Pomiar dynamiki translacji mRNA w żywych komórkach za pomocą rozszczepionego znakowania luminescencyjnego w komórkach HEK293

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiamy elastyczną, kompatybilną z wysokoprzepustowością metodę pomiaru dynamiki translacji żywego mRNA in cellulo w komórkach HEK293s, z wykorzystaniem rozdzielonego znakowania luminescencyjnego. Ten wszechstronny test pozwala odróżnić efekty strukturalne, wspiera optymalizację transkrypcji in vitro oraz usprawnia rozwój terapeutyków opartych na mRNA.

Streszczenie

Szybka opracowanie szczepionek w walce z COVID-19 zilustrowało potencjał terapeutyków opartych na matrycowym RNA (mRNA) w przekształcaniu procesów tworzenia leków. Podobnie jak dojrzałe mRNA, mRNA transkrybowane in vitro posiada te same elementy, w tym czapeczkę 5’, regiony niekodujące (UTR), sekwencję kodującą oraz ogon poli(A). Poprzednie prace badające wpływ tych komponentów na translację mRNA opierały się głównie na wysoko zmodyfikowanych białkach reporterowych, które wykazują wydajną translację i stabilność białkową. Ponieważ elementy strukturalne każdego mRNA w różny sposób wpływają na ich translację, konieczne jest zidentyfikowanie optymalnego projektu odpowiedniego dla konkretnego białka docelowego (POI). Aby umożliwić charakteryzację translacji POI, zastosowano system komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Krótki znacznik peptydowy (HiBiT), który może zostać połączony z dowolnym końcem POI, łączy się ze swoim komplementarnym heterodimerem (LgBiT), aby przywrócić aktywność enzymatyczną w obecności substratu przenikającego przez błony komórkowe. Do tej pory rozszczepione znakowanie luminescencyjne było wykorzystywane głównie w wysokoprzepustowych badaniach obrotu białek. Wykazaliśmy wcześniej, w jaki sposób rozszczepione znakowanie luminescencyjne może zostać zastosowane do wysokoprzepustowej kwantyfikacji translacji mRNA w czasie in cellulo w komórkach HEK293 konstytutywnie wykazujących ekspresję komplementarnego heterodimeru. W niniejszej pracy dodatkowo demonstrujemy wszechstronność tego testu i szczegółowo opisujemy, jak może on zostać wykorzystany do optymalizacji transkrypcji in vitro w celu redukcji kosztów. System testowy potrafi w unikalny sposób rozróżnić zmiany w komponentach strukturalnych, podkreślając jednocześnie efekty optymalizacji sekwencji kodującej przy użyciu genów niemodyfikowanych. Ponadto wykazujemy, że 4-krotna redukcja stężenia czapeczki 5’ podczas transkrypcji in vitro skutkuje równoważną translacją in cellulo. Wyniki te ilustrują, jak rozszczepione znakowanie luminescencyjne może być łatwo zintegrowane z procesem tworzenia terapeutyków mRNA, umożliwiając monitorowanie dynamiki ekspresji białek sterowanej przez mRNA w czasie rzeczywistym in cellulo, co oferuje wszechstronną metodę rozwoju terapeutyków opartych na mRNA.

Wprowadzenie

Terapie oparte na matrycowym RNA (mRNA) oraz zastosowania badawcze w tym zakresie gwałtownie rozwinęły się w ostatnich latach, co było napędzane sukcesem szczepionek mRNA^1,2 oraz rosnącym uznaniem wszechstronności RNA jako programowalnej biomolekuły. Kluczowym wyzwaniem w tej dziedzinie jest zdolność do ilościowej i dynamicznej oceny wydajności translacji mRNA w różnorodnych kontekstach. Opisana tutaj metoda – wykorzystująca system podzielonego znakowania luminescencyjnego – zapewnia elastyczną i skalowalną platformę do badania translacji mRNA na żywo in cellulo³. Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie badaczom pomiaru wpływu cech sekwencji, modyfikacji chemicznych i elementów strukturalnych na kinetykę translacji oraz późniejszy obrót białek, co stanowi potężne narzędzie do optymalizacji konstruktów mRNA w zastosowaniach terapeutycznych i podstawowych badaniach naukowych.

In vitro transkrybowany mRNA odzwierciedla podstawową architekturę dojrzałych transkrypcji, zawierając czapeczkę 5′, regiony nietranslacyjne (UTRs), sekwencję kodującą oraz ogon poli(A), przy czym często włącza się zmodyfikowane nukleotydy w celu zmniejszenia immunogenności^4,5. Liczne prace wykazały, że każdy z tych elementów – zarówno pojedynczo, jak i w kombinacjach – może zostać zaprojektowany tak, aby silnie wpływać na wydajność translacji i uzysk białka^6,7. Jednak większość wcześniejszych badań opierała się na wysoce zoptymalizowanych białkach reporterowych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP)⁷, NanoLuc⁸ lub białko kolca SARS-CoV-2^8,9, które są zaprojektowane tak, aby tłumaczyli się z wysoką wydajnością i wytwarzać bardzo stabilne białka, a zatem nie odzwierciedlają wyzwań występujących w kontekstach terapeutycznych. Ponieważ terapeutyczne mRNA kodują różnorodne białka docelowe (POI), z których każde podlega unikalnym ograniczeniom strukturalnym i regulacji specyficznej dla typu komórek, zasady projektowania maksymalizujące translację dla jednego konstruktu mogą nie być uniwersalne dla innego, co zgłaszano wcześniej³. Identyfikacja optymalnej konfiguracji dla danego terapeutycznego POI jest zatem niezbędna i wymaga metod, które potrafią czule i systematycznie oceniać, w jaki sposób poszczególne cechy transkryptu wpływają na wydajność produkcji białka.

Metody skoncentrowane na rybosomach, takie jak profilowanie polisomów, rozdzielają frakcje translacyjne za pomocą wirowania w gradiencie¹⁰, podczas gdy profilowanie rybosomów (Ribo-seq) zapewnia rozdzielczość na poziomie nukleotydów w zakresie zajętości rybosomów, miejsc inicjacji i pauzowania¹¹. Podobnie jak Ribo-seq, inne podejścia oparte na sekwencjonowaniu, takie jak sekwencjonowanie wysokoprzepustowe RNA izolowanego poprzez immunoprecypitację z sieciowaniem (HITS-CLIP) oraz oczyszczanie rybosomów translacyjnych za pomocą powinowactwa (TRAP), dodatkowo charakteryzują translację RNA związanych z białkami wiążącymi RNA lub RNA związanych z rybosomami¹². Choć potężne, techniki te wymagają złożonego przygotowania, specjalistycznego sprzętu i wiedzy obliczeniowej, co czyni je nieodpowiednimi do wysokoprzepustowego opracowywania terapeutycznego mRNA. Immunoprecypitacja łańcuchów powstających¹³ mierzy wydajność translacji przy użyciu białek z tagiem FLAG, immunoprecypitowanych z rybosomów i ilościowo określanych za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Mimo że metoda ta jest dostosowywalna do terapeutycznych mRNA, test jest pracochłonny, brakuje mu rozdzielczości czasowej i nie nadaje się do zastosowań wysokoprzepustowych. System SunTag¹⁴ umożliwia pomiary syntezy białek i regulacji translacji w żywych komórkach z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek mRNA i działa dzięki oddziaływaniu fragmentu zmiennego jednopalczastego przeciwciała (scFv) połączonego z GFP z tandemowymi powtórzeniami epitopu peptydowego. System ten umożliwia dynamiczne pomiary translacji i lokalizacji z rozdzielczością pojedynczego mRNA, dzięki czemu wykorzystano go do opracowania licznych systemów śledzenia łańcuchów powstających^15,16. Jednakże podejście to charakteryzuje się niską przepustowością i wymaga użycia mikroskopów o wysokiej mocy.

Mimo że znakowanie białka powstającego jest nieuniknione, zidentyfikowano możliwość zastosowania małego peptydu znacznikowego, pochodzącego z lucyferazy NanoLuc, w celu raportowania translacji mRNA w żywych komórkach. Lucyferaza NanoLuc została zmodyfikowana tak, aby podzielić ją na małą podjednostkę składającą się z 11 aminokwasów (HiBiT) oraz większą podjednostkę składającą się z 158 aminokwasów (LgBiT), które mogą szybko tworzyć dimer i, w obecności substratu, odtworzyć funkcjonalną lucyferazę^17,18. System dzielonego znakowania luminescencyjnego oferuje kilka kluczowych zalet w badaniach dynamiki mRNA. Po pierwsze, minimalny rozmiar małej podjednostki połączonej z białkiem zainteresowania (POI) sprawia, że zakodowana konstrukcja pozostaje jak najbliższa natywnemu białku. Ponieważ długość sekwencji kodującej może bezpośrednio wpływać na stosunki translacji¹⁹, zminimalizowanie długości znacznika poprawia nasze przewidywania dotyczące dynamiki translacji syntetycznych mRNA. Co kluczowe, ta strategia minimalnego znakowania umożliwia wykrycie różnic w translacji wywołanych synonimiczną zmiennością sekwencji kodującej, co pozwala na badanie efektywności translacji niezależnie od sekwencji lub stabilności białka³. Z tego powodu stosowanie większych znaczników, takich jak białka fluorescencyjne lub pełnowymiarowe lucyferazy, jest nieoptymalne. Po drugie, zastosowany tutaj system dzielonego znakowania luminescencyjnego umożliwia natychmiastowe generowanie sygnału. Jego szybka i wydajna reakcja komplementacji in cellulo charakteryzuje się wysokim powinowactwem (K_D = 700 pM) i była wykorzystywana do pomiaru modulacji obrotu białek z częstotliwością odczytów co 30 s¹⁸. Choć pierwotny system dzielonego znakowania luminescencyjnego był porównywany głównie z innymi systemami dzielonych lucyferaz^17,18, kluczową zaletą w tym kontekście jest to, że generowanie sygnału nie jest ograniczone przez dojrzewanie białka. W przeciwieństwie do tego, białka fluorescencyjne wymagają dojrzewania chromoforu, co może trwać od kilku minut do kilku godzin²⁰, ograniczając tym samym rozdzielczość czasową. Wreszcie, zastosowany tutaj ustalony system dzielonego znakowania luminescencyjnego pokonuje ograniczenia systemów dzielonych białek fluorescencyjnych, które zazwyczaj wymagają utworzenia chromoforu po komplementacji²¹, co wprowadza dodatkowe opóźnienie i ogranicza ich przydatność do rejestrowania szybkich, dynamicznych procesów. Wcześniejsze badania wykazały użyteczność dzielonego znakowania luminescencyjnego w testach obrotu białek i badaniach nad degradacją^22,23,24. Rozszerzenie tej uznanej technologii na kinetykę translacji stanowi znaczący postęp metodologiczny. Na przykład, choć profilowanie rybosomów może ujawnić gęstość rybosomów wzdłuż transkryptów, nie pozwala ono na łatwe uchwycenie dynamicznych zmian w tempie inicjacji lub elongacji translacji w różnych warunkach. Jak wykazano wcześniej³, ten system dzielonego znakowania luminescencyjnego może wykrywać różnice przy zmianie struktury czapeczki, składu 5′ niekodującego regionu (UTR), optymalizacji kodonów, modyfikacjach nukleotydowych oraz długości ogona poly(A), z których wszystkie są krytycznymi determinantami efektywności translacji. Taka szeroka stosowalność sprawia, że metoda ta jest wyjątkowo potężnym narzędziem do analizy wkładu poszczególnych cech mRNA w całkowitą produkcję białka. Warto zauważyć, że w zależności od użytego urządzenia, technologia ta pozwala na gromadzenie danych zarówno z pojedynczych komórek, jak i z całej studzienki. Platformy obrazowania zdolne do pozyskiwania obrazów opartych na luminescencji umożliwiają wykorzystanie tej technologii do badania dynamiki translacji w pojedynczych komórkach. Tutaj skupiamy się na zastosowaniu w czytnikach płytek, w oparciu o studzienki, ze względu na ich średnią lub wysoką przepustowość oraz minimalne wymagania dotyczące analizy danych.

Badacze rozważający zastosowanie tej metody powinni ocenić jej przydatność w odniesieniu do swoich konkretnych celów eksperymentalnych. Analiza ta jest szczególnie cenna w sytuacjach, gdy wymagany jest wysokoprzepustowy screening syntetycznych konstruktów mRNA, na przykład w procesach projektowania terapeutyków opartych na mRNA. Nadaje się ona do analiz porównawczych cech sekwencji syntetycznego mRNA – w tym regionów nietranslowanych, wykorzystania kodonów lub modyfikacji nukleotydowych – gdzie można wykryć subtelne różnice w wydajności translacji³. Dzięki temu, że system jest kompatybilny z platformami translacji bezkomórkowej, analizami w żywych komórkach oraz lityczną analizą w określonych punktach czasowych, oferuje on elastyczność badaczom pragnącym dostosować projekt eksperymentalny do badań mechanistycznych lub badań stosowanych. Jednocześnie ważne jest rozpoznanie ograniczeń tej techniki. Co kluczowe, analiza z rozdzielnym znakowaniem luminescencyjnym nie zapewnia rozdzielczości stopnia zajętości rybosomów, co pozostaje unikalną możliwością podejść opartych na ribosome footprinting, ani nie mierzy bezpośrednio stabilności lub degradacji RNA, co może wymagać oceny przy użyciu metod komplementarnych. Jednak ze względu na ograniczenia istniejących technik rybo-centrycznych, badacze polegają na analizach opartych na znacznikach, takich jak system rozdzielnej luminescencji, aby badać rozdzielczą w czasie ekspresję białek sterowaną przez mRNA jako wskaźnik dynamiki translacji. Zatem, choć system ten jest potężnym narzędziem do monitorowania ekspresji białek sterowanej przez syntetyczne mRNA, jego zasadność zależy od tego, czy pytanie badawcze koncentruje się na dynamicznej produkcji białka, a nie na szczegółowym pozycjonowaniu rybosomów lub rozpadzie RNA.

Podsumowując, system rozdzielczego znakowania luminescencyjnego stanowi potężną i wszechstronną metodę badania translacji mRNA. Jego nadrzędnym celem jest dostarczenie badaczom elastycznego, skalowalnego i wysokoprzepustowego narzędzia, zdolnego do wykrywania różnic w wydajności syntezy białek wynikających z zastosowania syntetycznego mRNA o zróżnicowanych elementach sekwencyjnych i strukturalnych³. Uzasadnieniem dla jego opracowania była chęć przełamania ograniczeń istniejących technik poprzez zapewnienie przewagi w zakresie czułości, skalowalności i rozdzielczości czasowej. Metoda ta, osadzona w szerszej literaturze dotyczącej biologii i terapeutyki RNA, stanowi cenny dodatek do instrumentarium eksperymentalnego, umożliwiając zarówno zdobycie fundamentalnych informacji, jak i postępy w badaniach translacyjnych. Dzięki starannej analizie zalet i ograniczeń tego testu, badacze mogą określić jego przydatność dla konkretnych zastosowań, maksymalizując tym samym jego wpływ na dynamicznie rozwijającą się dziedzinę nauki o RNA.

Protokół

Graficzne przedstawienie całego protokołu pokazano na Rysunku 1.

1. Przygotowanie matrycy do transkrypcji in vitro (IVT)

UWAGA: Aby przygotować matrycę DNA do IVT, należy upewnić się, że plazmidowy DNA zawiera promoter polimerazy RNA (zazwyczaj T7 lub SP6), regiony 5’ i 3’ UTR oraz otwartą ramkę odczytu białka zainteresowania (POI) (Rysunek 1).

1. Zlinearyzuj plazmidowe DNA przy użyciu enzymu restrykcyjnego z pojedynczą stroną cięcia znajdującą się za 3’ UTR i przygotuj reakcję zgodnie z instrukcjami producenta. Po inkubacji oczyść produkt trawienia restrykcyjnego za pomocą zestawu do oczyszczania DNA opartego na kolumnach wirowych. Ilościowo określ zawartość DNA za pomocą spektrofotometru.
2. Aby potwierdzić linearyzację, przygotuj 1% żel agarozowy w buforze TAE zawierający barwnik do DNA bromek etydyny w stężeniu 0,1 µg/mL. Wymieszaj 150 ng trawionego DNA z wodą i barwnikiem do nakładania próbek. Nanieś na żel agarozowy próbkę, niecięty plazmid oraz drabinę DNA, a następnie prowadź elektroforezę przy 100 V przez 40 min w 1× buforze Tris-kwas octowy-EDTA (TAE). Wizualizuj wynik za pomocą systemu obrazowania żeli.
   OSTROŻNIE: Roztwór bromku etydyny jest silnym mutagenem i wymaga ostrożnego obchodzenia się przy użyciu odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).
3. Jeśli plazmidowe DNA nie posiada ogona poli(A) bezpośrednio za 3’ UTR, wprowadź go za pomocą PCR. Przeprowadź reakcję PCR zgodnie z instrukcjami producenta, używając polimerazy o wysokiej wierności oraz odpowiednio zaprojektowanych starterów. Upewnij się, że amplikon zawiera promotor T7, otwartą ramkę odczytu oraz ogon poli(A).
   UWAGA: Technologie cappings mogą mieć specyficzne wymagania dotyczące sekwencji w obrębie promotora T7; wymagania te można spełnić poprzez odpowiedni projekt startera forward. Starter reverse wiąże się z końcem 3’ UTR i wprowadza ogon poli(A) (zalecana długość co najmniej 80 T). W przypadku konstruktów o wysokiej zawartości GC zaleca się zastosowanie PCR stopniowego (step-up PCR) i/lub 3% DMSO.
4. Aby potwierdzić powodzenie reakcji PCR, przygotuj żel agarozowy w buforze TAE zawierający bromek etydyny (patrz krok 1.2). Jeśli długość konstruktu wynosi ≥1 kb lub <1 kb, przygotuj odpowiednio żel 1% lub 2%. Wymieszaj 5 µL reakcji PCR z wodą i barwnikiem do nakładania próbek. Nanieś na żel agarozowy zarówno próbkę, jak i drabinę DNA, a następnie prowadź elektroforezę przy 100 V przez 40 min w buforze TAE. Wizualizuj wynik za pomocą systemu obrazowania żeli.
5. Po potwierdzeniu wielkości produktu PCR, oczyść reakcję PCR za pomocą zestawu do oczyszczania DNA opartego na kolumnach wirowych. Eluuj w 15–20 µL buforu do elucji (często dostarczanego w zestawie do oczyszczania DNA) lub wody wolnej od nukleaz, aby skoncentrować matrycę DNA do zastosowania w IVT. Ilościowo określ zawartość DNA za pomocą spektrofotometru.

2. Transkrypcja in vitro

1. Przed rozpoczęciem spryskać i przetrzeć blat, rękawice oraz pipety roztworem do dekontaminacji RNaz. Aby zwiększyć wydajność i jakość, należy przeprowadzić tę procedurę w sterylnym dygestorium.
2. Rozmrozić i przygotować składniki zestawu do transkrypcji in vitro (IVT) opartego na T7 zgodnie z instrukcją producenta.
   UWAGA: Niektórzy producenci zalecają stosowanie ditiotreitolu (DTT, 0,1 M) w celu ograniczenia utleniania reakcji i poprawy wydajności. Ten krok jest zalecany, jeśli jest on zgodny z zestawem. W przypadku stosowania modyfikowanych dNTP, zastąpić odpowiedni niemodyfikowany nukleotyd taką samą ilością nukleotydu modyfikowanego. Oceń wydajność na podstawie połowy reakcji, ponieważ nie zaobserwowano istotnej poprawy wydajności przy pełnej reakcji. Przy syntezie więcej niż jednego mRNA zaleca się przygotowanie master mixu, aby zredukować błędy pipetowania i zmienność.
3. Pipetować, wymieszać dokładnie i krótko, a następnie inkubować w 37 °C przez 5 h z podgrzewaną pokrywą, aby uniknąć kondensacji. W razie potrzeby przedłużyć inkubację do nocy, ponieważ ma to minimalny wpływ na wydajność lub integralność mRNA.
4. Dodać 1 µL DNazy I i dokładnie wymieszać pipetą. Inkubować w 37 °C przez 30 min.
5. Oczyszczanie RNA transkrybowanego in vitro (IVT)
   1. Oczyścić produkt reakcji IVT, używając zestawu do oczyszczania RNA opartego na kolumnach, zgodnie z instrukcją producenta (różne zestawy mogą prowadzić do różnego stopnia odzyskania i mieć różną pojemność wiążącą). Do elucji dodać 60 µL wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min przed wirowaniem.
   2. Alternatywnie można zastosować wytrącanie chlorkiem litu jako tańsze i bardziej elastyczne podejście.
      1. Dodać do reakcji równą objętość 7,5 M chlorku litu, wymieszać i inkubować w -20 °C przez noc.
      2. Wirować przy 18 300 × g przez 20 min w 4 °C, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając granulatu RNA.
      3. Przemyć 950 µL 70% etanolu i wirować przy 18 300 × g przez 5 min w 4 °C. Usunąć nadsącz, pozostawić granulat do wyschnięcia przez około 5 min w temperaturze pokojowej i resuspenderować w wodzie wolnej od nukleaz (standardowo 60 µL; zmniejszyć objętość w zależności od wielkości granulatu, aby zwiększyć stężenie).
         OSTRZEŻENIE: Chlorek litu może powodować podrażnienie skóry lub oczu, jeśli nie zastosuje się odpowiednich środków ochrony indywidualnej. Podczas pracy stosować rękawice i ochronę oczu. Ponadto etanol jest cieczą łatwopalną i może powodować podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od otwartego ognia i stosować odpowiednie ŚOI, w tym ochronę oczu.
6. Oznaczyć ilość mRNA za pomocą spektrofotometru. Upewnić się, że stosunek A260/A280 dla mRNA wynosi ~2,0 i potwierdzić, że stosunek A260/A230 mieści się w przedziale od 1,8 do 2,2.
7. Aby potwierdzić pomyślny przebieg IVT, przygotować 1% żel agarozowy TAE (niedenaturujący) zawierający bromek etydyny. Wymieszać 500 ng mRNA z wodą i barwnikiem do ładowania, a następnie postępować zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą przygotowania drabinki RNA i instrukcjami denaturacji. Nałożyć próbki na żel agarozowy i prowadzić elektroforezę przy 80 V przez 40 min w buforze TAE. Wizualizować za pomocą systemu do obrazowania żeli.
8. W celu dalszego potwierdzenia prawidłowego rozmiaru mRNA, przeanalizować próbki za pomocą Bioanalizatora.
9. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, podzielić mRNA na aalikwoty w objętościach wymaganych do eksperymentu. Na przykład: zastosować 1,2 pmol mRNA na studzienkę w płytce 96-dołkowej. W związku z tym odmierzyć odpowiednią objętość dla 1,2 pmol × n powtórzeń, a następnie przechowywać w -80 °C.

3. Odwrócona transfekcja komórek HEK293

UWAGA: W celu przeprowadzenia pomiarów czasowych wymagana jest linia komórkowa konstytutywnie ekspresująca komplementarny fragment lucyferazy. Można to osiągnąć poprzez stworzenie stabilnej linii komórkowej za pomocą transfekcji plazmidu ekspresującego wymagany fragment lucyferazy i następującą po niej selekcję klonalną. Pozwala to użytkownikowi na pomiar rozdzielonych w czasie dynamik translacji mRNA w dowolnym wybranym tle komórkowym. Alternatywnie można zakupić linie komórkowe ekspresujące wymagany fragment lucyferazy. Opisywane eksperymenty przeprowadzono z użyciem komórek HEK293 konstytutywnie ekspresujących komplementarny heterodimer.

1. Przed rozpoczęciem rozmrozić mRNA na lodzie, aby uniknąć degradacji.
2. Przygotować kompleksy do transfekcji. Dla płytki 96-dołkowej wymagane jest 1,2 pmol mRNA na dołek. W przypadku pracy w duplikacie należy przygotować ilość odpowiadającą 2,5 duplikatom, aby zrekompensować błędy pipetowania. W związku z tym należy połączyć 3 pmol mRNA z pożywką Opti-MEM Reduced Serum Medium do uzyskania końcowej objętości 50 µL (20 µL/dołek).
3. Dodać 0,5 µL kationowego odczynnika do transfekcji opartego na lipidach (0,2 µL/dołek), wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej. Po 5 min inkubacji wymieszać przez pipetowanie w górę i w dół, a następnie dodać po 20 µL na dołek do białej mikroplateki 96-dołkowej z płaskim dnem. Sugeruje się, aby dołki przeznaczone do transfekcji znajdowały się w centrum płytki, pozostawiając wolne dołki brzegowe.
4. Przygotować komórki HEK293 poprzez usunięcie pożywki i przemycie 2 mL solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) bez Ca²⁺ i Mg²⁺. Usunąć roztwór do płukania i dodać 500 µL Trypsyny-EDTA, następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 min.
5. Podczas dysocjacji komórek napełnić dołki brzegowe płytki 96-dołkowej PBS, aby zmniejszyć parowanie pożywki podczas hodowli komórkowej. Jeśli wymagane jest wykorzystanie wszystkich dołków, przestrzeń między nimi można wypełnić PBS.
6. Dodać 4,5 mL modyfikowanej pożywki Eagle’a Dulbecco (DMEM) uzupełnionej o 1× L-glutaminę i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu zebrania komórek. Wykonać zliczenie komórek przy użyciu hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
7. Przenieść wymaganą liczbę komórek (odpowiadającą 1 x 10⁵ komórek do wysiania na dołek) oraz ilość na 3 dodatkowe dołki (na wypadek błędów pipetowania) do nowej probówki i wirować przy 500 × g przez 2 min.
8. Usunąć nadsącz i resuspenderować komórki w wymaganej objętości pożywki Leibovitz’s L-15 (wolnej od fenolu) uzupełnionej o 10% FBS oraz substrat do żywych komórek Endurazine Live Cell Substrate (1:200), aby zapewnić końcowe stężenie 1 × 10⁶ komórek/mL. Wymieszać za pomocą pipety serologicznej, aby zapewnić dokładne wymieszanie Endurazine. Napippetować 100 µL (1 × 10⁵ komórek) resuspenderowanych komórek na dołek.
   UWAGA: W przypadku przeprowadzania eksperymentów z przebiegiem czasowym trwających 72 h, zwiększyć objętość do 200 µL, aby uniknąć parowania.
9. Bezpośrednio po transfekcji umieścić komórki w czytniku płytek (luminometrze) ustawionym na 37 °C. Wykonywać pomiary w regularnych odstępach czasu z czasem integracji 1 s. Ze względu na efektywną komplementację systemu sygnał jest wykrywalny w ciągu kilku minut. Dlatego, aby uzyskać dokładny odczyt linii bazowej, ten krok musi zostać wykonany bezzwłocznie. Przedziały te zależą od eksperymentu i instrumentu; jednak w tych badaniach za optymalne uznano pomiary co 12 min dla eksperymentów z przebiegiem czasowym 18 h oraz co 48 min dla eksperymentów trwających 72 h. Pomiar luminescencji nie wymaga filtra; lepszy stosunek sygnału do szumu zaobserwowano przy użyciu filtra 530–540 nm.
   UWAGA: Sygnał transferu energii rezonansowej bioluminescencji (BRET) jest generowany przez eGFP z tagiem rozszczepionej lucyferazy, zatem filtr 530–540 nm wychwyci zarówno sygnał luminescencyjny, jak i fluorescencyjny. Aby uniknąć wychwycenia sygnału BRET, należy użyć filtra 460–480 nm lub alternatywnie zastosować białko niefluorescencyjne, takie jak MYL3, jako referencję.

4. Analiza danych

1. Oblicz krotność zmiany (fold change) w relatywnych jednostkach luminescencji (RLU), normalizując sygnał dla każdego warunku do jego pierwszego punktu czasowego (t0, znormalizowanego do średniej z powtórzeń technicznych), ponieważ sygnał na początku testu stanowi poziom tła.
2. Zmniejsz zmienność między powtórzeniami biologicznymi poprzez normalizację względem warunku kontrolnego.
3. Wybierz metodę analizy statystycznej dla testu: albo dla pojedynczego punktu czasowego, albo dla pola pod krzywą (AUC) — w zależności od stawianego pytania badawczego.
   1. W przypadku pojedynczego punktu czasowego, wykorzystaj punkty czasowe, w których występuje szczytowa ekspresja (co zależy od badanego białka, POI), wraz z punktem końcowym. Przedstaw na wykresie wartość RLU obliczoną w kroku 4.1 dla konkretnego punktu czasowego (np. 240 min) i przeanalizuj ją za pomocą odpowiedniego testu statystycznego.
   2. Zmierz dynamikę translacji i degradacji białka, obliczając AUC dla określonego przedziału czasowego (t.j. od t0 do 240 min) lub dla całego czasu trwania testu (t.j. od t0 do punktu końcowego). Znormalizuj wartość AUC dla każdego powtórzenia biologicznego do średniej dla referencyjnego mRNA, co pozwoli uzyskać miarę krotności zmiany AUC, którą można przeanalizować za pomocą odpowiednich testów statystycznych.

Wyniki

Istnieje kilka sposobów na optymalizację kosztowej efektywności tego protokołu. Na przykład reakcję IVT zminiaturizowano do połowy objętości zalecanej przez producenta i stwierdzono, że uzyskana wydajność zaspokaja ilość wymaganą do eksperymentów in cellulo. Należy zauważyć, że długość i złożoność sekwencji wpływają na wydajność IVT, zatem pomyślna optymalizacja protokołu powinna przynieść co najmniej 50 µg mRNA na jedną reakcję IVT. Podobnie jak zestawy do reakcji IVT, odczynniki do cappingu również często są bardzo kosztowne. Biorąc pod uwagę, że na jedną cząsteczkę mRNA wymagana jest tylko jedna czapeczka, wysunęliśmy hipotezę, że reakcja IVT zawiera nadmiar cząsteczek czapeczki w stosunku do wynikowej liczby cząsteczek mRNA. W związku z tym zbadano, czy protokół można dalej zoptymalizować poprzez miareczkowanie ilości odczynnika do cappingu dodawanego do reakcji IVT, których wyniki przedstawiono na Rysunku 2. Do reakcji IVT o objętości 10 µL dodano odpowiednio 100% (stężenie końcowe czapeczki 10 mM), 50%, 25% lub 0% (bez cappingu) odczynnika do cappingu, a otrzymane mRNA eGFP przetransfekowano do komórek HEK293 konstytutywnie ekspresujących komplementarny heterodimer. Jako kontrolę normalizacji przetransfekowano również MYL3 (100% cappingu), ponieważ ten gen endogenny, kodujący białko strukturalne wzbogacone w mięśniach, wykazuje dynamikę translacji podobną do eGFP, jednak z sygnałem bliższym sygnałowi innych genów endogennych³. Zgodnie z wcześniejszymi danymi³, nieoczapowane mRNA eGFP spowodowało brak translacji analogiczny do kontroli mock (Rysunek 2A). mRNA eGFP syntetyzowane z 25% lub 50% zalecanego odczynnika do cappingu wykazało poziomy ekspresji porównywalne z 100% (Rysunek 2A), co nie spowodowało różnic w wartościach pola pod krzywą (AUC) w ciągu 18 h (Rysunek 2B). Wyniki te wskazują, że w tych warunkach odczynnik do cappingu występuje w nadmiarze i że zmniejszenie jego stężenia nie upośledza wydajności translacji, co jest zgodne z wystarczającym wbudowaniem czapeczki. Wnioski przedstawione na Rysunku 2 są specyficzne dla użytej marki odczynnika do cappingu i powinny zostać zoptymalizowane dla innych odczynników.

Podczas gdy postępy w technologii czapeczek oraz wprowadzenie zmodyfikowanych nukleotydów zwiększyły ekspresję mRNA, rozwój algorytmów projektowania mRNA przyczynił się do jej dalszej poprawy. Algorytmy te koncentrują się na optymalizacji stabilności mRNA i wykorzystania kodonów poprzez odpowiednią poprawę minimalnej energii swobodnej (MFE) oraz indeksu adaptacji kodonów (CAI). Aby przetestować wpływ optymalizacji na ekspresję mRNA, wykorzystano program LinearDesign⁹. Algorytm ten opiera się na wprowadzeniu wartości lambda, która jest parametrem skalującym używanym w formułach optymalizacyjnych i określa, w jakim stopniu algorytm faworyzuje MFE lub CAI. Te same ustawienia optymalizacji (tj. ta sama wartość lambda) zastosowano do czterech czynników transkrypcyjnych – HAND2, GATA4, MEF2C i TBX5. Rysunek 3 analizuje wpływ optymalizacji na tempo translacji. Optymalizacja poprawiła wartości zarówno MFE, jak i CAI dla wszystkich czynników transkrypcyjnych, przy czym MEF2C wykazał największe zmiany w obu parametrach (Rysunek 3A). Do C-końca każdego konstruktu przyłączono rozszczepiony znacznik luminescencyjny, poprzedzony linkerem GS, a następnie zsyntetyzowano mRNA dla wszystkich czterech czynników transkrypcyjnych w formach nieoptymalizowanych i optymalizowanych. Aby upewnić się, że każde mRNA może zostać przetranslowane i wytworzyć białko o oczekiwanej masie cząsteczkowej, zastosowano bezkomórkowy system translacji z lizatu retikulocytów króliczych³. Otrzymane białka rozdzielono za pomocą western blotu, wykorzystując podjednostkę enzymatyczną białka lucyferazy rozszczepionej oraz odpowiedni substrat do detekcji rozszczepionego znacznika luminescencyjnego. Western blotting wykazał, że optymalizacja nadal pozwalała na otrzymanie białek o masie cząsteczkowej zgodnej z oczekiwaną (Rysunek 3B). Komórki HEK293 przetransfekowano nieoptymalizowanymi lub optymalizowanymi formami każdego czynnika transkrypcyjnego, a następnie prowadzono rejestrację żywych komórek przez 18 h. Dla wszystkich eksperymentów 18-godzinnych wykonano pomiary z trzech powtórzeń biologicznych, a w każdym powtórzonym eksperymencie zastosowano trzy powtórzenia techniczne na próbkę. Optymalizacja HAND2 (Rysunek 3C) i GATA4 (Rysunek 3D) nie miała wpływu na ekspresję (co określono za pomocą nieparzystego testu t dla dwóch prób), wykazując odpowiednio 1,07-krotny wzrost i 1,25-krotny spadek w porównaniu z ich nieoptymalizowanymi odpowiednikami. Tymczasem optymalizacja MEF2C (Rysunek 3E) i TBX5 (Rysunek 3F) doprowadziła do statystycznie istotnego wzrostu ekspresji, z odpowiednio 2,25-krotnym (P = 0,0486, n = 3, nieparzysty test t dla dwóch prób) i 1,72-krotnym (P = 0,0379, n = 3, nieparzysty test t dla dwóch prób) wzrostem AUC w stosunku do ich odpowiednich wersji nieoptymalizowanych. Zgodnie z tymi danymi, różnice zaobserwowano nie tylko w końcowej ekspresji, ale także w kształcie i tempie krzywych ekspresji, co wskazuje, że test pozwala rozdzielić zmiany w dynamice translacji w czasie. Aby ustalić, czy ten wzrost ekspresji utrzymuje się przez dłuższy okres, komórki HEK293 przetransfekowano mRNA MEF2C i prowadzono rejestrację przez 72 h (Rysunek 3G). Podobnie jak w eksperymentach 18-godzinnych, wykonano pomiary z trzech powtórzeń biologicznych i zastosowano trzy powtórzenia techniczne na próbkę w każdym powtórzonym eksperymencie. Podobnie jak zaobserwowano po 18 h, zoptymalizowane MEF2C znacząco zwiększyło ekspresję, wykazując 2,5-krotną (P = 0,0061, n = 3, nieparzysty test t dla dwóch prób) poprawę AUC w porównaniu z wersją nieoptymalizowaną. Chociaż optymalizacja powoduje znaczny wzrost ekspresji, wyniki te pokazują, że w tym przypadku optymalizacja nie zapobiega degradacji w ciągu 72 h, gdyż obie formy MEF2C wykazały podobne nachylenia krzywych od 24 h wzwyż. Spadek ten wynika prawdopodobnie z liniowej degradacji mRNA i/lub podziałów komórkowych. Łącznie wyniki te demonstrują potencjał algorytmów projektowania mRNA w poprawie ekspresji mRNA; podkreślają one jednak, że optymalizacja musi być przeprowadzana w sposób zależny od konkretnego białka zainteresowania (POI).

Rysunek 1: Schemat syntezy mRNA i testu z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym w komórkach HEK293. Aby przeprowadzić IVT na potrzeby testu z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym, należy upewnić się, że plazmid zawiera promotor polimerazy RNA (T7 lub SP6), regiony 5’ i 3’ UTR oraz sekwencje kodujące badane białko połączone z krótką podjednostką lucyferazy HB (HiBiT). Plazmid jest linearyzowany za pomocą enzymu restrykcyjnego tnącego w jednym miejscu, co dostarcza matrycy do Poly T PCR, która następnie służy jako matryca do IVT. Syntetyzowane mRNA jest kompleksowane z liposomami i odwrotnie transfekowane do komórek HEK293 konstytutywnie ekspresyjących większą podjednostkę lucyferazy (LB), które można niezwłocznie umieścić w czytniku płytek w celu pomiaru zapisów na żywo. Po zakończeniu eksperymentu przeprowadza się analizę danych w celu normalizacji i późniejszej analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Czterokrotna redukcja stężenia odczynnika do cappingu daje ekspresję eGFP porównywalną z pełnym stężeniem. (A) Kinetyczny test żywych komórek w komórkach HEK293 transfekowanych mRNA eGFP z różnymi stężeniami odczynnika do cappingu, MYL3 lub Mock, dane znormalizowane do t₀; kropki reprezentują średnią z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych dla każdego punktu czasowego. (B) Krotność zmiany AUC krzywych dla 18-godzinnego przebiegu czasowego z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych została uzyskana poprzez normalizację do próbki referencyjnej MYL3 i porównana za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM), gdzie każda kropka reprezentuje średnią z powtórzenia biologicznego. ***P < 0.001. (eGFP – wzmocnione zielone białko fluorescencyjne; AUC – pole pod krzywą; RLU – względne jednostki luminescencji) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Optymalizacja sekwencji poprawia translację mRNA w sposób zależny od POI. (A) Optymalizacja sekwencji mRNA za pomocą LinearDesign doprowadziła do zmniejszenia wartości minimalnej energii swobodnej (MFE) oraz zwiększenia indeksu adaptacji kodonów (CAI) dla każdego czynnika transkrypcyjnego. (B) Reakcje RRL prowadzono przez 120 min z mRNA kodującym nieoptymalizowane i optymalizowane HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 lub bez RNA. Otrzymane białka poddano analizie western blotting i wykryto metodą chemiluminescencji poprzez inkubację membrany z podjednostką enzymatyczną w systemie split lucyferazy i odpowiednim substratem. Kinetyczny test żywych komórek w komórkach HEK293 transfekowanych nieoptymalizowanym lub optymalizowanym HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E) lub TBX5 (F), wraz z MYL3 oraz Mock. Dane znormalizowano do t₀, a kropki reprezentują średnią z trzech powtórzeń biologicznych dla każdego punktu czasowego. Krotność zmiany AUC krzywych dla 18-godzinnego przebiegu trzech powtórzeń biologicznych uzyskano poprzez normalizację do próbki referencyjnej MYL3 i porównano za pomocą nieparzystego testu t z poprawką Welcha. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, gdzie każda kropka reprezentuje średnią z powtórzenia biologicznego. *P < 0.05. (G) Kinetyczny test żywych komórek w komórkach HEK293 transfekowanych nieoptymalizowanym lub optymalizowanym MEF2C, MYL3 i Mock; dane znormalizowano do t₀, kropki reprezentują średnią z trzech powtórzeń biologicznych dla każdego punktu czasowego. Krotność zmiany AUC krzywych dla 72-godzinnego przebiegu trzech powtórzeń biologicznych uzyskano poprzez normalizację do próbki referencyjnej MYL3 i porównano za pomocą nieparzystego testu t z poprawką Welcha. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM , gdzie każda kropka reprezentuje średnią z powtórzenia biologicznego. **P < 0.01. (MFE – minimalna energia swobodna; CAI – indeks adaptacji kodonów; RRL – lizat retikulocytów królika; AUC – pole pod krzywą, RLU – względne jednostki luminescencji) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Dziedzina terapeutyków opartych na mRNA rozwijała się w ostatnich latach gwałtownie, co podkreśla znaczenie projektowania i optymalizacji sekwencji jako krytycznego etapu procesu opracowywania leków. Znaczące wysiłki skupiono na tworzeniu narzędzi obliczeniowych do przewidywania najskuteczniejszych struktur i składów RNA, przy czym szczególną uwagę poświęcono optymalizacji sekwencji^8,9. Choć narzędzia te są potężne, eksperymentalna walidacja tych projektów wciąż stanowi niezbędny element procesu. Walidacja ta opierała się jednak w dużej mierze na białkach reporterowych, w tym GFP⁷, NanoLuc⁸ oraz białku kolca SARS-CoV-2⁹ , które są białkami niezwykle stabilnymi i wykazującymi wysoką efektywność translacji. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, do schematu badawczego włączono system rozdzielonej lucyferazy w celu analizy dynamiki translacji mRNA transkrybowanego in vitro w komórkach HEK293, co umożliwiło rozdzielczość czasową³ i wykazało ograniczenia wynikające z użycia białek reporterowych przy wykrywaniu zmian w translacji po inżynierii mRNA. Artykuł opisujący tę metodę przedstawia kroki niezbędne do wykonania tego testu oraz ilustruje, że reakcję IVT można zminiaturyzować, a stężenie czapeczki 5’ można zmniejszyć bez konsekwencji dla translacji, co pozwala na redukcję kosztów. Opierając się na naszych wcześniejszych obserwacjach, wskazujemy, że aby osiągnąć zwiększoną ekspresję, wymagane jest podejście do optymalizacji sekwencji mRNA zależne od POI.

Jak opisano w niniejszym opracowaniu, test z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym jest stosunkowo prostym schematem umożliwiającym pomiary translacji mRNA o średniej przepustowości, co pozwala użytkownikom badać czasową ekspresję badanego białka (POI) w czasie rzeczywistym. Istnieje jednak szereg krytycznych kroków i kwestii, które należy uwzględnić, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Po pierwsze, wszystkie wyniki końcowe zależą od jakości mRNA, co zaczyna się od transkrypcji in vitro (IVT) i dekontaminacji sprzętu wykorzystywanego w tym procesie. Po syntezie kluczowe jest przechowywanie mRNA, które po elucji należy trzymać w lodzie, a po potwierdzeniu wielkości mRNA, należy je podzielić na alykwoaty w objętościach roboczych, aby zapobiec cyklom zamrażania i rozmrażania; mRNA powinno być przechowywane w temperaturze -80°C. Po drugie, kluczowe znaczenie ma rodzaj użytej płytki 96-dołkowej, która musi być jednolita we wszystkich eksperymentach. W przypadku niniejszego protokołu należy upewnić się, że zastosowano w pełni białą płytkę 96-dołkową. W przypadku konieczności monitorowania morfologii komórek można zastosować płytki z przezroczystym dnem i białymi ściankami; dają one jednak znacznie słabszy sygnał, dlatego te dwa typy płytek nie są zamienne. Zaobserwowano, że podczas pomiaru translacji tych samych mRNA w płytce z przezroczystym dnem i białymi ściankami, otrzymany sygnał luminescencyjny był 5-krotnie niższy niż w równolegle badanej płytce w pełni białej. Uwaga techniczna ta może mieć istotne znaczenie przy ocenie genów o nieefektywnej dynamice translacyjnej. Poza wprowadzaniem niespójności do danych, redukcja sygnału może uniemożliwić wykrycie subtelnych różnic wywołanych przez sekwencję mRNA lub zaburzenia strukturalne. Po trzecie, użycie pożywki L-15 jest kluczowe dla tego testu, ponieważ zapewnia ona żywotność komórek w środowisku bez suplementacji CO₂²⁵, co zapewnia elastyczność w wyborze luminometru. Ponadto stosowanie pożywki L-15 wolnej od fenolu redukuje sygnał tła podczas pomiaru luminescencji. Wreszcie, hodowlę i pomiar luminescencji należy przeprowadzać w temperaturze 37°C (lub w warunkach hodowli właściwych dla badanego typu komórek). Przeprowadzenie tego eksperymentu w temperaturze pokojowej znacznie zmieni wyniki, ponieważ tempo elongacji translacji ulegnie obniżeniu²⁶, co oznacza, że nie zaobserwuje się normalnej kinetyki.

Wszechstronność projektowania mRNA transkrybowanego in vitro można przenieść na proces syntezy, co pozwala na liczne modyfikacje. Jak zaobserwowano, stężenie czapki 5’ może zostać zredukowane 4-krotnie, a mimo to nadal osiągać porównawalną ekspresję, co pozwala badaczom obniżyć koszty. Choć wydajność cappingu nie była bezpośrednio mierzona po IVT, zwiększenie proporcji nieuczapowanego mRNA w puli IVT doprowadziłoby do osłabienia sygnału, co wykazano w przypadku mRNA bez czapki; nie zaobserwowano jednak takiego efektu. Ponadto, biorąc pod uwagę, że eGFP jest stosunkowo małym białkiem o masie zaledwie 27 kDa, taka modulacja stężenia czapki powinna łatwo przełożyć się na większe geny, ponieważ po IVT będzie do ucapowania mniej transkryptów. Istnieje wiele analogów czapki o różnych modyfikacjach metylacyjnych, co wpływa na immunogenność³ oraz ekspresję białka²⁷. Dodatkowo proces cappingu może być przeprowadzany kokotranskrypcyjnie (jak pokazano tutaj) lub potranskrypcyjnie przy użyciu wirusa Vaccinia, co skutkuje 100% wydajnością cappingu²⁸, ale wymaga dodatkowych etapów oczyszczania. Do produkcji mRNA w skali laboratoryjnej powszechnie stosuje się kolumny oczyszczające, ponieważ są one szybkie i wydajne, lecz kosztowne. Tańszym i bardziej wszechstronnym podejściem jest wytrącanie chlorkiem litu, które, choć bardziej czasochłonne, pozwala użytkownikowi skoncentrować mRNA i nie ogranicza wydajności do pojemności wiązania kolumny; w związku z tym nadaje się ono do skalowania procesu. Podobnie jak w przypadku kolumn oczyszczających, podejście to nie usuwa całkowicie dwuniciowego RNA oraz skróconych fragmentów RNA, które wywołują immunogenność²⁹. Podobnie jak w przypadku czapki 5’, inkorporację ogona poly(A) można przeprowadzić w inny sposób niż opisano tutaj. Analogicznie do wprowadzenia ogona metodą PCR, plazmidowy DNA może zostać zaprojektowany tak, aby zawierał ogon poly(A); jednak te długie odcinki mogą ulegać rekombinacji, co prowadzi do powstania heterogenicznych i skróconych sekwencji poly(A). Niemniej jednak segmentacja poly(A) – wstawienie spacerów heteronukleotydowych – zminimalizowała te efekty^30,31. Alternatywnie ogon poly(A) można wygenerować za pomocą niezależnej od matrycy polimerazy poly(A), co umożliwia wytworzenie dłuższych ogonów poly(A)³², ale wiąże się z ryzykiem heterogeniczności wpływającą na wymogi regulacyjne³³.

Choć opisany test z użyciem podzielnika luminescencyjnego jest niezwykle skuteczny w pomiarze ekspresji białek z egzogenicznie dostarczonego mRNA, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę w zależności od pytania badawczego. Po pierwsze, konieczne jest stworzenie linii komórkowej konstytutywnie wykazującej ekspresję jednej połowy podzielonej lucyferazy. Chociaż można ją kupić jako gotowy produkt, obecnie jest ona ograniczona wyłącznie do komórek HEK293. Jeśli stworzenie stabilnej linii w interesującym nas typie komórek jest trudne, istnieje test lityczny, który w naszych badaniach wykazał taki sam wynik pomiędzy komórkami HEK293, ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi a zróżnicowanymi kardiomiocytami³. Jednak punkt czasowy wybrany dla testu litycznego w tej wcześniej opublikowanej pracy³ był podyktowany danymi z żywych komórek HEK293. Po drugie, test ten zapewnia czasową rozdzielczość w żywych komórkach, ale nie oferuje rozdzielczości przestrzennej w żywych komórkach, co może być istotne dla niektórych badaczy. Dostępne jest jednak przeciwciało pierwotne, które dobrze sprawdza się w fluorescencyjnej immunocytochemii przeciwko krótkiemu peptydowemu znacznikowi lucyferazyy używanemu w tych eksperymentach, co umożliwia przestrzenną analizę translacyjnego POI. Dodatkowo, mikroskop zdolny do obrazowania luminescencyjnego mógłby dostarczyć dane z rozdzielczością na poziomie pojedynczych komórek. Podejściem oferującym informacje czasoprzestrzenne jest SunTag, który mierzy aktywną translację i lokalizację za pomocą obrazowania żywych komórek poprzez oddziaływania między znakowanymi GFP scFv wiążącymi się z epitopami peptydowymi^14,34. Jednak wymagane jest zastosowanie 24 tandemowych powtórzeń tych epitopów, co potencjalnie może zaburzyć translację, a sam proces charakteryzuje się stosunkowo niską wydajnością. Po trzecie, podzielnik luminescencyjny umożliwia pomiar liczebności mRNA, ale nie w żywych komórkach. W naszej poprzedniej pracy³ przeprowadzono qRT-PCR na wyekstrahowanym RNA przy użyciu starterów specyficznych dla egzogenicznie dostarczonego transkryptu, co potwierdziło poziomy mRNA dla wydajności transfekcji pomiędzy konstruktami oraz rozpad pomiędzy punktami czasowymi. Inne podejście zakłada wykorzystanie techniki Northern blotting do pomiaru stabilności mRNA³⁵. Jednak obie te metody są pracochłonne i nie pozwalają na prowadzenie pomiarów ciągłych. Obecnie nie istnieje metoda umożliwiająca jednoczesny pomiar translacji i liczebności mRNA w żywych komórkach, co stanowi potencjalny kierunek rozwoju testów w tej dziedzinie.

System rozdzielonej lucyferazy był początkowo stosowany do badania dynamiki białek, jednak tutaj staje się jasne, że analiza ta ma istotne znaczenie w innych obszarach badawczych. W obliczu rozwoju terapeutyków opartych na mRNA jako nowych podejść w terapii genowej, test ten jest idealnie dostosowany do umożliwienia badaczom charakterystyki ekspresji potencjalnego terapeutyku i jej optymalizacji w celu zwiększenia poziomu ekspresji. Jak wspomniano wcześniej, optymalizacja kodonów stała się potężnym nowym narzędziem w projektowaniu mRNA wraz z opracowaniem wielu instrumentów^8,9,36. Gdy jednolite podejście do optymalizacji sekwencji zastosowano do czterech czynników transkrypcyjnych, poprawiono zarówno MFE, jak i CAI dla wszystkich genów, jednak tylko MEF2C i TBX5 wykazały zwiększoną ekspresję. Co istotne, umożliwiając wykrywanie różnic w ekspresji wynikających wyłącznie z synonimicznych wariantów sekwencji kodującej, podejście to stanowi unikalną platformę do badania wydajności translacji w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasową. Wyniki te wskazują, że optymalizacja sekwencji musi uwzględniać początkową zawartość GC, wykorzystanie kodonów oraz wtórną strukturę RNA w sposób zależny od POI, aby osiągnąć zwiększoną ekspresję. Chociaż konieczne może być przetestowanie większej liczby konstruktów, test z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym posiada potencjał do analiz wysokoprzepustowych w celu zidentyfikowania optymalnego kandydata dla POI. Dodatkowo, jak wykazano wcześniej³, test ten może mierzyć efekty zaburzeń dowolnego elementu sekwencyjnego lub strukturalnego mRNA, co dodatkowo podkreśla jego zastosowania. Poza badaniem zmian w mRNA, test z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym mógłby być również wykorzystany w badaniach nad dostarczaniem i formulacją. Nawet przy ulepszeniach w obszarze czapek 5’ i zastosowaniu zmodyfikowanych nukleotydów, egzogenne mRNA wymaga systemu pakowania, aby zapobiec degradacji i umożliwić wchłanianie komórkowe³⁷. Choć nanocząsteczki lipidowe³⁸, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe³⁹ i biomimetyki⁴⁰ są w czołówce metod dostarczania mRNA, wciąż wymagany jest dalszy rozwój. Enkapsulacja mRNA z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym w dowolnym z tych nośników umożliwiłaby charakterystykę ich wydajności dostarczania i pozwoliła badaczom na testowanie zmodyfikowanych nośników w sposób średnio- lub wysokoprzepustowy. Poza badaniami skoncentrowanymi na translacji, test z rozdzielonym znacznikiem luminescencyjnym jest łatwo stosowalny w biologii fundamentalnej. Niezależnie od tego, czy chodzi o ocenę wpływu zaburzeń elementów sekwencyjnych i strukturalnych na translację mRNA, zakłócanie funkcji aparatu translacyjnego czy badanie proteasomów, system rozdzielonego znakowania luminescencyjnego stanowi atrakcyjną opcję.

Podsumowując, opisany tutaj system rozszczepionego znacznika luminescencyjnego oferuje elastyczny i niezawodny test do czasowego monitorowania ekspresji białek napędzanej przez syntetyczne mRNA, służący jako odczyt dynamiki translacji. Zastosowanie testu na żywych komórkach pozwala pokonać wiele wcześniejszych ograniczeń w dziedzinie translacji mRNA i ujawnia kluczowe informacje na temat dynamiki syntezy białek oraz degradacji POI. Ponieważ transkrypty posiadają różne profile regulacyjne i ekspresyjne, niezbędna jest charakterystyka terapeutycznego POI, co pozwoli na dalszy rozwój terapii opartych na mRNA i ich wdrażanie do praktyki klinicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	A6283	Składnik buforu TAE
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9539	Elektroforeza w żelu
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	Bioanalizator stosowany do kontroli jakości mRNA
Luminometr CLARIOstar Plus	BMG Labtech	430-501S-F	Czytnik płytek/luminometr stosowany do pomiaru luminescencji
CleanCap AG	Trilink Biotechnologies	N-7113	Czapka 5' stosowana do IVT
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirowinian	Thermo Fisher Scientific	41966029	Pożywka stosowana do hodowli komórek HEK293-LgBiT
DNaza I	New England Biolabs	M0303	Degraduje matrycę DNA po reakcji IVT
Bufor fosforanowy Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Do przemywania komórek i dodawania do płytki w celu zapobiegania parowaniu
EDTA, pH 8.0, wolny od RNaz	Thermo Fisher Scientific	AM9260	Składnik buforu TAE
Bro מקyd etydyny	Sigma-Aldrich	E1510	Barwnik do elektroforezy w żelu
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	Suplement dodawany do DMEM
Zestaw HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040	Zestaw do transkrypcji in vitro (IVT)
Pożywka L-15 Leibovitza, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Scientific	21083027	Pożywka stosowana do hodowli HEK293-LgBiT podczas pomiarów luminescencji
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-024	Suplement dodawany do DMEM
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150	Lipidowy odczynnik do transfekcji
Roztwór do precypitacji chlorkiem litu	Thermo Fisher Scientific	AM9480	Alternatywna metoda oczyszczania mRNA po IVT
Zestaw Monarch Spin PCR & DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1130	Zestaw do oczyszczania po linearyzacji plazmidu
Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Spektrofotometr stosowany do ilościowego oznaczania stężenia DNA i mRNA
Substrat do żywych komórek Nano-Glo Endurazine	Promega	N2570	Substrat wymagany do luminescencji, dodawany do pożywki L-15
Zestaw NucleoSpin RNA Cleanup Kit	Macherey-Nagel	12708612	Oczyszcza mRNA po reakcji IVT
96-dołkowa mikropłytka Nunc MicroWell, Nunclon Delta-Treated, płaskie dno	Thermo Fisher Scientific	136101	Płytka stosowana do wysiewu HEK293-LgBiT i późniejszych pomiarów
Pożywka Opti-MEM z obniżoną zawartością surowicy	Thermo Fisher Scientific	31985062	Pożywka stosowana do reakcji transfekcji
Zestaw Phusion High-Fidelity PCR Kit	New England Biolabs	E0553	Zestaw do PCR
Marker RNA RiboRuler High Range	Thermo Fisher Scientific	11883993	Marker RNA do elektroforezy w żelu
RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	R2020	Spray do dekontaminacji z RNaz
TRIZMA Base	Sigma-Aldrich	T6066	Składnik buforu TAE
Roztwór Trypsyna-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174	Odczynnik do dysocjacji komórek
UltraCzysta woda destylowana wolna od DNaz/RNaz	Thermo Fisher Scientific	10977035	Stosowana do przygotowania matrycy oraz do IVT