Przedstawiamy niskonakładowy, bezznacznikowy proces za pomocą DeepLabCut do ilościowego określania spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie. Ten protokół integruje nagranie wideo z jedną kamerą, bezznacznikowe śledzenie punktów anatomicznych i wyodrębnianie parametrów lokomocji przestrzenno-czasowych, zapewniając nieinwazyjne i dostępne narzędzie do analizy zachowań motorycznych bez specjalistycznego sprzętu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tani niskokosztowy proces bez markerów oparty na DeepLabCut do analizy spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chod jest szeroko stosowanym biomarkerem funkcjonalnym do wykrywania zmian motorycznych w różnych chorobach i stanach, ponieważ odzwierciedla zmiany w koordynacji, sile, równowadze i integracji czuciowo-ruchową. Jednak tradycyjne metody analizy chodu w modelach zwierzęcych często wymagają drogiego sprzętu, złożonych ustawień lub inwazyjnych procedur, które mogą zmieniać naturalne zachowanie. Przedstawiamy niskonakładowy, bezmarkerowy przepływ pracy oparty na DeepLabCut, oprogramowaniu open-source do estymacji pozycji ciała, dla ilościowej analizy chodu i spontanicznej lokomocji u wolno poruszających się myszy. Metoda opiera się na pojedynczej kamerze do akwizycji wideo, bezmarkerowym śledzeniu punktów anatomicznych i ekstrakcji przestrzenno-czasowych parametrów lokomocji, bez konieczności fizycznych markerów czy specjalistycznego sprzętu. Aby zademonstrować zastosowanie protokołu, zaimplementowano go w potrójnym transgenicznym modelu myszy choroby Alzheimera (3xTg-AD) jako przykładowy przykład zastosowania. To podejście zachowuje wolny ruch i minimalizuje stres związany z obsługą, umożliwiając nieinwazyjną ocenę zachowania motorycznego. Protokół jest kompatybilny ze standardowymi środowiskami testowania zachowań. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda zapewnia dostępną i nieinwazyjną ramę dla ilościowej analizy chodu i lokomocji w badaniach przedklinicznych.
Wprowadzenie
Chod to skomplikowana funkcja motoryczna, która powstaje z rzeczywistej interakcji układu motorycznego, sensorycznego i poznawczego, wymagająca skoordynowanego przetwarzania zwrotnego działania sensorycznego, kontroli postawy, planowania motorycznego i aktywacji mięśni, aby wygenerować stabilny, adaptacyjny ruch1. Ze względu na tę integracyjną naturę, zmiany chodu są coraz częściej rozpoznawane jako funkcjonalne wskaźniki dysfunkcji neurologicznej zarówno w praktyce klinicznej, jak i w badaniach eksperymentalnych. U ludzi i w modelach zwierzęcych analiza chodu umożliwia wykrywanie zmian w mobilności, ryzyku upadku, delikatności i zdolności funkcjonalnej, i została zaproponowana jako biomarker progresji choroby i skuteczności interwencji w wielu schorzeniach2,3,4.
W badaniach podstawowych, szczególnie w modelach mysich, ocena spontanicznego chodu i aktywności lokomotorycznej jest szeroko stosowaną strategią do charakteryzacji fenotypu motorycznego i oceny wpływu fizjologicznych zakłóceń oraz interwencji terapeutycznych. Obiektywne ilościowe określenie parametrów lokomotorycznych umożliwia wykrycie subtelnych zmian motorycznych, które nie są wiarygodnie uchwycone wyłącznie przez inspekcję wizualną, ograniczenia, które są szczególnie istotne w badaniach przedklinicznych ukierunkowanych na wczesne lub łagodne fenotypy5. W tym kontekście analiza chodu stała się cennym narzędziem do badania zmian w zachowaniu motorycznym i identyfikowania zmian funkcjonalnych związanych z różnymi warunkami eksperymentalnymi, takimi jak choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne6.
Analiza zachowania motorycznego i chodu w modelach mysich tradycyjnie opierała się na wyspecjalizowanych platformach technologicznych przeznaczonych do ilościowego określania zmiennych kinematycznych przestrzennych i czasowych. Systemy takie jak oświetlone przejścia, instrumentacyjne platformy i komercyjne oprogramowanie do śledzenia ruchu są powszechnie stosowane; jednak ich zależność od kosztownego sprzętu i dedykowanej infrastruktury znacznie ogranicza dostępność dla wielu laboratoriów7,8,9,10. Poza uwagami ekonomicznymi, podejścia te wprowadzają dodatkowe ograniczenia eksperymentalne. Kilka systemów wymaga od zwierząt przejścia przez wąskie korytarze lub silnie oświetlone korytarze, wymuszające wzorce ruchowe, które zmniejszają spontaniczne zachowanie, podczas gdy inne opierają się na fizycznych znacznikach, plamach farby lub naklejkach klejących przymocowanych do kończyn. Takie interwencje mogą wywoływać stres, zmieniać mechanikę chodu i komplikować fizjologiczne interpretacje wyników motorycznych11,12,13,14. Łącznie, te ograniczenia podkreślają potrzebę metodologii zdolnych do rejestrowania chodu w naturalnych warunkach wolnego poruszania bez konieczności stosowania inwazyjnych procedur lub kosztownej infrastruktury.
Ocenienie chodu podczas nieograniczonych ruchów umożliwia obserwację bardziej naturalnych wzorców motorycznych, unikając ograniczenia zewnętrznego, które sztucznie regulują prędkość, trajektorię czy postawę. Takie podejście ułatwia charakteryzację zachowań lokomotorycznych w warunkach minimalnie ograniczających. DeepLabCut to otwarta, głęboko-ucząca się rama estymacji pozycji oparta na sieciach neuronowych konwolucyjnych, która wykorzystuje standardowe nagrania wideo do śledzenia przez użytkownika określonych punktów anatomicznych bez konieczności używania fizycznych znaczników. Umożliwiając śledzenie punktów anatomicznych z nagrań wideo, DeepLabCut umożliwia wyodrębnienie parametrów kinematycznych, znacznie zmniejszając koszt i złożoność eksperymentu15,16,17,18. Co ważne, śledzenie bez znaczników minimalizuje interferencję eksperymentalną, co sprawia, że jest to odpowiednie dla badań spontanicznego zachowania. Ten jednokamerowy markerlessowy podejście jest najbardziej odpowiedni dla badań wymagających dostępnego, nieinwazyjnego ilościowego określenia spontanicznej aktywności lokomotorycznej i dwuwymiarowe cechy związane z chodzeniem w warunkach wolnego poruszania. Jednak instrumentacyjne platformy chodu lub trójwymiarowe systemy przechwytywania ruchu są wymagane, gdy potrzebne są bezpośrednie zmienne biomechaniczne, takie jak siły reakcji gruntu, ciśnienie podeszwowe, kąty stawów lub pełna trójwymiarowa kinemyka kończyn.
Celem tego artykułu jest przedstawienie nisko-kosztowego, markerlessowego procesu opartego na DeepLabCut do nieinwazyjnego ilościowego określenia chodu i spontanicznego chodzenia u myszy poruszających się swobodnie, integrując nagrania wideo z jednej kamery, śledzenie punktów anatomicznych i wyodrębnienie parametrów czasowo-przestrzennych zachowań lokomotorycznych w dostępnym procesie, który nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani inwazyjnej manipulacji. Ten protokół koncentruje się na metodologicznej implementacji i reprezentatywnych wynikach procesu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Instytutu Neurobiologii Narodowego Autonomicznego Uniwersytetu Meksyku (National Autonomous University of Mexico) w ramach protokołu numer 117.
1. Kontekst badania
- Należy wykorzystać myszy spełniające warunki eksperymentalne wymagane dla badania. W niniejszym artykule z protokołem, jako reprezentatywny przykład realizacji procedury, wykorzystano potrójny model transgenicznymi myszy z chorobą Alzheimera (3xTg-AD), posiadający transgeny APPSwe i tauP301L na tle knock-in PS1M146V, a także myszy nietransgeniczne jako grupę kontrolną.
- Należy przeprowadzić genotypowanie wszystkich zwierząt przed rozpoczęciem badania.
- Myszy należy utrzymywać z dostępem do pokarmu i wody ad libitum w kontrolowanych warunkach: cykl światła i ciemności 12:12 h, temperatura 22 °C ± 2 °C oraz wilgotność względna 60% ± 5%, pod nadzorem weterynaryjnym.
- Nagrania należy przeprowadzać w fazie światła po 60 min okresie habituacji, wykorzystując jedną sesję w otwartym polu na zwierzę, aby zachować spontaniczne zachowania eksploracyjne i uniknąć zmniejszenia aktywności związanej z wielokrotną ekspozycją na arenę.
UWAGA: W niniejszym artykule z protokołem prezentujemy reprezentatywne nagrania wyłącznie w celu zilustrowania procedury oraz rodzaju wyników dotyczących lokomocji i chodu generowanych przez tę metodę, a nie w celu wspierania porównań biologicznych między grupami.
2. Materiały
- Mye materiały i sprzęt wymienione w Tabela materiałów oraz sprzęt do rejestracji i analizy spontanicznej lokomocji i chodu. Patrz Rycina 1 do ogólnego montażu układu eksperymentalnego.
3. Habituacja i rejestracja spontanicznej lokomocji
- Przygotowanie i habituacja zwierząt
- Przenieś ostrożnie mysz z pomieszczenia mieszkalnego do pomieszczenia testowego co najmniej 60 min przed eksperymentem, aby umożliwić habituację do środowiska.
- Utrzymuj w pomieszczeniu testowym kontrolowane warunki środowiskowe, w tym stałą temperaturę 20 °C–22 °C, zestandaryzowane natężenie oświetlenia (120–150 lux mierzone na poziomie areny) oraz ciągły biały szum w celu zminimalizowania zewnętrznych bodźców słuchowych.
- W okresie habituacji trzymaj zwierzę w jego klatce domowej, nie wprowadzając dodatkowych bodźców ani wzbogaceń. Postępuj ze zwierzętami zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt, aby zminimalizować zmienność behawioralną wywołaną stresem.
- Podnoś zwierzę w czystych rękawiczkach, wykonując powolne i celowe ruchy. Delikatnie podnieś zwierzę, podtrzymując jego ciało, i umieść je w arenie otwartego pola.
Uwaga: KROK KRYTYCZNY: Niespójne obchodzenie się ze zwierzęciem lub niewystarczający czas habituacji mogą nasilić zachowania związane z lękiem i wprowadzić zmienność w parametrach lokomocyjnych. Zapewnij identyczne procedury habituacji dla wszystkich zwierząt i sesji.
- Przygotowanie areny otwartego pola i kamery
- Przed każdą sesją nagraniową dokładnie wyczyść akrylową arenę otwartego pola 70% (v/v) etanolem, aby usunąć resztki zapachów i poprzednie sygnały węchowe. Przed użyciem pozwól powierzchni całkowicie wyschnąć.
- Używaj 70% etanolu w dobrze wentylowanym obszarze, trzymaj go z dala od źródeł ciepła lub zapłonu i pozwól arenie całkowicie wyschnąć przed użyciem.
- Ustabilizuj arenę otwartego pola na drewnianej platformie, upewniając się, że konstrukcja jest stabilna i wolna od wibracji.
- Sprawdź przezroczyste akrylowe ściany i matową powierzchnię podłogi, aby potwierdzić, że są one wolne od kurzu, wilgoci lub odblaskowych osadów, które mogłyby zakłócić śledzenie wideo.
- Umieść zewnętrzne boczne lampy z białym światłem po obu stronach areny pod kątem około 30–45° względem płaszczyzny areny, aby zapewnić równomierne oświetlenie obszaru nagrywania i zminimalizować cienie, odbicia lub nadmierną jasność. Dostosuj rozmieszczenie lamp przed każdą sesją i zweryfikuj, czy oświetlenie na poziomie areny pozostaje w docelowym zakresie 120-150 lux.
- Ustaw kamerę pod areną w konfiguracji widoku od dołu, w stałej odległości około 80 cm od płaszczyzny areny, zapewniając pełną widoczność obszaru nagrywania. Uwaga: optymalna odległość może wymagać korekty w zależności od apertury obiektywu i pola widzenia (FOV) konkretnej kamery, aby zachować pełny zasięg areny.
- Podłącz kamerę do systemu komputerowego i uruchom oprogramowanie do akwizycji wideo przed wprowadzeniem zwierzęcia.
- Dostosuj ostrość kamery i pole widzenia, aby cała powierzchnia areny była widoczna i wyraźnie odwzorowana.
- Wykonaj zdjęcie referencyjne do kalibracji przestrzennej, umieszczając na płaszczyźnie areny siatkę szachownicową lub wzór kalibracyjny o znanych wymiarach.
UWAGA: KROK KRYTYCZNY: Precyzyjne wyrównanie kamery, stała odległość kamery i spójne oświetlenie są niezbędne dla niezawodnej bezmarkerowej estymacji pozy. Odchylenia w geometrii lub warunkach oświetlenia mogą zmniejszyć dokładność śledzenia i naruszyć porównywalność danych między sesjami.
UWAGA: Do zewnętrznej struktury wsporczej można użyć alternatywnych materiałów, w tym stali nierdzewnej, pod warunkiem, że układ pozostanie stabilny, a wyrównanie nagrywania zostanie zachowane.
UWAGA: Można również zastosować nieprzezroczystą arenę lub alternatywne materiały ścienne, szczególnie gdy wymagana jest dodatkowa kontrola zewnętrznych bodźców wizualnych, pod warunkiem, że układ nagrywający pozostanie stabilny, a zewnętrzne zakłócenia wizualne zostaną zminimalizowane.
UWAGA: Wymiary areny użyte w niniejszym protokole odpowiadają konfiguracji zastosowanej do nagrywania swobodnie poruszających się myszy. Wymiary te mogą być dostosowane do gatunku gryzonia i przyjętego protokołu otwartego pola, pod warunkiem zachowania pełnej widoczności zwierzęcia, kalibracji przestrzennej i spójnych warunków akwizycji.
- Nagrywanie spontanicznego zachowania lokomotorycznego
- Przed umieszczeniem myszy w arenie krótko wyświetl identyfikator zwierzęcia w klatce wideo, aby zapewnić bezpośrednie powiązanie wizualne między nagraniem a odpowiadającą mu sesją eksperymentalną.
- Uruchom nagrywanie wideo przed umieszczeniem myszy w centrum areny otwartego pola, aby zapewnić rejestrację początkowego zachowania eksploracyjnego od początku sesji.
- Delikatnie umieść mysz w centrum areny otwartego pola.
- Nagrywaj spontaniczną lokomocję w sposób ciągły przez 3 min, nie wprowadzając zakłóceń wizualnych, słuchowych ani dotykowych. W niniejszym protokole wykonano tylko jedną sesję nagraniową na mysz.
- Monitoruj podgląd wideo na ekranie komputera, aby potwierdzić nieprzerwane nagrywanie i prawidłowe rejestrowanie ruchów zwierzęcia.
- Okresowo weryfikuj wyrównanie kamery i jednolitość oświetlenia między sesjami, aby zapewnić spójne warunki nagrywania dla wszystkich zwierząt.
- Po zakończeniu okresu nagrywania zatrzymaj akwizycję wideo i ostrożnie usuń zwierzę z areny, stosując tę samą procedurę obsługi opisaną powyżej.
- Wróć zwierzę do jego klatki domowej i pozwól mu odpocząć przed dalszymi procedurami.
UWAGA: Unikaj repozycjonowania zwierzęcia podczas nagrywania, ponieważ zewnętrzne zakłócenia mogą zmienić spontaniczne wzorce chodu i wpłynąć na późniejszą analizę.
- Czyszczenie, przechowywanie danych i zakończenie sesji
- Ponownie wyczyść arenę otwartego pola 70% (v/v) etanolem po każdej sesji i pozwól jej całkowicie wyschnąć przed wprowadzeniem kolejnego zwierzęcia.
- Upewnij się, że na powierzchni areny nie pozostały resztki etanolu ani zapach przed wprowadzeniem kolejnego zwierzęcia.
- Niezwłocznie po każdym nagraniu udokumentuj identyfikator zwierzęcia, datę i godzinę sesji, warunki eksperymentalne oraz imię operatora.
- Jeśli testowane są kolejne zwierzęta, powtórz procedurę zaczynając od kroku 3.1.1 w identycznych warunkach środowiskowych i eksperymentalnych.
- Zapisz każdy plik wideo w dedykowanym folderze, stosując zestandaryzowaną konwencję nazewnictwa (np. AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
- Na koniec dnia eksperymentalnego wyłącz system kamer i sprzęt oświetleniowy, aby zapobiec dryfowi ustawień oświetlenia między sesjami.
UWAGA: Chociaż w niniejszym protokole użyto 70% etanolu, ponieważ jest on powszechnie stosowanym środkiem dezynfekcyjnym w tego typu procedurach, można również stosować środki dezynfekcyjne kompatybilne z akrylem, aby uniknąć postępującego niszczenia powierzchni, pod warunkiem, że arena będzie całkowicie sucha i wolna od resztkowego zapachu przed następnym nagraniem.
UWAGA: Jeśli jest to możliwe, można przygotować kilka aren, aby umożliwić natychmiastowe przełączanie między sesjami i ułatwić ciągły postęp eksperymentu na różnych zwierzętach.
Patrz Rycina 1 w celu zapoznania się z materiałami i montażem układu eksperymentalnego, w tym z platformą drewnianą (Rycina 1A), akrylową areną (Rycina 1B), systemem oświetlenia bocznego (Rycina 1C), pozycjonowaniem kamery z widokiem od dołu (Rycina 1D) oraz kompletnym układem eksperymentalnym (Rycina 1E).
Rycina 1: Układ eksperymentalny do rejestracji wideo lokomocji w otwartej arenie. (A) konstrukcja wsporcza areny; (B) akrylowa otwarta arena umieszczona na platformie; (C) oświetlenie boczne zapewniające jednorodność światła; (D) rozmieszczenie kamery do rejestrowania ruchu z dołu; (E) kompletny zestaw. Białe groty strzałek wskazują orientację źródła światła na Rycynie 1C oraz kamery na Rycynie 1D. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
4. Przetwarzanie wideo i analiza kinematyczna
- Przygotowanie i kontrola jakości materiału wideo
- Należy pozyskać surowe materiały wideo w formacie .MOV, a następnie przekonwertować je do formatu .avi w celu zapewnienia kompatybilności z programem DeepLabCut, zachowując przy tym stałą liczbę klatek na sekundę oraz parametry rozdzielczości.
- BNależy niezwłocznie po akwizycji wykonać kopię zapasową wszystkich surowych plików wideo w dedykowanym folderze na komputerze analitycznym i zastosować ustandaryzowaną konwencję nazewnictwa (np. IDZwierzęcia_Sesja_Data).
- Należy przejrzeć każdy film w całości, aby potwierdzić, że nagranie jest kompletne i wolne od przerw, pominiętych klatek lub uszkodzeń. Filmy z błędami akwizycji powinny zostać wykluczone z analizy.
- Konwertuj filmy do formatu MP4 (H.264) lub nieskompresowanego formatu AVI, jeśli oryginalny format nie jest kompatybilny z DeepLabCut.
- Opcjonalnie można przeprowadzić przycinanie czasowe materiału wideo w celu usunięcia przedziałów pozaeksperymentalnych na początku i na końcu sesji (np. podczas wprowadzania lub wyjmowania zwierzęcia z areny eksperymentalnej).
- Należy potwierdzić, że rozdzielczość i liczba klatek na sekundę są zgodne z parametrami akwizycji zastosowanymi podczas rejestracji i pozostają spójne we wszystkich sesjach.
- Należy sprawdzić, czy cała powierzchnia areny jest widoczna w kadrze wideo oraz czy żadne części ciała nie są stale przysłonięte podczas lokomocji.
- PUmieścić wszystkie zweryfikowane i przetworzone filmy w wyznaczonym katalogu projektu do analizy w programie DeepLabCut.
UWAGA: KROK KRYTYCZNY: Niespójna liczba klatek na sekundę, częściowa widoczność areny lub rozmycie ruchu bezpośrednio obniżą dokładność śledzenia. Nagrania wideo, które nie spełniają kryteriów jakości, nie powinny być uwzględniane w trenowaniu modelu ani w procesie wnioskowania.
- Tworzenie i konfiguracja projektu
- Wyznacz bibliotekę wideo dla projektu, wykorzystując albo te same filmy, które mają zostać poddane analizie, albo reprezentatywny podzbiór do trenowania sieci.
- Uruchom środowisko Python i zaimportuj pakiet DeepLabCut.
- Utwórz nowy projekt DeepLabCut, używając komendy:
- deeplabcut.create_new_project('NazwaProjektu','Autor','ŚcieżkaDoWideo').
- Zdefiniuj w pliku config.yaml interesujące punkty orientacyjne anatomiczne (części ciała), zapewniając jasne i spójne anatomicznie definicje.
- Definicje części ciała powinny być zoptymalizowane pod kątem pytania badawczego i pozostać identyczne dla wszystkich zwierząt oraz sesji.
- Ekstrakcja klatek i etykietowanie części ciała
- W pliku config.yaml należy określić parametry start, stop, numframes2extract oraz cropping_parameters, zgodnie z długością filmu i układem przestrzennym.
- Wyodrębnij reprezentatywne klatki za pomocą: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'automatic', 'kmeans'/'uniform').
- Przejrzyj wyekstrahowane klatki, aby potwierdzić uwzględnienie zmienności postawy ciała, orientacji, pozycji kończyn oraz zakresu faz chodu w obrębie całego nagrania. Jeśli określone postawy, konfiguracje kończyn lub fazy lokomocyjne są niedostatecznie reprezentowane, wyekstrahuj dodatkowe klatki, aby lepiej odwzorować te warunki.
- W przypadku konieczności wyodrębnienia konkretnych faz cyklu chodu, należy ręcznie wyekstrahować klatki za pomocą funkcji: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manual').
- Uruchom graficzny interfejs etykietowania za pomocą: deeplabcut.label_frames(config_path).
- Oznacz wszystkie zdefiniowane punkty anatomiczne pokazane w Rysunek 2, w tym reprezentatywną klatkę wideo podczas akwizycji (Rycina 2A), zautomatyzowana detekcja punktów ciała nałożona na oryginalną klatkę (Rycina 2B), a także schematyczne przedstawienie zdefiniowanych punktów orientacyjnych ciała i punktów odniesienia areny wykorzystanych do analizy (Rysunek 2C). Należy stosować spójne kryteria anatomiczne (np. nos: przednia końcówka pyska; nasada ogona: miejsce połączenia kręgosłupa z ogonem)
- Oznacz konsekwentnie wszystkie cztery kończyny, umieszczając każdy punkt orientacyjny w centrum łapy, nad poduszkami stóp, w miejscu kontaktu z podłożem.
- Zapisz i sprawdź etykiety, używając polecenia: deeplabcut.check_labels(config_path), a w razie potrzeby popraw błędne adnotacje.
- W miarę możliwości należy poprosić drugiego przeszkolonego ewaluatora o oznakowanie podzbioru klatek w celu oceny spójności między sędziami.
UWAGA: KROK KRYTYCZNY: Niespójne lub anatomicznie nieprecyzyjne etykietowanie jest głównym źródłem błędów w późniejszym śledzeniu. Należy zapewnić ścisłe przestrzeganie definicji punktów charakterystycznych we wszystkich klatkach.
- Trenowanie sieci neuronowej
- Trenuj model estymacji pozy przez 200 epok, aby uzyskać końcowy średni błąd treningowy (RMSE) wynoszący 3,27 piksela oraz średni błąd testowy wynoszący 3,59 piksela, co odpowiada stabilnej wydajności śledzenia w opisanych warunkach akwizycji.
- Utwórz zestawy danych treningowych i ewaluacyjnych, korzystając z funkcji: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
- Dostosuj parametr Training Fraction w pliku config.yaml, aby określić proporcję obrazów wykorzystywanych do trenowania.
- Zweryfikuj dostępność procesora GPU, uruchamiając polecenie: nvidia-smi.
- Rozpocznij trenowanie sieci za pomocą: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200).
- Monitoruj stratę podczas treningu i przerwij proces szkolenia, gdy wartości straty się ustabilizują i nie będzie obserwowano dalszej poprawy.
- Jeśli proces uczenia zostanie przerwany, należy go wznowić z ostatniego zapisanego punktu kontrolnego.
- Oceń wytrenowany model za pomocą funkcji deeplabcut.evaluate_network(config_path) i zapisz średni błąd pikselowy.
- Jeśli błąd przekroczy dopuszczalny próg dla danej konfiguracji eksperymentalnej, należy dodać kolejne oznakowane klatki lub doprecyzować adnotacje, a następnie powtórzyć proces uczenia.
UWAGA: Dopuszczalne progi błędu pikselowego mogą się różnić w zależności od rozdzielczości kamery i wielkości areny, jednak powinny pozostać spójne we wszystkich eksperymentach.
- Analiza wideo i kwantyfikacja chodu
- Punkty o wartości prawdopodobieństwa poniżej 0,3 należy uznać za brakujące.
- Stosuj interpolację liniową brakujących punktów wyłącznie w przypadku luk wynoszących ≤3 kolejnych klatek; dłuższe luki należy wykluczyć z analizy.
- Zdefiniuj epizody lokomocji, przyjmując próg prędkości środka ciężkości ciała wynoszący 10 cm/s.
- Należy wykluczyć ruchy poniżej tego progu oraz zdarzenia przejściowe trwające krócej niż 3 klatki.
- Przeprowadź wnioskowanie na filmach eksperymentalnych, używając: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=True).
- Wygeneruj filmy z etykietami za pomocą funkcji: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]), aby wizualnie potwierdzić jakość śledzenia (Rycina 2).
- Ustaw parametr pcutoff w pliku config.yaml na 0,6, aby zastosować próg ufności podczas wizualizacji i ewaluacji śledzenia.
- Zaimportuj wynikowe pliki CSV do środowiska obliczeń statystycznych wymienionego w Tabela materiałówwraz z odpowiednim pakietem analitycznym i dostarczonymi niestandardowymi skryptami w Materiał uzupełniający 1 do ilościowego określania zachowań.
- Przelicz indeksy klatek na czas, korzystając z oryginalnej częstotliwości próbkowania wideo.
- Zkalibruj wymiary przestrzenne, przekształcając współrzędne pikseli w jednostki fizyczne przy użyciu znanych wymiarów areny oraz śledzonych punktów orientacyjnych w narożnikach areny.
- Przeprowadź kontrolę jakości śledzonych współrzędnych przed ekstrakcją parametrów.
- Punkty o wartości prawdopodobieństwa poniżej 0,3 należy uznać za brakujące i w odpowiednich przypadkach zastąpić je interpolacją liniową.
- Podczas inspekcji wizualnej należy zidentyfikować trajektorie odstające, a następnie w razie potrzeby je skorygować lub wykluczyć.
- Zdefiniuj segmenty chodu, wykorzystując zsynchronizowane kryteria kinematyczne oparte na przemieszczeniu środka ciężkości ciała oraz ruchu kończyn tylnych.
- Wyklucz zachowania nieuwędrowne, takie jak wstawanie na tylne łapy, obracanie się i pielęgnacja.
- Należy ręcznie skalibrować i doprecyzować progi definicyjne zgodnie z warunkami eksperymentalnymi i modelem zwierzęcym, aby do analizy zachować jedynie wyraźne, ciągłe epizody aktywności lokomocyjnej.
- Oblicz wskaźniki chodu wyprowadzone z zależności geometrycznych i czasowych między śledzonymi punktami orientacyjnymi, wykorzystując przefiltrowane ciągłe segmenty lokomocji (Tabela 1). Obejmowały one długość kroku (stride length), długość pojedynczego stopnia (step length), szerokość kroku, kadencję, czas trwania cyklu krokowego, czas trwania pojedynczego stopnia, czas podporu, czas przeniesienia, amplitudę ipsilateralną oraz miary przemieszczenia specyficzne dla kończyny.
- Wyodrębnij parametry z testu otwartego pola z pełnego nagrania, korzystając z tych samych danych śledzenia (Tabela 1). Obejmowały one całkowity przebyty dystans, średnią prędkość, czas spędzony w ruchu, procent czasu spędzonego w ruchu, liczbę i czas trwania epizodów chodzenia oraz skumulowany dystans pokonany w strefie centralnej, peryferyjnej i narożnej.
- Zestaw wszystkie wyniki w ustrukturyzowanym pliku głównym do dalszej analizy statystycznej.
- Generuj reprezentacje wizualne (np. trajektorie, mapy ciepła, przemieszczenie w czasie, wzorce chodu oraz wykresy koordynacji między kończynami) przy użyciu środowisk obliczeniowych wymienionych w Tabela materiałów oraz opisane powyżej skrypty do generowania wykresów.
- Reprezentatywne zsynchronizowane wizualizacje ufności punktowej, detekcji cykli chodu, klasyfikacji stref eksploracyjnych oraz koordynacji międzykończynowej zostały przedstawione w Wideo uzupełniające 1 i Film uzupełniający 2 aby ułatwić interpretację schematu analitycznego.
- Kontrola jakości i kopia zapasowa danych
- Wizualnie sprawdź losową podgrupę oznakowanych filmów, aby potwierdzić spójność anatomiczną między klatkami a sesjami.
- Porównaj przewidywane pozycje punktów charakterystycznych z etykietami adnotacji, aby zweryfikować stabilność i generalizację modelu.
- Zapisz pełną kopię projektu, obejmującą plik config.yaml, oryginalne etykiety, wyuczone wagi sieci oraz pliki wyjściowe.
- Należy udokumentować wersje oprogramowania wykorzystanego w schemacie postępowania, w tym DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA oraz środowisko obliczeń statystycznych, wraz ze specyfikacją procesora GPU i datą przeprowadzenia analizy.
- Wygeneruj raport podsumowujący średnie błędy i czasy przetwarzania z pliku evaluation-results.csv.
- Utwórz kopię zapasową całego projektu w lokalnym archiwum oraz na serwerze instytucjonalnym lub w bezpiecznej chmurze.
- Środowisko obliczeniowe i zasoby służące do zapewnienia powtarzalności
- Należy zarejestrować oryginalne nagrania wideo w formacie .MOV w rozdzielczości 1080 × 1920 pikseli i przy częstotliwości około 60 kl./s.
- Przetwórz wstępnie i przekoduj filmy do formatu .avi.
- Podczas tego etapu konwersji należy wykadrować obszar zainteresowania, zmienić jego rozmiar do kwadratowej rozdzielczości 720 × 720 pikseli oraz ustandaryzować częstotliwość klatek do stałej wartości 60 FPS, aby zapewnić dokładną kwantyfikację czasową podczas późniejszej analizy kinematycznej.
- Wdróż proces śledzenia bezmarkerowego przy użyciu oprogramowania DeepLabCut w wersji 3.0.0rc13 w środowisku Python skonfigurowanym z Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 oraz CUDA 11.8.
- Trenuj model estymacji pozy przez 200 epok, aby uzyskać końcowy średni błąd treningowy (RMSE) na poziomie 3,27 piksela oraz średni błąd testowy na poziomie 3,59 piksela.
- Przeprowadź analizę pośledzenia, wykorzystując środowisko obliczeń statystycznych oraz dostarczone skrypty niestandardowe w Materiał uzupełniający 1 do ilościowej analizy chodu i zachowania w otwartym polu.
- Do identyfikacji odcinków chodu należy zastosować próg prędkości środka ciała wynoszący 10 cm/s. Luki do 3 klatek między epokami lokomocji należy uzupełnić, a ruchy przejściowe trwające krócej niż 3 klatki należy wykluczyć, aby zachować ciągłe segmenty chodu do analizy.
- Dostarcz odpowiednie ustawienia pliku config.yaml, reprezentatywne skrypty analizy, przykładowe pliki wideo i śledzenia oraz wagi modelu w Materiały uzupełniające 1.
- Podaj dodatkowe szczegóły dotyczące implementacji, metryki oceny modelu, specyfikację sprzętową oraz parametry analizy specyficzne dla danego przypadku w Materiały uzupełniające 1, jeżeli dotyczy.
UWAGA: Dostosuj te parametry zgodnie z warunkami akwizycji zastosowanymi w każdym eksperymencie.
Rysunek 2: Reprezentatywny schemat procesu bezmarkerowego śledzenia punktów ciała i analizy chodu na podstawie nagrań wideo. (A) Reprezentatywna klatka wideo myszy swobodnie poruszającej się w obrębie areny open field podczas akwizycji. (B) Przykład automatycznej detekcji punktów ciała nałożonej na oryginalną klatkę wideo po estymacji pozy, ilustrujący punkty anatomiczne wykorzystane do analizy. (C) Schematyczne przedstawienie zdefiniowanych punktów orientacyjnych ciała oraz punktów odniesienia areny wykorzystywanych do rekonstrukcji chodu, kalibracji przestrzennej i ilościowej analizy lokomocyjnej. Punkty orientacyjne i punkty odniesienia areny: ryj, gardło, środek ciała, lewy środek ciała (bcl), prawy środek ciała (bcr), lewe biodro (hipl), prawe biodro (hipr), nasada ogona, środek ogona, koniec ogona, lewa przednia łapa (lfp), lewa tylna łapa (lhp), prawa przednia łapa (rfp), prawa tylna łapa (rhp), góra lewo (tl), góra prawo (tr), dół lewo (bl) oraz dół prawo (br). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po zastosowaniu schematu śledzenia i analizy, zautomatyzowane przetwarzanie zrekonstruowało spontaniczną lokomocję w otwartym polu przy użyciu zdefiniowanego punktu orientacyjnego centrum ciała i wygenerowało ilościowe wyniki odpowiednie do dalszej analizy. Reprezentatywne wykresy trajektorii obrazują, w jaki sposób protokół rejestruje przemieszczenie przestrzenne w obrębie areny, czas przebywania w poszczególnych strefach oraz dynamikę prędkości podczas swobodnej eksploracji. Zmienne dotyczące otwartego pola przedstawio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
To studium przedstawia niskobudżetowe, bezmarkerowe podejście do analizy spontanicznej lokomocji i chodu u swobodnie poruszających się myszy, wykorzystujące standardową akwizycję wideo i oparte na DeepLabCut oszacowanie pozycji w ramach przystępnego przepływu pracy. Przepływ pracy umożliwia wyodrębnienie z nagrań wideo zmiennych związanych z lokomocjią i chodem, zachowując naturalne zachowania lokomotoryczne i zmniejszając interferencję eksperymentalną. W tym sensie, protokół oferuje praktyczną i dostępną alternatywę dla...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że badania przeprowadzono bez jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.
Podziękowania
J.J.A.-G jest doktorantem z Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) i otrzymał stypendium SECIHTI (nr 1145816). Ponadto autorzy dziękują A. R. Aguilar Vázquez, E.A. De los Ríos Arellano i D. Gasca Martínez za ich wsparcie techniczne.
FUNDOWANIE: Badania te były finansowane przez UNAM-PAPIIT (209325, IN227026) i grant nauk podstawowych i przy granicy o numerze CBF-2025-G-35.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 70% ethanol | Generic | N/A | Czyszczenie aren podczas sesji |
| Adjustable white-light lamps | Generic | N/A | Utrzymanie stałego oświetlenia (100–150 lx) |
| Black curtains/glare control | Generic | N/A | Zmniejszenie światła zewnętrznego/odbić |
| Checkerboard grid template | Generic | N/A | Obrazek odniesienia do kalibracji przestrzennej |
| DeepLabCut (v3.0.0rc13) | Open-source | N/A | Oprogramowanie do estymacji pozę |
| Digital video camera (HD, 16:9; ≥60 fps) | Generic | N/A | Ustawienia stałe w trakcie sesji |
| Nvidia GPU workstation | Custom build | N/A | Sprzęt do treningu/inferencji modelu |
| Lux meter | Generic | N/A | Weryfikacja oświetlenia na poziomie areny |
| PyTorch | Pytorch Foundation | N/A | Framework wymagany przez DeepLabCut |
| Transparent acrylic open-field arena (42 × 42 × 42 cm) | Custom-made / In-house | N/A | Arena typu open-field |
| Under-arena camera mount (90° view) | Custom-made / In-house | N/A | Stabilne mocowanie do nagrywania od dołu |
| CUDA | Nvidia corporation | N/A | Równoległe przetwarzanie przyspieszane przez GPU |
| R programming language | R Foundation | N/A | Język programowania do analizy danych |
Bibliografia
- Takakusaki, K. Functional neuroanatomy for posture and gait control. J Mov Disord. 10 (1), 1-17 (2017).
- Pamoukdjian, F., et al. Measurement of gait speed in older adults to identify complications associated with frailty: a systematic review. J Geriatr Oncol. 6 (6), 484-496 (2015).
- Mukli, P., et al. Gait variability predicts cognitive impairment in older adults with subclinical cerebral small vessel disease. Front Aging Neurosci. 14, 1052451 (2022).
- Mancini, M., et al. Digital gait biomarkers in Parkinson’s disease: susceptibility/risk, progression, response to exercise, and prognosis. NPJ Parkinsons Dis. 11 (1), 51 (2025).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Wisniewski, T., Masurkar, A. V. Gait dysfunction in Alzheimer disease. Handb Clin Neurol. 196, 267-274 (2023).
- Walter, J., et al. The CatWalk XT is a valid tool for objective assessment of motor function in the acute phase after controlled cortical impact in mice. Behav Brain Res. 392, 112680 (2020).
- Connell, J. W., Allison, R., Reid, E. Quantitative gait analysis using a motorized treadmill system sensitively detects motor abnormalities in mice expressing ATPase defective spastin. PLoS One. 11 (3), e0152413 (2016).
- Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait analysis of age-dependent motor impairments in mice with neurodegeneration. J Vis Exp. (136), e57752 (2018).
- Rastoldo, G., et al. Quantitative evaluation of a new posturo-locomotor phenotype in a rodent model of acute unilateral vestibulopathy. Front Neurol. 11, 505 (2020).
- Carregosa, D., et al. Locomotor and gait changes in the LPS model of neuroinflammation are correlated with inflammatory cytokines in blood and brain. J Inflamm. 21 (1), 39 (2024).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied to chronic restraint stress. J Vis Exp. (143), e59027 (2019).
- Wong, J., Shah, P. K. 3D kinematic gait analysis for preclinical studies in rodents. J Vis Exp. (150), e59612 (2019).
- Stauch, K. L., et al. Applying the RatWalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. J Vis Exp. (167), e62002 (2021).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Nath, T., et al. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nat Protoc. 14 (7), 2152-2176 (2019).
- Lauer, J., et al. Multi-animal pose estimation, identification and tracking with DeepLabCut. Nat Methods. 19 (4), 496-504 (2022).
- Sturman, O., et al. Deep learning-based behavioral analysis reaches human accuracy and is capable of outperforming commercial solutions. Neuropsychopharmacology. 45 (11), 1942-1952 (2020).
- Castillo-Mariqueo, L., Pérez-García, M. J., Giménez-Llort, L. Modeling functional limitations, gait impairments, and muscle pathology in Alzheimer’s disease: studies in the 3xTg-AD mice. Biomedicines. 9 (10), 1365 (2021).
- Nyul-Toth, A., et al. Early manifestation of gait alterations in the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Geroscience. 43 (4), 1947-1957 (2021).
- Ni, H., et al. Impairment of theta oscillations in the hippocampal CA1 region may mediate age-dependent movement alterations in the 5xFAD mouse model of Alzheimer’s disease. Sci Rep. 15 (1), 10975 (2025).
- Broberg, D. N., et al. Effects of memantine and high dose vitamin D on gait in male APP/PS1 Alzheimer’s disease mice following vitamin D deprivation. J Alzheimers Dis. 85 (4), 1755-1766 (2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
