygorystycznymi ramami badawczymi²⁶. Analiza farmakologii sieci została wykorzystana do identyfikacji aktywnych związków, potencjalnych celów terapeutycznych oraz szlaków sygnalizacyjnych wzbogaconych leczeniem LXDHD. Przeprowadzono metabolomikę nieukierunkowaną, aby scharakteryzować zmiany metaboliczne wywołane przez UC i ich modulację przez LXDHD. Ponadto kluczowe wyniki zostały potwierdzone poprzez eksperymenty in vivo , w tym oceny aktywności choroby, zmian histopatologicznych, parametrów hematologicznych oraz poziomów cytokin zapalnych.

Poprzez integrację prognoz obliczeniowych, profilowania metabolicznego oraz walidacji biologicznej, badanie to ma na celu dostarczenie kompleksowego zrozumienia mechanizmów wieloskładnikowych, wielocelowych i wieloszlakowych, które leżą u podstaw terapeutycznych efektów LXDHD w UC. Prace te nie tylko dostarczają dowodów eksperymentalnych potwierdzających stosowanie LXDHD jako potencjalnej terapii uzupełniającej UC, ale także stanowią ramy metodologiczne do badania mechanizmów innych złożonych wzorów TCM.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie (Zatwierdzenie nr #2025DW-034-01; Data zatwierdzenia: 24 marca 2025). Przygotowanie wywaru Liangxue Dihuang przeprowadzono zgodnie z procedurami opisanymi w Farmakopei Chińskiej²⁷. Odczynniki, chemikalia i oprogramowanie używane w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie wywaru Liangxue Dihuang (LXDHD)

1. Przygotuj suszone ziołowe materiały zgodnie ze standardową formułą LXDHD. Dokładny skład ziół, nazwy roślinne oraz dokładne zalecane dawki jedenastu składników ziół zostały określone w Tabeli 1.
   UWAGA: Przed użyciem uwierzytelnić wszystkie materiały ziołowe przez wykwalifikowanego farmakognostę, aby zapewnić tożsamość botaniczną i spójność jakości. Zachowaj rekordy uwierzytelniania ze względu na powtarzalność.
2. Przygotowanie prochu
   1. Wszystkie materiały ziołowe susz na powietrzu w temperaturze pokojowej w czystym, dobrze wentylowanym środowisku.
   2. Każde zioło zmieleń osobno za pomocą mechanicznego młynka, aż uzyskasz drobny proszek.
   3. Mieszaj proszki zgodnie z zalecanymi proporcjami.
   4. Przeproszek przepuścić przez sito o rozmiarze 80 otek (średnica wewnętrzna 180 μm ± 7,6 μm), aby zapewnić jednolity rozmiar cząstek.
   5. Dokładnie ujednolic przesiewany proszek.
      UWAGA: Jednolity rozmiar cząstek jest niezbędny dla spójnej efektywności ekstrakcji. Niepełne mielenie lub nierównomierne mieszanie może powodować zmienność składu chemicznego.
3. Przygotowanie ekstraktu wodnego LXDHD
   1. Dokładnie odważ mieszankę ziołowego proszku i dodaj wodę destylowaną w proporcji 1:10 (w/v).
   2. Podgrzej mieszankę do wrzenia i dekoktuj przez 20 minut.
   3. Przefiltruj ekstrakt i zbierz filtrat.
   4. Dodaj świeżą wodę destylowaną do resztek i powtarzaj wywar przez kolejne 20 minut.
   5. Połącz oba filtraty, aby uzyskać ostateczny ekstrakt wodny LXDHD.
      UWAGA: Podwójna dekokcja jest niezbędna, aby zapewnić efektywną ekstrakcję zarówno składników rozpuszczalnych w wodzie, jak i umiarkowanie rozpuszczalnych.
4. Koncentracja i przechowywanie
   1. Skoncentruj połączony wywar pod obniżonym ciśnieniem lub delikatnym podgrzewaniem, aż osiągniesz pożądane stężenie.
   2. Pozwól ekstraktowi ostygnąć do temperatury pokojowej.
   3. Przechowuj przygotowany ekstrakt LXDHD w temperaturze 4 °C i użyj w ciągu 48 godzin.
      UWAGA: Unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania, ponieważ mogą one rozkładać związki bioaktywne i zmniejszać powtarzalność eksperymentalną.
5. Administracja
   1. Przed podaniem doprowadź ekstrakt do temperatury pokojowej.
   2. Podawaj skoncentrowaną wodną dekokcję LXDHD myszom doustnie w określonych dawkach według grup eksperymentalnych.

2. Projektowanie eksperymentów na zwierzętach

1. Zwierzęta i warunki mieszkaniowe
   1. Pozyskaj samce myszy C57BL/6 (w wieku 6–8 tygodni, 20–25 g) od certyfikowanego dostawcy zwierząt laboratoryjnych.
   2. Myszy domowe w standardowych warunkach laboratoryjnych z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, kontrolowaną temperaturą (22–25 °C) oraz wilgotnością względną (50%–60%).
   3. Zapewnij myszom swobodny dostęp do standardowego jedzenia i wody przez cały eksperyment.
   4. Pozwól myszom przyzwyczaić się co najmniej 7 dni przed eksperymentami.
      UWAGA: W kolejnych eksperymentach uwzględniać tylko zdrowe myszy o normalnej aktywności i masie ciała.
2. Grupowanie i obliczanie dawki
   1. Oblicz dawkę LXDHD u myszy zgodnie z zasadą konwersji dawki człowiek–zwierzę opisaną w Metodologii eksperymentów farmakologicznych, na podstawie standardowej masy ciała dorosłego 70 kg oraz dziennej dawki klinicznej 8,4 g²⁸.
   2. Losowo podziel myszy na następujące grupy (n = 6 na grupę): grupa kontrolna w normie, grupa modelowa z UC indukowana DSS, grupa niskodawkowa LXDHD (1,09 g/kg), grupa wysokodawkowa LXDHD (2,18 g/kg) oraz grupa 5ASA z dodatnim testem (100 mg/kg)²⁹.
      UWAGA: Wykonaj losowość za pomocą tabeli liczb losowych, aby zminimalizować błędy selekcji.
   3. Wprowadzenie UC i podawanie leków
      1. Przygotuj 2,5% (w/v) roztwór DSS w wodzie pitnej.
      2. Podawaj roztwór DSS ad libitum myszom w modelu, leczonym LXDHD oraz grupom 5ASA przez 7 kolejnych dni^{i 30}.
      3. Zapewnij myszom w normalnej grupie kontrolnej oczyszczoną wodę pitną.
      4. Podawaj LXDHD i 5ASA grupom leczonym raz dziennie za pomocą doustnej dawki w odpowiednich dawkach przez cały okres eksperymentalny.
      5. Podawać równą ilość rozwiązań pojazdu jak normalne grupy modeli sterowania i DSS.
         UWAGA: Przygotuj roztwór DSS na świeżo i wymieniaj go co 2 dni. Partie DSS mogą się różnić pod względem siły wywołującej zapalenie jelita grubego; Przeprowadz testy pilotażowe przy użyciu nowej partii. Skuteczne ustanowienie modelu UC indukowanego DSS charakteryzuje się postępującą utratą masy ciała, krwawą biegunką, podwyższonymi wynikami DAI oraz wyraźnym skróceniem jelita grubego. Kryteria te oraz metodologiczne projektowanie eksperymentów z myszą są zgodne z ustalonymi standardami odniesienia³¹.
3. Przygotowanie surowicy białej i zawierającej lek do metabolomiki egzogennej
   1. Użyj osobnej grupy zdrowych samców myszy C57BL/6.
   2. Losowo podziel myszy na dwie grupy: grupę pustą i grupę LXDHD.
   3. Podawaj LXDHD grupie z LXDHD doustnie w dawce 2,18 g/kg raz dziennie przez 7 kolejnych dni.
   4. Podaj równą ilość wody destylowanej do grupy pustej.
   5. Pobierz próbki krwi godzinę po ostatecznym podaniu.
   6. Przetwórz próbki krwi, aby uzyskać surowicę, jak opisano powyżej w sekcji 3.5.

3. Ocena aktywności choroby

1. Codziennie monitoruj masę ciała, konsystencję stolca oraz krwawienia z kału podczas eksperymentu.
2. Oblicz Wskaźnik Aktywności Choroby (DAI) na podstawie utraty masy ciała, spójności stolca i krwawienia kału. Szczegółowy system punktacji jest szczegółowo opisany w Tabeli 3. Oblicz
   końcowy wynik DAI jako średnia (lub suma) tych trzech parametrów³².
3. Na koniec ósmego dnia znieczulaj myszy z każdej grupy 1% sodu pentobarbitalu (30 mg/kg). Pobierz około 400 μL krwi z splotu żylnego za oczodołem każdej myszy. Następnie należy uśpić zwierzęta przez zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć, zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Medycznych Weterynarii (AVMA) dotyczącymi eutanazji zwierząt (Rysunek 1B).
   UWAGA: Potwierdzaj odpowiednią znieczulenie, delikatnie szczypiąc palce i powierzchnię podeszwową tylnych łap; brak reakcji odstawienia wskazuje na wystarczającą głębokość znieczulenia.
4. Zbieraj tkanki jelita grubego i mierz długość jelita jako wskaźnik nasilenia choroby.
   UWAGA: Skrócona długość jelita grubego jest uważana za cechę charakterystyczną nasilenia zapalenia jelita grubego wywołanego DSS³³.
5. Uzyskanie surowicy krwi
   1. Pozwól, by część pobranych próbek krwi skrzepnęła w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   2. Próbki w wirówce pobieraj w dawce 1 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać surowicę.
   3. Ilościowo określić poziomy interleukiny (IL)-1β, IL-6, IL-17, czynnika martwicy nowotworów-alfa (TNF-α) oraz IL-10.
   4. Pobieranie próbek tkanki jelita grubego do analizy histopatologicznej.
   5. Wykorzystaj pozostałe próbki krwi do badań obwodowych.
   6. Dodatkowe próbki surowicy rezerwuj do analizy metabolomicznej.

4. Barwienie hematoksylinowo-eozynowe (H&E)

1. Utrwal tkanki jelita grubego w 4% paradehydu przez co najmniej 24 godziny.
2. Tkanki odwodniaj za pomocą serii ethanolu o stopniu jakości.
3. Przezroczyste tkanki z ksylenem i zanurz w parafinie.
4. Wycina przekroje tkanek (3–5 μm grubości) za pomocą mikrotomu.
5. Odparaffinizuj przekroje ksylenem.
6. Nawadniaj fragmenty za pomocą sortowanego etanolu.
7. Barwi się przekroje hematoksyliną dla wizualizacji jądrowej.
8. Preparaty kontrbarwne za pomocą eozyny do barwienia cytoplazmatycznego.
9. Obserwuj zmiany histopatologiczne pod mikroskopem świetlnym i wykonuj reprezentatywne obrazy za pomocą powiązanego oprogramowania obrazującego.
10. Oceniaj oceny histologiczne (HCS) na podstawie nasilenia stanu zapalnego, głębokości urazu oraz uszkodzenia krypt.
11. Szczegółowe kryteria oceny histologicznej można znaleźć w Tabeli 4 .
    UWAGA: Uchwyć reprezentatywne obrazy osadzania tkanek, sekcji i barwienia, aby poprawić wizualizację protokołów.

5. Analiza krwi obwodowej

1. Pobieranie próbek krwi obwodowej do rurek antykoagulantowych EDTA-K2 (1,5 mg EDTA na mL krwi).
2. Delikatnie odwracaj rurki 8–10 razy, aby zapewnić prawidłowe mieszanie.
3. Analizuj liczbę komórek krwi za pomocą trzyczęściowego analizatora hematologii weterynaryjnej (Mindray BC-2600vet) z kalibracją specyficzną dla gatunku.
4. Transportuj próbki w temperaturze 4 °C.
5. Analizuj próbki w ciągu 4 godzin od pobrania.
   UWAGA: Z analizy wyklucz próbki wykazujące hemolizę lub krzepnięcie.

6. Enzymatyczny test immunosorbentny (ELISA)

UWAGA: IL-6, IL-17, IL-1β i TNF-α to kluczowe cytokiny prozapalne, podczas gdy IL-10 jest kluczową przeciwzapalną cytokiną. Te cytokiny odzwierciedlają obecność i nasilenie odpowiedzi zapalnych³⁴.
Pomiar tych cytokin jest kluczowy dla zrozumienia procesów zapalnych i oceny skuteczności terapii przeciwzapalnej.

1. Pobierz próbki krwi z splotu żylnego za oczodołem.
2. Pozwól próbkom skrzepnąć w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Próbki z wirówki w dawce 1 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać surowicę.
4. Zmierz poziomy surowicy IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α i IL-10 za pomocą komercyjnych zestawów ELISA.
5. Mierz absorpcję za pomocą czytnika mikropłyt wyposażonego w standardowe oprogramowanie do akwizycji danych.
6. Oblicz stężenia cytokin na podstawie standardowych krzywych.
   UWAGA: Przeanalizuj wszystkie próbki i normy w duplikacie, aby zmniejszyć zmienność techniczną.

7. Analiza LC–MS wywaru Liangxue Dihuang

1. Przygotowanie próbki
   1. Dokładnie zważ 10 g mieszanki LXDHD surowego proszku ziołowego.
   2. Rozpuść proszek w 30 mL gorącej wody.
   3. Wykonaj ekstrakcję ultradźwiękową przez 30 minut.
   4. Wymieszaj 100 μL ekstraktu z 400 μL metanolu.
   5. Wiruj przez 10 minut.
   6. Wirówka 14 000 × g przez 10 minut.
   7. Zbierz supernatant jako roztwór testowy.
2. Warunki LC–MS
   1. Wykonaj separację chromatograficzną za pomocą systemu LC sprzężonego ze spektrometrem mas Q.
   2. Użyj kolumny C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Ustaw fazę ruchomą następująco: rozpuszczalnik A, 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie; rozpuszczalnik B, metanol.
   4. Ustaw przepływ na 0,30 mL/min.
   5. Ustaw temperaturę kolumny na 35 °C.
   6. Ustaw objętość wtrysku na 5 μL.
   7. Zastosuj następujący program gradientowo-elucijny:
      0–2 min, 5% B;
      2–15 min, 5–95% B;
      15–18 min, 95% B;
      18–18,1 min, 95–5% B;
      18,1–22 min, 5% B.
   8. Ustaw parametry spektrometrii mas następująco: przepływ gazu w otoczce, 35 arb; przepływ gazu pomocniczego, 10 arb; napięcie natryskowe, 3,5 kV (dodatnie) i 2,8 kV (ujemne); temperatura kapilar, 320 °C; Temperatura podgrzewacza gazowego pomocniczego, 350 °C.
   9. Zbieraj dane MS zarówno w trybach dodatniego, jak i ujemnego jonu z pełnym zakresem skanowania MS m/z 100–1500 (rozdzielczość: 70 000).
   10. Wykonaj skany MS2 (dd-MS2) zależne od danych z rozdzielczością 17 500.
   11. Przetwarzaj surowe dane i identyfikuj związki za pomocą bazy mzCloud.

8. Analiza metabolomiki nieukierunkowanej w surowicy

1. Przygotowanie próbek surowicy i kontrola jakości (QC)
   1. Rozmrażaj próbki surowicy na lodzie.
   2. Przelej 50 μL surowicy do probówki do wirówki o pojemności 1,5 mL.
   3. Dodaj 200 μL zimnego metanolu/acetonitrylu (1:1, v/v).
   4. Wiruj przez 1 minutę, aby wytrącić białka.
   5. Inkubuj na lodzie przez 15 minut.
   6. Wirówka w 14 000 × g przez 15 minut w 4 °C.
   7. Przelej supernatant do nowej rurki.
   8. Wysusz ekstrakt za pomocą koncentratora próżniowego.
   9. Rekonstytuuj w 100 μL acetonitrylu/wody (1:1, v/v).
   10. Dokładnie przeszukaj wir.
   11. Ponownie wirować w 14 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   12. Pobierz supernatant do analizy LC-MS.
   13. Przygotuj próbki QC, łącząc 10 μL aliquotów z każdej próbki.
   14. Wstrzyknij jedną próbkę QC na każde 8–10 próbek eksperymentalnych, aby monitorować stabilność i powtarzalność instrumentu.
2. Ustawienia akwizycji LC-MS
   1. Przeprowadz separację chromatograficzną za pomocą systemu LC z kolumną C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   2. Ustaw temperaturę kolumny na 35 °C.
   3. Ustaw przepływ na 0,30 mL/min.
   4. Ustaw objętość wtrysku na 2 μL (tryb dodatni) lub 5 μL (tryb ujemny).
   5. Użyj rozpuszczalnika A (0,1% kwasu mrówkowego w wodzie) oraz rozpuszczalnika B (acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym).
   6. Zastosuj program elucii gradientu liniowego.
   7. Spektrometr mas należy obsługiwać w trybach dodatnim i ujemnym HESI.
   8. Ustaw zakres skanowania masowego na m/z 100–1500.
   9. Ustaw napięcie natryskowe na 3,5 kV (dodatnie) i 2,8 kV (ujemne).
   10. Ustaw temperaturę kapilar na 320 °C.
3. Przetwarzanie danych i różnicowa identyfikacja metabolitów
   1. Importuj surowe dane LC-MS (.raw pliki) do oprogramowania.
   2. Wykonaj wyrównanie szczytów, picking szczytów oraz korekcję poziomu bazowego.
   3. Normalizuj wyekstrahowane cechy powierzchni szczytowej do całkowitej intensywności jonów.
   4. Identyfikacja metabolitów poprzez dokładne dopasowanie wzorców fragmentacji masy (tolerancja masy < 5 ppm) i MS/MS z bazami mzCloud i ChemSpider.
   5. Przeprowadz wielowymiarową analizę statystyczną (PCA i OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Zdefiniuj różnicowe metabolity na podstawie następujących progów: VIP > 1,0 oraz p < 0,05 (test testosteronowy Studenta).

9. Analiza farmakologii sieciowej

UWAGA: Farmakologia sieci została wykorzystana do przewidywania aktywnych składników i kluczowych celów LXDHD w UC^35,36. Metodologia obejmuje eksplorację baz danych, przetwarzanie informacji chemicznych, pozyskiwanie danych o bioaktywności, pozyskiwanie celów białkowych, profilowanie ekspresji genów, konstrukcję sieci interakcji oraz analizę wzbogacania szlaków^37,38.

1. Aktywne badanie przesiewowe związków chemicznych
   1. Pobierz związki aktywne z bazy danych Traditional Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis (TCMSP) (dostęp 10 grudnia 2025) przy użyciu OB ≥ 30% oraz DL ≥ 0,18.
   2. Suplementy na podstawie wyszukiwań literatury w PubMed i Web of Science (10–15 grudnia 2025).
   3. Standaryzuj cele za pomocą bazy UniProt (dostęp 15 grudnia 2025).
2. Identyfikacja celów chorobowych
   1. Zbieraj cele związane z UC z baz danych GeneCards, OMIM, TTD oraz DrugBank (dostęp 15 grudnia 2025).
3. Konstrukcja i analiza sieci
   1. Zidentyfikuj przecinające się cele za pomocą pakietu VennDiagram w oprogramowaniu R.
   2. Zbuduj sieć za pomocą oprogramowania Cytoscape.
   3. Analizuj topologię za pomocą wtyczki NetworkAnalyzer oraz wtyczki CytoNCA.
4. Identyfikacja celów sieci PPI i rdzenia
   1. Importuj przecinające się cele do bazy STRING.
   2. Ogranicz gatunki do Homo sapiens.
   3. Usuń izolowane węzły.
   4. Zastosuj próg PPI > 0,9.
   5. Eksportuj dane i analizuj w oprogramowaniu.
   6. Oblicz DC, BC, EC, CC, NC i LAC.
   7. Przeprowadz filtrowanie oparte na medianach, aby wygenerować podsieci i zidentyfikować kluczowe cele³⁹.
5. Analiza wzbogacenia GO i KEGG
   1. Wykonaj wzbogacania GO i KEGG przy użyciu pakietów R i Bioconductor.
   2. Używaj pakietów R, w tym org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi i ggplot2.
   3. Ustaw progi istotności na p = 0,05 i q = 0,05.
   4. Przeprowadz analizę GO dla kategorii MF, BP i CC.
   5. Wykonaj wzbogacenie szlaku KEGG i klasyfikację⁴⁰.
6. Dokowanie molekularne
   1. Pobierz struktury złożone z TCMSP w formacie SDF.
   2. Pobierz struktury białek z AlphaFold w formacie PDB.
   3. Wykonaj dokowanie za pomocą serwera CB-DOCK2 (CADD Lab, Uniwersytet Syczuan, Chengdu, Chiny).
   4. Zdefiniuj odpowiednio pliki receptorów i ligandów.
   5. Zapisz optymalną pozycję wiązania i energię wiązania.
      UWAGA: Dokowanie wykonano za pomocą algorytmu^{genetycznego 41}. Wyniki były klasyfikowane według energii wiązania.

10. Analiza statystyczna

1. Przeprowadz analizę statystyczną za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.
2. Dane ilościowe wyrażaj jako średnią ± odchylenia standardowego (SD).
3. Test normalności za pomocą testu Shapiro–Wilka.
4. Test jednorodności wariancji za pomocą testu Browna–Forsythe'a.
5. Wykonaj jednokierunkową ANOVA za pomocą testu post hoc Tukeya dla danych normalnie rozproszonych.
6. Wykonaj test Kruskala–Wallisa z testem Dunna dla danych nieparametrycznych.
7. Rozważmy p < 0,05 jako statystycznie istotne.
   UWAGA: Mniejsza wartość p oznacza większą różnicę statystyczną między grupami.

Wyniki

Analiza farmakologii sieciowej LXDHD w UC

Farmakologia sieciowa została zastosowana do przewidywania potencjalnych celów terapeutycznych i molekularnych mechanizmów LXDHD w UC. Łącznie przeanalizowano 211 związków o korzystnych właściwościach farmakokinetycznych z bazy TCMSP, w tym 36 ze Scutellaria baicalensis, 37 z Phellodendron chinense, 10 z Rehmannia glutinosa, 11 z Paeonia suffruticosa, 29 z Paeonia veitchii, 5 z karbonizo...

Dyskusja

Metoda ta przedstawia wizualizowany, powtarzalny eksperymentalny workflow integrujący farmakologię sieci, metabolomikę nieukierunkowaną oraz walidację in vivo , aby zbadać przeciwzapalne działanie formuł TCM w myszim modelu UC indukowanego DSS. W przeciwieństwie do konwencjonalnych badań farmakologicznych, które koncentrują się głównie na pojedynczych wnioskach mechanistycznych, protokół ten podkreśla solidność samych ram metodologicznych, jednocześnie ujawniając kluczowe biologiczne wnioski. Główną zaletą tego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 5-aminosalicylowy (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Lek z pozytywną kontrolą na wrzodziejące zapalenie jelita grubego; podawano w dawce 100 mg/kg doustnie.
Acetonitryl (klasa LC-MS)	Merck	100030	Wykorzystywany do przygotowania próbek metabolomiki oraz fazy mobilnej LC-MS.
Baza danych o strukturze białek alfafałdowych	EMBL– Europejski Instytut Bioinformatyki	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Baza danych używana do uzyskania przewidywanych trójwymiarowych struktur białek docelowych.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 1,6 g).
CB-Dock2	Laboratorium CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Platforma internetowa wykorzystywana do molekularnego dokowania i przewidywania ligand– Tryby wiązania białek.
Aurantium cytrusowe (Zhi Ke)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,5 g).
Oprogramowanie do wykrywania związków	Thermo Fisher Scientific	Wersja 3.3	Wykorzystywane do przetwarzania danych LC–MS oraz identyfikacji złożonych.
CTAn Software	Bruker	Wersja 1.17	Wykorzystywane do rekonstrukcji obrazów 3D Micro-CT oraz analizy erozji kości.
Cytoscape	Konsorcjum Cytoscape	Wersja 3.8.0	Oprogramowanie wykorzystywane do budowy i wizualizacji sieci.
Dekran-siarczan sodu (DSS)	MP Biomedicals	160110	Masa cząsteczkowa 36 000 i ndash; 50 000 Da; Stosowany do wywoływania wrzodziejącego zapalenia jelita grubego u myszy.
Rurki antykoagulantowe EDTA-K2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	Nie ma	Wykorzystywane do pobierania krwi obwodowej.
Roztwór barwienia eozyną	Biosharp	Nie ma	Stosowany do cytoplazmatycznej kontrbarwienia w H& Bejcowanie E.
Etanol	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Stosowane do odwodnienia tkanek.
Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)	Merck	5.33002	Wykorzystywany do przygotowania fazy mobilnej LC-MS.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,5 g).
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	Wersja 9.0	Wykorzystywane do analizy statystycznej i prezentacji graficznej.
Analizator hematologiczny	Mindray	BC-2600vet	Trzyczęściowy analizator hematologii weterynaryjnej do analizy rutynowej krwi.
Roztwór barwienia hematoksylyny	Biosharp	BL700B	Używane w H& Barwienie E przekrojów tkanki jelita grubego.
Wirówka o dużych prędkościach	Hitachi	CT15E/CT15RE	Używany do surowicy i przygotowania próbek.
Zestaw IL-10 ELISA (mysz)	MEIMIAN	MM-0176M2	Używany do oceny poziomu IL-10 w surowicy.
IL-17 ELISA Kit (mysz)	Abclonal	RK00039	Używany do pomiaru poziomu IL-17 w surowicy.
IL-1β Zestaw ELISA (Mysz)	Abclonal	RK00006	Stosowany do wykrywania surowicy IL-1β poziomy.
Zestaw IL-6 ELISA (mysz)	Abclonal	RK00008	Używany do ilościowego pomiaru poziomu IL-6 w surowicy.
Oprogramowanie ImageJ (Fidżi)	Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH)	Wersja 1.53c	Oprogramowanie open source wykorzystywane do przetwarzania i ilościowania obrazów.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Wersja 3.7	Oprogramowanie obrazujące używane do rejestrowania preparatów histopatologicznych.
Metanol (klasa LC-MS)	Merck	106035	Wykorzystywany do przygotowania próbek metabolomiki oraz fazy mobilnej LC-MS.
Myszy (samiec C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	Nie ma	Zwierzęta doświadczalne (w wieku 6 lat i połącznie; 8 tygodni, 20 i ndash; 25 g) używanych w modelu UC indukowanego przez DSS.
baza mzCloud	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Baza danych używana do dopasowywania spektralnego MS/MS.
Mikroskop optyczny	Leica	DM500	Wykorzystywane do obserwacji histopatologicznych.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,6 g).
Paeonia suffruticosa cortex (Mu Dan Pi)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,5 g).
Paraformaldehyd (4%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	Nie ma	Używany do utrwalania tkanek jelita grubego.
Mikrotom patologiczny	Leica	RM2016	Wykorzystywane do przygotowania przekrojów tkanki parafinowej.
Phellodendron chinense (Huang Bo)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Składnik LXDHD (dawka: 0,7 g).
Q Exactive High-Resolution Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive	Spektrometr masowy oparty na orbitrapie do analizy LC–MS.
R Software	R Foundation for Statistical Computing	Wersja 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Oprogramowanie używane do analiz wzbogacania GO i KEGG.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składnikowe LXDHD (dawka: 0,3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Szpital Medycyny Chińskiej w prowincji Jiangsu	Grupa: 2409001	Zioło składne LXDHD (dawka: 0,5 g).
Pentobarbital sodu (1%)	Sigma-Aldrich	P3761	Stosowane do znieczulenia zwierząt przed pobraniem próbki.
SoftMax Pro Software	Urządzenia molekularne	Wersja 7.1	Oprogramowanie do pozyskiwania i analizy danych używane z czytnikiem mikropłyt do ELISA.
Baza danych STRING	Konsorcjum STRING	https://string-db.org/	Baza danych używana dla protein– Analiza interakcji białek.
Baza danych TCMSP	Platforma TCMSP	https://tcmsp-e.com/	Baza danych używana do przesiewania związków aktywnych i przewidywania celów leków.
TNF-α Zestaw ELISA (Mysz)	Abclonal	RK00027	Używany do określania surowicy TNF i alfa; Stężenia.
Ultimate 3000 RS LC System	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	System UHPLC połączony ze spektrometrią mas.
Czyścicielka ultradźwiękowa	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Używany do ultradźwiękowej ekstrakcji LXDHD.
Baza danych UniProt	Konsorcjum UniProt	https://www.uniprot.org/	Baza danych używana do standaryzacji nazw genów i białek.
Vortex Mixer	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vortex-P1	Używany do miksowania próbek.
Kolumna Welch AQ-C18 (150 & razy; 2,1 mm, 1,8 μ m)	Materiały Welch	AQ-18-15021	Kolumna używana do rozdzielania metabolitów i składników ziołowych.
Ksylen	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Wykorzystywany do oczyszczania tkanek podczas obróbki histologicznej.