Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar dynamiki translacji mRNA w żywych komórkach za pomocą rozszczepionego znakowania luminescencyjnego w komórkach HEK293

67 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70840

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiamy elastyczną, kompatybilną z wysokoprzepustowością metodę pomiaru dynamiki translacji żywego mRNA in cellulo w komórkach HEK293s, z wykorzystaniem rozdzielonego znakowania luminescencyjnego. Ten wszechstronny test pozwala odróżnić efekty strukturalne, wspiera optymalizację transkrypcji in vitro oraz usprawnia rozwój terapeutyków opartych na mRNA.

Streszczenie

Szybka opracowanie szczepionek w walce z COVID-19 zilustrowało potencjał terapeutyków opartych na matrycowym RNA (mRNA) w przekształcaniu procesów tworzenia leków. Podobnie jak dojrzałe mRNA, mRNA transkrybowane in vitro posiada te same elementy, w tym czapeczkę 5’, regiony niekodujące (UTR), sekwencję kodującą oraz ogon poli(A). Poprzednie prace badające wpływ tych komponentów na translację mRNA opierały się głównie na wysoko zmodyfikowanych białkach reporterowych, które wykazują wydajną translację i stabilność białkową. Ponieważ elementy strukturalne każdego mRNA w różny sposób wpływają na ich translację, konieczne jest zidentyfikowanie optymalnego projektu odpowiedniego dla konkretnego białka docelowego (POI). Aby umożliwić charakteryzację translacji POI, zastosowano system komplementacji rozszczepionej lucyferazy. Krótki znacznik peptydowy (HiBiT), który może zostać połączony z dowolnym końcem POI, łączy się ze swoim komplementarnym heterodimerem (LgBiT), aby przywrócić aktywność enzymatyczną w obecności substratu przenikającego przez błony komórkowe. Do tej pory rozszczepione znakowanie luminescencyjne było wykorzystywane głównie w wysokoprzepustowych badaniach obrotu białek. Wykazaliśmy wcześniej, w jaki sposób rozszczepione znakowanie luminescencyjne może zostać zastosowane do wysokoprzepustowej kwantyfikacji translacji mRNA w czasie in cellulo w komórkach HEK293 konstytutywnie wykazujących ekspresję komplementarnego heterodimeru. W niniejszej pracy dodatkowo demonstrujemy wszechstronność tego testu i szczegółowo opisujemy, jak może on zostać wykorzystany do optymalizacji transkrypcji in vitro w celu redukcji kosztów. System testowy potrafi w unikalny sposób rozróżnić zmiany w komponentach strukturalnych, podkreślając jednocześnie efekty optymalizacji sekwencji kodującej przy użyciu genów niemodyfikowanych. Ponadto wykazujemy, że 4-krotna redukcja stężenia czapeczki 5’ podczas transkrypcji in vitro skutkuje równoważną translacją in cellulo. Wyniki te ilustrują, jak rozszczepione znakowanie luminescencyjne może być łatwo zintegrowane z procesem tworzenia terapeutyków mRNA, umożliwiając monitorowanie dynamiki ekspresji białek sterowanej przez mRNA w czasie rzeczywistym in cellulo, co oferuje wszechstronną metodę rozwoju terapeutyków opartych na mRNA.

Wprowadzenie

Terapie oparte na matrycowym RNA (mRNA) oraz zastosowania badawcze w tym zakresie gwałtownie rozwinęły się w ostatnich latach, co było napędzane sukcesem szczepionek mRNA1,2 oraz rosnącym uznaniem wszechstronności RNA jako programowalnej biomolekuły. Kluczowym wyzwaniem w tej dziedzinie jest zdolność do ilościowej i dynamicznej oceny wydajności translacji mRNA w różnorodnych kontekstach. Opisana tutaj metoda – wykorzystująca system podzielonego znakowania luminescencyjnego – zapewnia elastyczną i skalowalną platformę do badania translacji mRNA na żywo in cellulo3. Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie badaczom pomiaru wpływu cech sekwencji, modyfikacji chemicznych i elementów strukturalnych na kinetykę translacji oraz późniejszy obrót białek, co stanowi potężne narzędzie do optymalizacji konstruktów mRNA w zastosowaniach terapeutycznych i podstawowych badaniach naukowych.

In vitro transkrybowany mRNA odzwierciedla podstawową architekturę dojrzałych transkrypcji, zawierając czapeczkę 5′, regiony nietranslacyjne (UTRs), sekwencję kodującą oraz ogon poli(A), przy czym często włącza się zmodyfikowane nukleotydy w celu zmniejszenia immunogenności4,5. Liczne prace wykazały, że każdy z tych elementów – zarówno pojedynczo, jak i w kombinacjach – może zostać zaprojektowany tak, aby silnie wpływać na wydajność translacji i uzysk białka6,7. Jednak większość wcześniejszych badań opierała się na wysoce zoptymalizowanych białkach reporterowych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP)7, NanoLuc8 lub białko kolca SARS-CoV-28,9, które są zaprojektowane tak, aby tłumaczyli się z wysoką wydajnością i wytwarzać bardzo stabilne białka, a zatem nie odzwierciedlają wyzwań występujących w kontekstach terapeutycznych. Ponieważ terapeutyczne mRNA kodują różnorodne białka docelowe (POI), z których każde podlega unikalnym ograniczeniom strukturalnym i regulacji specyficznej dla typu komórek, zasady projektowania maksymalizujące translację dla jednego konstruktu mogą nie być uniwersalne dla innego, co zgłaszano wcześniej3. Identyfikacja optymalnej konfiguracji dla danego terapeutycznego POI jest zatem niezbędna i wymaga metod, które potrafią czule i systematycznie oceniać, w jaki sposób poszczególne cechy transkryptu wpływają na wydajność produkcji białka.

Metody skoncentrowane na rybosomach, takie jak profilowanie polisomów, rozdzielają frakcje translacyjne za pomocą wirowania w gradiencie10, podczas gdy profilowanie rybosomów (Ribo-seq) zapewnia rozdzielczość na poziomie nukleotydów w zakresie zajętości rybosomów, miejsc inicjacji i pauzowania11. Podobnie jak Ribo-seq, inne podejścia oparte na sekwencjonowaniu, takie jak sekwencjonowanie wysokoprzepustowe RNA izolowanego poprzez immunoprecypitację z sieciowaniem (HITS-CLIP) oraz oczyszczanie rybosomów translacyjnych za pomocą powinowactwa (TRAP), dodatkowo charakteryzują translację RNA związanych z białkami wiążącymi RNA lub RNA związanych z rybosomami12. Choć potężne, techniki te wymagają złożonego przygotowania, specjalistycznego sprzętu i wiedzy obliczeniowej, co czyni je nieodpowiednimi do wysokoprzepustowego opracowywania terapeutycznego mRNA. Immunoprecypitacja łańcuchów powstających13 mierzy wydajność translacji przy użyciu białek z tagiem FLAG, immunoprecypitowanych z rybosomów i ilościowo określanych za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR). Mimo że metoda ta jest dostosowywalna do terapeutycznych mRNA, test jest pracochłonny, brakuje mu rozdzielczości czasowej i nie nadaje się do zastosowań wysokoprzepustowych. System SunTag14 umożliwia pomiary syntezy białek i regulacji translacji w żywych komórkach z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek mRNA i działa dzięki oddziaływaniu fragmentu zmiennego jednopalczastego przeciwciała (scFv) połączonego z GFP z tandemowymi powtórzeniami epitopu peptydowego. System ten umożliwia dynamiczne pomiary translacji i lokalizacji z rozdzielczością pojedynczego mRNA, dzięki czemu wykorzystano go do opracowania licznych systemów śledzenia łańcuchów powstających15,16. Jednakże podejście to charakteryzuje się niską przepustowością i wymaga użycia mikroskopów o wysokiej mocy.

Mimo że znakowanie białka powstającego jest nieuniknione, zidentyfikowano możliwość zastosowania małego peptydu znacznikowego, pochodzącego z lucyferazy NanoLuc, w celu raportowania translacji mRNA w żywych komórkach. Lucyferaza NanoLuc została zmodyfikowana tak, aby podzielić ją na małą podjednostkę składającą się z 11 aminokwasów (HiBiT) oraz większą podjednostkę składającą się z 158 aminokwasów (LgBiT), które mogą szybko tworzyć dimer i, w obecności substratu, odtworzyć funkcjonalną lucyferazę17,18. System dzielonego znakowania luminescencyjnego oferuje kilka kluczowych zalet w badaniach dynamiki mRNA. Po pierwsze, minimalny rozmiar małej podjednostki połączonej z białkiem zainteresowania (POI) sprawia, że zakodowana konstrukcja pozostaje jak najbliższa natywnemu białku. Ponieważ długość sekwencji kodującej może bezpośrednio wpływać na stosunki translacji19, zminimalizowanie długości znacznika poprawia nasze przewidywania dotyczące dynamiki translacji syntetycznych mRNA. Co kluczowe, ta strategia minimalnego znakowania umożliwia wykrycie różnic w translacji wywołanych synonimiczną zmiennością sekwencji kodującej, co pozwala na badanie efektywności translacji niezależnie od sekwencji lub stabilności białka3. Z tego powodu stosowanie większych znaczników, takich jak białka fluorescencyjne lub pełnowymiarowe lucyferazy, jest nieoptymalne. Po drugie, zastosowany tutaj system dzielonego znakowania luminescencyjnego umożliwia natychmiastowe generowanie sygnału. Jego szybka i wydajna reakcja komplementacji in cellulo charakteryzuje się wysokim powinowactwem (KD = 700 pM) i była wykorzystywana do pomiaru modulacji obrotu białek z częstotliwością odczytów co 30 s18. Choć pierwotny system dzielonego znakowania luminescencyjnego był porównywany głównie z innymi systemami dzielonych lucyferaz17,18, kluczową zaletą w tym kontekście jest to, że generowanie sygnału nie jest ograniczone przez dojrzewanie białka. W przeciwieństwie do tego, białka fluorescencyjne wymagają dojrzewania chromoforu, co może trwać od kilku minut do kilku godzin20, ograniczając tym samym rozdzielczość czasową. Wreszcie, zastosowany tutaj ustalony system dzielonego znakowania luminescencyjnego pokonuje ograniczenia systemów dzielonych białek fluorescencyjnych, które zazwyczaj wymagają utworzenia chromoforu po komplementacji21, co wprowadza dodatkowe opóźnienie i ogranicza ich przydatność do rejestrowania szybkich, dynamicznych procesów. Wcześniejsze badania wykazały użyteczność dzielonego znakowania luminescencyjnego w testach obrotu białek i badaniach nad degradacją22,23,24. Rozszerzenie tej uznanej technologii na kinetykę translacji stanowi znaczący postęp metodologiczny. Na przykład, choć profilowanie rybosomów może ujawnić gęstość rybosomów wzdłuż transkryptów, nie pozwala ono na łatwe uchwycenie dynamicznych zmian w tempie inicjacji lub elongacji translacji w różnych warunkach. Jak wykazano wcześniej3, ten system dzielonego znakowania luminescencyjnego może wykrywać różnice przy zmianie struktury czapeczki, składu 5′ niekodującego regionu (UTR), optymalizacji kodonów, modyfikacjach nukleotydowych oraz długości ogona poly(A), z których wszystkie są krytycznymi determinantami efektywności translacji. Taka szeroka stosowalność sprawia, że metoda ta jest wyjątkowo potężnym narzędziem do analizy wkładu poszczególnych cech mRNA w całkowitą produkcję białka. Warto zauważyć, że w zależności od użytego urządzenia, technologia ta pozwala na gromadzenie danych zarówno z pojedynczych komórek, jak i z całej studzienki. Platformy obrazowania zdolne do pozyskiwania obrazów opartych na luminescencji umożliwiają wykorzystanie tej technologii do badania dynamiki translacji w pojedynczych komórkach. Tutaj skupiamy się na zastosowaniu w czytnikach płytek, w oparciu o studzienki, ze względu na ich średnią lub wysoką przepustowość oraz minimalne wymagania dotyczące analizy danych.

Badacze rozważający zastosowanie tej metody powinni ocenić jej przydatność w odniesieniu do swoich konkretnych celów eksperymentalnych. Analiza ta jest szczególnie cenna w sytuacjach, gdy wymagany jest wysokoprzepustowy screening syntetycznych konstruktów mRNA, na przykład w procesach projektowania terapeutyków opartych na mRNA. Nadaje się ona do analiz porównawczych cech sekwencji syntetycznego mRNA – w tym regionów nietranslowanych, wykorzystania kodonów lub modyfikacji nukleotydowych – gdzie można wykryć subtelne różnice w wydajności translacji3. Dzięki temu, że system jest kompatybilny z platformami translacji bezkomórkowej, analizami w żywych komórkach oraz lityczną analizą w określonych punktach czasowych, oferuje on elastyczność badaczom pragnącym dostosować projekt eksperymentalny do badań mechanistycznych lub badań stosowanych. Jednocześnie ważne jest rozpoznanie ograniczeń tej techniki. Co kluczowe, analiza z rozdzielnym znakowaniem luminescencyjnym nie zapewnia rozdzielczości stopnia zajętości rybosomów, co pozostaje unikalną możliwością podejść opartych na ribosome footprinting, ani nie mierzy bezpośrednio stabilności lub degradacji RNA, co może wymagać oceny przy użyciu metod komplementarnych. Jednak ze względu na ograniczenia istniejących technik rybo-centrycznych, badacze polegają na analizach opartych na znacznikach, takich jak system rozdzielnej luminescencji, aby badać rozdzielczą w czasie ekspresję białek sterowaną przez mRNA jako wskaźnik dynamiki translacji. Zatem, choć system ten jest potężnym narzędziem do monitorowania ekspresji białek sterowanej przez syntetyczne mRNA, jego zasadność zależy od tego, czy pytanie badawcze koncentruje się na dynamicznej produkcji białka, a nie na szczegółowym pozycjonowaniu rybosomów lub rozpadzie RNA.

Podsumowując, system rozdzielczego znakowania luminescencyjnego stanowi potężną i wszechstronną metodę badania translacji mRNA. Jego nadrzędnym celem jest dostarczenie badaczom elastycznego, skalowalnego i wysokoprzepustowego narzędzia, zdolnego do wykrywania różnic w wydajności syntezy białek wynikających z zastosowania syntetycznego mRNA o zróżnicowanych elementach sekwencyjnych i strukturalnych3. Uzasadnieniem dla jego opracowania była chęć przełamania ograniczeń istniejących technik poprzez zapewnienie przewagi w zakresie czułości, skalowalności i rozdzielczości czasowej. Metoda ta, osadzona w szerszej literaturze dotyczącej biologii i terapeutyki RNA, stanowi cenny dodatek do instrumentarium eksperymentalnego, umożliwiając zarówno zdobycie fundamentalnych informacji, jak i postępy w badaniach translacyjnych. Dzięki starannej analizie zalet i ograniczeń tego testu, badacze mogą określić jego przydatność dla konkretnych zastosowań, maksymalizując tym samym jego wpływ na dynamicznie rozwijającą się dziedzinę nauki o RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Graficzne przedstawienie całego protokołu pokazano na Rysunku 1.

1. Przygotowanie matrycy do transkrypcji in vitro (IVT)

UWAGA: Aby przygotować matrycę DNA do IVT, należy upewnić się, że plazmidowy DNA zawiera promoter polimerazy RNA (zazwyczaj T7 lub SP6), regiony 5’ i 3’ UTR oraz otwartą ramkę odczytu białka zainteresowania (POI) (Rysunek 1).

  1. Zlinearyzuj plazmidowe DNA przy użyciu enzymu restrykcyjnego z pojedynczą stroną cięcia znajdującą się za 3’ UTR i przygotuj reakcję zgodnie z instrukcjami producenta. Po inkubacji oczyść produkt trawienia restrykcyjnego za pomocą zestawu do oczyszczania DNA opartego na kolumnach wirowych. Ilościowo określ zawartość DNA za pomocą spektrofotometru.
  2. Aby potwierdzić linearyzację, przygotuj 1% żel agarozowy w buforze TAE zawierający barwnik do DNA bromek etydyny w stężeniu 0,1 µg/mL. Wymieszaj 150 ng trawionego DNA z wodą i barwnikiem do nakładania próbek. Nanieś na żel agarozowy próbkę, niecięty plazmid oraz drabinę DNA, a następnie prowadź elektroforezę przy 100 V przez 40 min w 1× buforze Tris-kwas octowy-EDTA (TAE). Wizualizuj wynik za pomocą systemu obrazowania żeli.
    OSTROŻNIE: Roztwór bromku etydyny jest silnym mutagenem i wymaga ostrożnego obchodzenia się przy użyciu odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE).
  3. Jeśli plazmidowe DNA nie posiada ogona poli(A) bezpośrednio za 3’ UTR, wprowadź go za pomocą PCR. Przeprowadź reakcję PCR zgodnie z instrukcjami producenta, używając polimerazy o wysokiej wierności oraz odpowiednio zaprojektowanych starterów. Upewnij się, że amplikon zawiera promotor T7, otwartą ramkę odczytu oraz ogon poli(A).
    UWAGA: Technologie cappings mogą mieć specyficzne wymagania dotyczące sekwencji w obrębie promotora T7; wymagania te można spełnić poprzez odpowiedni projekt startera forward. Starter reverse wiąże się z końcem 3’ UTR i wprowadza ogon poli(A) (zalecana długość co najmniej 80 T). W przypadku konstruktów o wysokiej zawartości GC zaleca się zastosowanie PCR stopniowego (step-up PCR) i/lub 3% DMSO.
  4. Aby potwierdzić powodzenie reakcji PCR, przygotuj żel agarozowy w buforze TAE zawierający bromek etydyny (patrz krok 1.2). Jeśli długość konstruktu wynosi ≥1 kb lub <1 kb, przygotuj odpowiednio żel 1% lub 2%. Wymieszaj 5 µL reakcji PCR z wodą i barwnikiem do nakładania próbek. Nanieś na żel agarozowy zarówno próbkę, jak i drabinę DNA, a następnie prowadź elektroforezę przy 100 V przez 40 min w buforze TAE. Wizualizuj wynik za pomocą systemu obrazowania żeli.
  5. Po potwierdzeniu wielkości produktu PCR, oczyść reakcję PCR za pomocą zestawu do oczyszczania DNA opartego na kolumnach wirowych. Eluuj w 15–20 µL buforu do elucji (często dostarczanego w zestawie do oczyszczania DNA) lub wody wolnej od nukleaz, aby skoncentrować matrycę DNA do zastosowania w IVT. Ilościowo określ zawartość DNA za pomocą spektrofotometru.

2. Transkrypcja in vitro

  1. Przed rozpoczęciem spryskać i przetrzeć blat, rękawice oraz pipety roztworem do dekontaminacji RNaz. Aby zwiększyć wydajność i jakość, należy przeprowadzić tę procedurę w sterylnym dygestorium.
  2. Rozmrozić i przygotować składniki zestawu do transkrypcji in vitro (IVT) opartego na T7 zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: Niektórzy producenci zalecają stosowanie ditiotreitolu (DTT, 0,1 M) w celu ograniczenia utleniania reakcji i poprawy wydajności. Ten krok jest zalecany, jeśli jest on zgodny z zestawem. W przypadku stosowania modyfikowanych dNTP, zastąpić odpowiedni niemodyfikowany nukleotyd taką samą ilością nukleotydu modyfikowanego. Oceń wydajność na podstawie połowy reakcji, ponieważ nie zaobserwowano istotnej poprawy wydajności przy pełnej reakcji. Przy syntezie więcej niż jednego mRNA zaleca się przygotowanie master mixu, aby zredukować błędy pipetowania i zmienność.
  3. Pipetować, wymieszać dokładnie i krótko, a następnie inkubować w 37 °C przez 5 h z podgrzewaną pokrywą, aby uniknąć kondensacji. W razie potrzeby przedłużyć inkubację do nocy, ponieważ ma to minimalny wpływ na wydajność lub integralność mRNA.
  4. Dodać 1 µL DNazy I i dokładnie wymieszać pipetą. Inkubować w 37 °C przez 30 min.
  5. Oczyszczanie RNA transkrybowanego in vitro (IVT)
    1. Oczyścić produkt reakcji IVT, używając zestawu do oczyszczania RNA opartego na kolumnach, zgodnie z instrukcją producenta (różne zestawy mogą prowadzić do różnego stopnia odzyskania i mieć różną pojemność wiążącą). Do elucji dodać 60 µL wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min przed wirowaniem.
    2. Alternatywnie można zastosować wytrącanie chlorkiem litu jako tańsze i bardziej elastyczne podejście.
      1. Dodać do reakcji równą objętość 7,5 M chlorku litu, wymieszać i inkubować w -20 °C przez noc.
      2. Wirować przy 18 300 × g przez 20 min w 4 °C, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając granulatu RNA.
      3. Przemyć 950 µL 70% etanolu i wirować przy 18 300 × g przez 5 min w 4 °C. Usunąć nadsącz, pozostawić granulat do wyschnięcia przez około 5 min w temperaturze pokojowej i resuspenderować w wodzie wolnej od nukleaz (standardowo 60 µL; zmniejszyć objętość w zależności od wielkości granulatu, aby zwiększyć stężenie).
        OSTRZEŻENIE: Chlorek litu może powodować podrażnienie skóry lub oczu, jeśli nie zastosuje się odpowiednich środków ochrony indywidualnej. Podczas pracy stosować rękawice i ochronę oczu. Ponadto etanol jest cieczą łatwopalną i może powodować podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od otwartego ognia i stosować odpowiednie ŚOI, w tym ochronę oczu.
  6. Oznaczyć ilość mRNA za pomocą spektrofotometru. Upewnić się, że stosunek A260/A280 dla mRNA wynosi ~2,0 i potwierdzić, że stosunek A260/A230 mieści się w przedziale od 1,8 do 2,2.
  7. Aby potwierdzić pomyślny przebieg IVT, przygotować 1% żel agarozowy TAE (niedenaturujący) zawierający bromek etydyny. Wymieszać 500 ng mRNA z wodą i barwnikiem do ładowania, a następnie postępować zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą przygotowania drabinki RNA i instrukcjami denaturacji. Nałożyć próbki na żel agarozowy i prowadzić elektroforezę przy 80 V przez 40 min w buforze TAE. Wizualizować za pomocą systemu do obrazowania żeli.
  8. W celu dalszego potwierdzenia prawidłowego rozmiaru mRNA, przeanalizować próbki za pomocą Bioanalizatora.
  9. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, podzielić mRNA na aalikwoty w objętościach wymaganych do eksperymentu. Na przykład: zastosować 1,2 pmol mRNA na studzienkę w płytce 96-dołkowej. W związku z tym odmierzyć odpowiednią objętość dla 1,2 pmol × n powtórzeń, a następnie przechowywać w -80 °C.

3. Odwrócona transfekcja komórek HEK293

UWAGA: W celu przeprowadzenia pomiarów czasowych wymagana jest linia komórkowa konstytutywnie ekspresująca komplementarny fragment lucyferazy. Można to osiągnąć poprzez stworzenie stabilnej linii komórkowej za pomocą transfekcji plazmidu ekspresującego wymagany fragment lucyferazy i następującą po niej selekcję klonalną. Pozwala to użytkownikowi na pomiar rozdzielonych w czasie dynamik translacji mRNA w dowolnym wybranym tle komórkowym. Alternatywnie można zakupić linie komórkowe ekspresujące wymagany fragment lucyferazy. Opisywane eksperymenty przeprowadzono z użyciem komórek HEK293 konstytutywnie ekspresujących komplementarny heterodimer.

  1. Przed rozpoczęciem rozmrozić mRNA na lodzie, aby uniknąć degradacji.
  2. Przygotować kompleksy do transfekcji. Dla płytki 96-dołkowej wymagane jest 1,2 pmol mRNA na dołek. W przypadku pracy w duplikacie należy przygotować ilość odpowiadającą 2,5 duplikatom, aby zrekompensować błędy pipetowania. W związku z tym należy połączyć 3 pmol mRNA z pożywką Opti-MEM Reduced Serum Medium do uzyskania końcowej objętości 50 µL (20 µL/dołek).
  3. Dodać 0,5 µL kationowego odczynnika do transfekcji opartego na lipidach (0,2 µL/dołek), wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej. Po 5 min inkubacji wymieszać przez pipetowanie w górę i w dół, a następnie dodać po 20 µL na dołek do białej mikroplateki 96-dołkowej z płaskim dnem. Sugeruje się, aby dołki przeznaczone do transfekcji znajdowały się w centrum płytki, pozostawiając wolne dołki brzegowe.
  4. Przygotować komórki HEK293 poprzez usunięcie pożywki i przemycie 2 mL solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) bez Ca2+ i Mg2+. Usunąć roztwór do płukania i dodać 500 µL Trypsyny-EDTA, następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 min.
  5. Podczas dysocjacji komórek napełnić dołki brzegowe płytki 96-dołkowej PBS, aby zmniejszyć parowanie pożywki podczas hodowli komórkowej. Jeśli wymagane jest wykorzystanie wszystkich dołków, przestrzeń między nimi można wypełnić PBS.
  6. Dodać 4,5 mL modyfikowanej pożywki Eagle’a Dulbecco (DMEM) uzupełnionej o 1× L-glutaminę i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu zebrania komórek. Wykonać zliczenie komórek przy użyciu hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  7. Przenieść wymaganą liczbę komórek (odpowiadającą 1 x 105 komórek do wysiania na dołek) oraz ilość na 3 dodatkowe dołki (na wypadek błędów pipetowania) do nowej probówki i wirować przy 500 × g przez 2 min.
  8. Usunąć nadsącz i resuspenderować komórki w wymaganej objętości pożywki Leibovitz’s L-15 (wolnej od fenolu) uzupełnionej o 10% FBS oraz substrat do żywych komórek Endurazine Live Cell Substrate (1:200), aby zapewnić końcowe stężenie 1 × 106 komórek/mL. Wymieszać za pomocą pipety serologicznej, aby zapewnić dokładne wymieszanie Endurazine. Napippetować 100 µL (1 × 105 komórek) resuspenderowanych komórek na dołek.
    UWAGA: W przypadku przeprowadzania eksperymentów z przebiegiem czasowym trwających 72 h, zwiększyć objętość do 200 µL, aby uniknąć parowania.
  9. Bezpośrednio po transfekcji umieścić komórki w czytniku płytek (luminometrze) ustawionym na 37 °C. Wykonywać pomiary w regularnych odstępach czasu z czasem integracji 1 s. Ze względu na efektywną komplementację systemu sygnał jest wykrywalny w ciągu kilku minut. Dlatego, aby uzyskać dokładny odczyt linii bazowej, ten krok musi zostać wykonany bezzwłocznie. Przedziały te zależą od eksperymentu i instrumentu; jednak w tych badaniach za optymalne uznano pomiary co 12 min dla eksperymentów z przebiegiem czasowym 18 h oraz co 48 min dla eksperymentów trwających 72 h. Pomiar luminescencji nie wymaga filtra; lepszy stosunek sygnału do szumu zaobserwowano przy użyciu filtra 530–540 nm.
    UWAGA: Sygnał transferu energii rezonansowej bioluminescencji (BRET) jest generowany przez eGFP z tagiem rozszczepionej lucyferazy, zatem filtr 530–540 nm wychwyci zarówno sygnał luminescencyjny, jak i fluorescencyjny. Aby uniknąć wychwycenia sygnału BRET, należy użyć filtra 460–480 nm lub alternatywnie zastosować białko niefluorescencyjne, takie jak MYL3, jako referencję.

4. Analiza danych

  1. Oblicz krotność zmiany (fold change) w relatywnych jednostkach luminescencji (RLU), normalizując sygnał dla każdego warunku do jego pierwszego punktu czasowego (t0, znormalizowanego do średniej z powtórzeń technicznych), ponieważ sygnał na początku testu stanowi poziom tła.
  2. Zmniejsz zmienność między powtórzeniami biologicznymi poprzez normalizację względem warunku kontrolnego.
  3. Wybierz metodę analizy statystycznej dla testu: albo dla pojedynczego punktu czasowego, albo dla pola pod krzywą (AUC) — w zależności od stawianego pytania badawczego.
    1. W przypadku pojedynczego punktu czasowego, wykorzystaj punkty czasowe, w których występuje szczytowa ekspresja (co zależy od badanego białka, POI), wraz z punktem końcowym. Przedstaw na wykresie wartość RLU obliczoną w kroku 4.1 dla konkretnego punktu czasowego (np. 240 min) i przeanalizuj ją za pomocą odpowiedniego testu statystycznego.
    2. Zmierz dynamikę translacji i degradacji białka, obliczając AUC dla określonego przedziału czasowego (t.j. od t0 do 240 min) lub dla całego czasu trwania testu (t.j. od t0 do punktu końcowego). Znormalizuj wartość AUC dla każdego powtórzenia biologicznego do średniej dla referencyjnego mRNA, co pozwoli uzyskać miarę krotności zmiany AUC, którą można przeanalizować za pomocą odpowiednich testów statystycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Istnieje kilka sposobów na optymalizację kosztowej efektywności niniejszego protokołu. Na przykład reakcję IVT zminiaturyzowano do połowy objętości zalecanej przez producenta i stwierdzono, że uzyskana wydajność spełnia ilość wymaganą do eksperymentów in cellulo. Należy zauważyć, że długość i złożoność sekwencji wpływają na wydajność IVT, dlatego pomyślna optymalizacja protokołu powinna przynieść co najmniej 50 µg mRNA na jedną reakcję IVT. Podobnie jak zestawy do reakcji IVT, odczynniki do cappingu również częs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dziedzina terapeutyków opartych na mRNA rozwijała się w ostatnich latach gwałtownie, co podkreśla znaczenie projektowania i optymalizacji sekwencji jako krytycznego etapu procesu opracowywania leków. Znaczące wysiłki skupiono na tworzeniu narzędzi obliczeniowych do przewidywania najskuteczniejszych struktur i składów RNA, przy czym szczególną uwagę poświęcono optymalizacji sekwencji8,9. Choć narzędzia te są potężne, eksperymentalna walidacja tych projektów wciąż ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Laurze Itzhaki za linię komórkową HEK293 LgBiT. Praca ta była finansowana z grantu projektowego oraz nagrody translacyjnej British Heart Foundation (G114642 i G919651 dla CHW) oraz grantu badawczego GenScript Life Science (CAPB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma-AldrichA6283Składnik buforu TAE
AgarozaSigma-AldrichA9539Elektroforeza w żelu
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalizator stosowany do kontroli jakości mRNA
Luminometr CLARIOstar PlusBMG Labtech430-501S-FCzytnik płytek/luminometr stosowany do pomiaru luminescencji
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113Czapka 5' stosowana do IVT
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirowinianThermo Fisher Scientific41966029Pożywka stosowana do hodowli komórek HEK293-LgBiT
DNaza INew England BiolabsM0303Degraduje matrycę DNA po reakcji IVT
Bufor fosforanowy Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Do przemywania komórek i dodawania do płytki w celu zapobiegania parowaniu
EDTA, pH 8.0, wolny od RNazThermo Fisher ScientificAM9260Składnik buforu TAE
Bro מקyd etydynySigma-AldrichE1510Barwnik do elektroforezy w żelu
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524Suplement dodawany do DMEM
Zestaw HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040Zestaw do transkrypcji in vitro (IVT)
Pożywka L-15 Leibovitza, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific21083027Pożywka stosowana do hodowli HEK293-LgBiT podczas pomiarów luminescencji
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030-024Suplement dodawany do DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Lipidowy odczynnik do transfekcji
Roztwór do precypitacji chlorkiem lituThermo Fisher ScientificAM9480Alternatywna metoda oczyszczania mRNA po IVT
Zestaw Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Zestaw do oczyszczania po linearyzacji plazmidu
Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpektrofotometr stosowany do ilościowego oznaczania stężenia DNA i mRNA
Substrat do żywych komórek Nano-Glo EndurazinePromegaN2570Substrat wymagany do luminescencji, dodawany do pożywki L-15 
Zestaw NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Oczyszcza mRNA po reakcji IVT
96-dołkowa mikropłytka Nunc MicroWell, Nunclon Delta-Treated, płaskie dnoThermo Fisher Scientific136101Płytka stosowana do wysiewu HEK293-LgBiT i późniejszych pomiarów
Pożywka Opti-MEM z obniżoną zawartością surowicyThermo Fisher Scientific31985062Pożywka stosowana do reakcji transfekcji
Zestaw Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553Zestaw do PCR
Marker RNA RiboRuler High RangeThermo Fisher Scientific11883993Marker RNA do elektroforezy w żelu
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Spray do dekontaminacji z RNaz
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Składnik buforu TAE
Roztwór Trypsyna-EDTASigma-AldrichT4174Odczynnik do dysocjacji komórek
UltraCzysta woda destylowana wolna od DNaz/RNazThermo Fisher Scientific10977035Stosowana do przygotowania matrycy oraz do IVT

Bibliografia

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

translacja mRNAobrazowanie ywych kom rektranskrypcja in vitrodynamika ekspresji bia ekkomplementacja lucyferazyoptymalizacja sekwencji koduj cejmodyfikacja czapeczki 5terapeutyki mRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.