Tani niskokosztowy proces bez markerów oparty na DeepLabCut do analizy spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie

Podsumowanie

Przedstawiamy niskonakładowy, bezznacznikowy proces za pomocą DeepLabCut do ilościowego określania spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie. Ten protokół integruje nagranie wideo z jedną kamerą, bezznacznikowe śledzenie punktów anatomicznych i wyodrębnianie parametrów lokomocji przestrzenno-czasowych, zapewniając nieinwazyjne i dostępne narzędzie do analizy zachowań motorycznych bez specjalistycznego sprzętu.

Streszczenie

Chod jest szeroko stosowanym biomarkerem funkcjonalnym do wykrywania zmian motorycznych w różnych chorobach i stanach, ponieważ odzwierciedla zmiany w koordynacji, sile, równowadze i integracji czuciowo-ruchową. Jednak tradycyjne metody analizy chodu w modelach zwierzęcych często wymagają drogiego sprzętu, złożonych ustawień lub inwazyjnych procedur, które mogą zmieniać naturalne zachowanie. Przedstawiamy niskonakładowy, bezmarkerowy przepływ pracy oparty na DeepLabCut, oprogramowaniu open-source do estymacji pozycji ciała, dla ilościowej analizy chodu i spontanicznej lokomocji u wolno poruszających się myszy. Metoda opiera się na pojedynczej kamerze do akwizycji wideo, bezmarkerowym śledzeniu punktów anatomicznych i ekstrakcji przestrzenno-czasowych parametrów lokomocji, bez konieczności fizycznych markerów czy specjalistycznego sprzętu. Aby zademonstrować zastosowanie protokołu, zaimplementowano go w potrójnym transgenicznym modelu myszy choroby Alzheimera (3xTg-AD) jako przykładowy przykład zastosowania. To podejście zachowuje wolny ruch i minimalizuje stres związany z obsługą, umożliwiając nieinwazyjną ocenę zachowania motorycznego. Protokół jest kompatybilny ze standardowymi środowiskami testowania zachowań. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda zapewnia dostępną i nieinwazyjną ramę dla ilościowej analizy chodu i lokomocji w badaniach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Chod to skomplikowana funkcja motoryczna, która powstaje z rzeczywistej interakcji układu motorycznego, sensorycznego i poznawczego, wymagająca skoordynowanego przetwarzania zwrotnego działania sensorycznego, kontroli postawy, planowania motorycznego i aktywacji mięśni, aby wygenerować stabilny, adaptacyjny ruch¹. Ze względu na tę integracyjną naturę, zmiany chodu są coraz częściej rozpoznawane jako funkcjonalne wskaźniki dysfunkcji neurologicznej zarówno w praktyce klinicznej, jak i w badaniach eksperymentalnych. U ludzi i w modelach zwierzęcych analiza chodu umożliwia wykrywanie zmian w mobilności, ryzyku upadku, delikatności i zdolności funkcjonalnej, i została zaproponowana jako biomarker progresji choroby i skuteczności interwencji w wielu schorzeniach^2,3,4.

W badaniach podstawowych, szczególnie w modelach mysich, ocena spontanicznego chodu i aktywności lokomotorycznej jest szeroko stosowaną strategią do charakteryzacji fenotypu motorycznego i oceny wpływu fizjologicznych zakłóceń oraz interwencji terapeutycznych. Obiektywne ilościowe określenie parametrów lokomotorycznych umożliwia wykrycie subtelnych zmian motorycznych, które nie są wiarygodnie uchwycone wyłącznie przez inspekcję wizualną, ograniczenia, które są szczególnie istotne w badaniach przedklinicznych ukierunkowanych na wczesne lub łagodne fenotypy⁵. W tym kontekście analiza chodu stała się cennym narzędziem do badania zmian w zachowaniu motorycznym i identyfikowania zmian funkcjonalnych związanych z różnymi warunkami eksperymentalnymi, takimi jak choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne⁶.

Analiza zachowania motorycznego i chodu w modelach mysich tradycyjnie opierała się na wyspecjalizowanych platformach technologicznych przeznaczonych do ilościowego określania zmiennych kinematycznych przestrzennych i czasowych. Systemy takie jak oświetlone przejścia, instrumentacyjne platformy i komercyjne oprogramowanie do śledzenia ruchu są powszechnie stosowane; jednak ich zależność od kosztownego sprzętu i dedykowanej infrastruktury znacznie ogranicza dostępność dla wielu laboratoriów^7,8,9,10. Poza uwagami ekonomicznymi, podejścia te wprowadzają dodatkowe ograniczenia eksperymentalne. Kilka systemów wymaga od zwierząt przejścia przez wąskie korytarze lub silnie oświetlone korytarze, wymuszające wzorce ruchowe, które zmniejszają spontaniczne zachowanie, podczas gdy inne opierają się na fizycznych znacznikach, plamach farby lub naklejkach klejących przymocowanych do kończyn. Takie interwencje mogą wywoływać stres, zmieniać mechanikę chodu i komplikować fizjologiczne interpretacje wyników motorycznych^11,12,13,14. Łącznie, te ograniczenia podkreślają potrzebę metodologii zdolnych do rejestrowania chodu w naturalnych warunkach wolnego poruszania bez konieczności stosowania inwazyjnych procedur lub kosztownej infrastruktury.

Ocenienie chodu podczas nieograniczonych ruchów umożliwia obserwację bardziej naturalnych wzorców motorycznych, unikając ograniczenia zewnętrznego, które sztucznie regulują prędkość, trajektorię czy postawę. Takie podejście ułatwia charakteryzację zachowań lokomotorycznych w warunkach minimalnie ograniczających. DeepLabCut to otwarta, głęboko-ucząca się rama estymacji pozycji oparta na sieciach neuronowych konwolucyjnych, która wykorzystuje standardowe nagrania wideo do śledzenia przez użytkownika określonych punktów anatomicznych bez konieczności używania fizycznych znaczników. Umożliwiając śledzenie punktów anatomicznych z nagrań wideo, DeepLabCut umożliwia wyodrębnienie parametrów kinematycznych, znacznie zmniejszając koszt i złożoność eksperymentu^15,16,17,18. Co ważne, śledzenie bez znaczników minimalizuje interferencję eksperymentalną, co sprawia, że jest to odpowiednie dla badań spontanicznego zachowania. Ten jednokamerowy markerlessowy podejście jest najbardziej odpowiedni dla badań wymagających dostępnego, nieinwazyjnego ilościowego określenia spontanicznej aktywności lokomotorycznej i dwuwymiarowe cechy związane z chodzeniem w warunkach wolnego poruszania. Jednak instrumentacyjne platformy chodu lub trójwymiarowe systemy przechwytywania ruchu są wymagane, gdy potrzebne są bezpośrednie zmienne biomechaniczne, takie jak siły reakcji gruntu, ciśnienie podeszwowe, kąty stawów lub pełna trójwymiarowa kinemyka kończyn.

Celem tego artykułu jest przedstawienie nisko-kosztowego, markerlessowego procesu opartego na DeepLabCut do nieinwazyjnego ilościowego określenia chodu i spontanicznego chodzenia u myszy poruszających się swobodnie, integrując nagrania wideo z jednej kamery, śledzenie punktów anatomicznych i wyodrębnienie parametrów czasowo-przestrzennych zachowań lokomotorycznych w dostępnym procesie, który nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani inwazyjnej manipulacji. Ten protokół koncentruje się na metodologicznej implementacji i reprezentatywnych wynikach procesu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzano zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i zostały zatwierdzone przez Komitet Bioetyczny Instytutu Neurobiologii Narodowego Uniwersytetu Autonomicznego Meksyku, w ramach protokołu numer 117.

1. Kontekst badania

1. Używaj myszy w warunkach eksperymentalnych wymaganych do badania. W tym artykule protokołowym stosujemy potrójny transgenny model myszy choroby Alzheimera (3xTg-AD), zawierający transgeny APPSwe i tauP301L na podłożu knock-in PS1M146V, wraz z myszami nietransgennymi jako kontrolą, jako przykładowy przykład implementacji przepływu pracy.
2. Wyznacz genotyp wszystkich zwierząt przed rozpoczęciem badania.
3. Utrzymuj myszy z pokarmem i wodą ad libitum w kontrolowanych warunkach, składających się z cyklu światło-ciemność 12:12 h, temperatury 22 °C ± 2 °C i wilgotności względnej 60% ± 5%, pod nadzorem weterynaryjnym.
4. Przeprowadź rejestrowanie w fazie świetlnej po 60-minutowym okresie przyzwyczajania, stosując jedną sesję otwartego pola na zwierzę, aby zachować spontaniczne zachowanie eksploracyjne i uniknąć zmniejszonej aktywności związanej z wielokrotnym narażeniem na arenę.
   UWAGA: W tym artykule protokołowym przedstawiamy reprezentatywne rejestracje wyłącznie w celu zilustrowania przepływu pracy i rodzaju wyników lokomocji i chodu generowanych przez metodę, a nie w celu wsparcia porównań biologicznych między grupami.

2. Materiały

1. Używaj materiałów i sprzętu wymienionych w Tabeli Materiałów i sprzęcie do rejestracji i analizy spontanicznej lokomocji i chodu. Zobacz Rysunek 1 na ogólny montaż zestawu eksperymentalnego.

3. Przyzwyczajenie i rejestrowanie spontanicznej lokomocji

1. Przygotowanie zwierząt i przyzwyczajenie
   1. Opiekuńczo przenieś mysz z jej pomieszczenia do pomieszczenia testów behawioralnych co najmniej 60 minut przed eksperymentem, aby umożliwić przyzwyczajenie do środowiska.
   2. Utrzymuj pomieszczenie testów behawioralnych w kontrolowanych warunkach środowiskowych, w tym stałej temperaturze 20 °C-22 °C, standaryzowanej intensywności oświetlenia (120-150 luksów zmierzonych na poziomie arenowym) oraz ciągłej białej dźwiękowej szumie, aby zminimalizować zewnętrzne bodźce słuchowe.
   3. Podczas okresu przyzwyczajania trzymaj zwierzę w jego domowej klatce bez wprowadzania dodatkowych bodźców lub wzbogacenia. Obsługuj zwierzę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, aby zminimalizować zmienność behawioralną indukowaną stresem.
   4. Obsługuj zwierzę za pomocą czystych rękawic i powolnych, rozważnych ruchów. Podnieś zwierzę delikatnie za podstawę ogona i wspieraj ciało przeciwną ręką przed umieszczeniem go na otwartym polu.
      ​Uwaga: KRYTYCZNY KROK: Niekonsekwentne obsługiwanie lub niewystarczający czas przyzwyczajania mogą zwiększyć zachowania związane z lękiem i wprowadzić zmienność parametrów lokomocji. Upewnij się, że identyczne procedury przyzwyczajania są stosowane dla wszystkich zwierząt i sesji.
2. Arena otwartego pola i przygotowanie kamery
   1. Przed każdą sesją rejestracji dokładnie wyczyść akrylową arenę otwartego pola 70% (v/v) etanolem, aby usunąć pozostałości zapachu i poprzednie wskazówki zapachowe. Pozwól powierzchni dokładnie wyschnąć przed użyciem.
   2. Obsługuj 70% etanol w dobrze wentylowanym miejscu, trzymaj go z dala od źródeł ciepła lub zapłonu i pozwól arenie dokładnie wyschnąć przed użyciem.
   3. Umieść arenę otwartego pola bezpiecznie na drewnianej platformie, upewniając się, że struktura jest stabilna i nie ma wibracji.
   4. Sprawdź przezroczyste akrylowe ściany i matową powierzchnię podłogi, aby potwierdzić, że są wolne od kurzu, wilgoci lub odblasków, które mogą zakłócać śledzenie wideo.
   5. Umieść zewnętrzne boczne lampy świetlne na obu stronach aren o kątach około 30-45° względem płaszczyzny aren, aby zapewnić jednolite oświetlenie na całym obszarze rejestracji i zminimalizować cienie, odbicia lub nadmierną jasność. Skonfiguruj pozycję lamp przed każdą sesją i upewnij się, że oświetlenie na poziomie aren znajduje się w docelowym zakresie 120-150 luksów.
   6. Umieść kamerę poniżej aren w konfiguracji z widokiem od dołu w stałej odległości około 80 cm od płaszczyzny aren, zapewniając pełną widoczność obszaru rejestracji. Należy pamiętać, że ta optymalna odległość może wymagać dostosowania w zależności od apertury obiektywu i pola widzenia (FOV) konkretnej kamery, aby utrzymać pełne pokrycie aren.
   7. Podłącz kamerę do systemu komputerowego i uruchom oprogramowanie do akwizycji wideo przed wprowadzeniem zwierzęcia.
   <

Wyniki

Po zastosowaniu przepływu pracy do śledzenia i analizy, zautomatyzowane przetwarzanie zrekonstruowało spontaniczną aktywność ruchową na otwartym polu, korzystając z określonego punktu centralnego ciała i generując ilościowe wyniki nadające się do dalszej analizy. Przedstawione wykresy trajektorii ilustrują, w jaki sposób protokół rejestruje przemieszczanie się w przestrzeni, zajętość czasową i dynamikę prędkości podczas swobodnego eksplorowania. Wskaźniki z otwartego pola przedstawione w tej sekcji zostały obliczone na p...

Dyskusja

To studium przedstawia niskobudżetowe, bezmarkerowe podejście do analizy spontanicznej lokomocji i chodu u swobodnie poruszających się myszy, wykorzystujące standardową akwizycję wideo i oparte na DeepLabCut oszacowanie pozycji w ramach przystępnego przepływu pracy. Przepływ pracy umożliwia wyodrębnienie z nagrań wideo zmiennych związanych z lokomocjią i chodem, zachowując naturalne zachowania lokomotoryczne i zmniejszając interferencję eksperymentalną. W tym sensie, protokół oferuje praktyczną i dostępną alternatywę dla...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70% ethanol	Generic	N/A	Czyszczenie aren podczas sesji
Adjustable white-light lamps	Generic	N/A	Utrzymanie stałego oświetlenia (100–150 lx)
Black curtains/glare control	Generic	N/A	Zmniejszenie światła zewnętrznego/odbić
Checkerboard grid template	Generic	N/A	Obrazek odniesienia do kalibracji przestrzennej
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-source	N/A	Oprogramowanie do estymacji pozę
Digital video camera (HD, 16:9; ≥60 fps)	Generic	N/A	Ustawienia stałe w trakcie sesji
Nvidia GPU workstation	Custom build	N/A	Sprzęt do treningu/inferencji modelu
Lux meter	Generic	N/A	Weryfikacja oświetlenia na poziomie areny
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Framework wymagany przez DeepLabCut
Transparent acrylic open-field arena (42 × 42 × 42 cm)	Custom-made / In-house	N/A	Arena typu open-field
Under-arena camera mount (90° view)	Custom-made / In-house	N/A	Stabilne mocowanie do nagrywania od dołu
CUDA	Nvidia corporation	N/A	Równoległe przetwarzanie przyspieszane przez GPU
R programming language	R Foundation	N/A	Język programowania do analizy danych