Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odtwarzalny protokół oparty na Seurat do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek komórek jednojądrzastych CD4+ z krwi obwodowej podczas reinfekcji malarycznej

106 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70858

⸱

31 lipca 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj odtwarzalny protokół oparty na Seurat do analizy danych sekwencjonowania RNA jednokomórkowego z mononuklearnych komórek krwi obwodowej CD4⁺ limfocytów T w celu scharakteryzowania heterogeniczności transkrypcyjnej i funkcjonalnych programów odpowiedzi immunologicznej podczas nawrotu malarii. Ten protokół umożliwia spójne identyfikowanie, porównywanie i biologiczne interpretowanie dynamicznych stanów limfocytów CD4⁺ T oraz odpowiedzi immunologicznych w różnych warunkach.

Streszczenie

Tu przedstawiamy odtwarzalny protokół oparty na Seurat do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek CD4⁺ T z komórek krwi obwodowej w punktach czasowych reinfekcji malarii. Ten protokół demonstruje odtwarzalny przepływ pracy oparty na Seurat do analizy danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek CD4⁺ T w punktach czasowych reinfekcji malarii, wykorzystując reprezentatywne publicznie dostępne zbiory danych do zademonstrowania jego zastosowania: zbiór danych komórek CD4⁺ T transgenicznych TCR specyficznych dla Plasmodium (GSE233703) oraz zbiór danych poliklonalnych komórek CD4⁺ T porównujących punkty czasowe związane z reinfekcją (GSE233713; D27₍₃₎ versus D30). Przepływ pracy obejmuje standaryzowane przetwarzanie wstępne, integrację, grupowanie i analizy transkryptomowe na wyższym poziomie w ramach ujednoliconego systemu obliczeniowego. Metoda umożliwia systematyczne obliczanie wyników modułów dla predefiniowanych programów odpornościowych i komórek CD4⁺ T, identyfikację genów markerowych specyficznych dla grup, analizę różnicowej ekspresji rozdzielonych czasowo oraz analizy wzbogacenia w Ontologii Genów i ścieżki KEGG. Zastosowanie tego przepływu pracy identyfikuje odrębne stany funkcjonalne komórek CD4⁺ T i ujawnia dynamiczne zmiany transkrypcyjne w punktach czasowych reinfekcji malarii. Protokół generuje standaryzowane wyniki wizualizacji i sformatyzowane wyniki oraz zapewnia praktyczne wskazówki dotyczące wyboru parametrów i rozwiązywania problemów, ułatwiając spójną i odtwarzalną analizę zbiorów danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek CD4⁺ T w malarii i powiązanych kontekstach immunologicznych. Ten protokół umożliwia odtwarzalną i biologicznie interpretowalną analizę odpowiedzi immunologicznych i może być stosowany do podobnych zbiorów danych pojedynczych komórek w badaniach immunologicznych.

Wprowadzenie

Malaria nadal jest głównym globalnym obciążeniem zdrowotnym, a powtarzające się infekcje kształtują odporność gospodarza w złożony i nie do końca zrozumiały sposób1. Komórki CD4⁺ T odgrywają centralną rolę w odpowiedziach immunologicznych przeciwmalarycznych poprzez koordynowanie produkcji cytokin efektorowych, wspieranie pomocy komórek B i regulację stanu zapalnego2,3. Podczas reinfekcji malarycznej, komórki CD4⁺ T przechodzą dynamiczne przeprogramowanie transkrypcyjne, odzwierciedlając zmiany między stanem efektorowym, regulacyjnym, pamięciowym, proliferacyjnym i wyczerpaniem, które wpływają zarówno na kontrolę pasożytów, jak i immunopatologię4,5. Dokładne rozdzielenie tej heterogeniczności jest niezbędne do zrozumienia ochrony immunologicznej, dysfunkcji układu odpornościowego i trwałości naturalnie nabytej lub indukowanej szczepionką odporności na infekcję Plasmodium. Przedstawiamy tutaj odtwarzalny protokół oparty na Seurat do analizy danych scRNA-seq komórek T CD4⁺ w punktach czasowych reinfekcji malarycznej.

Sekwencjowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) umożliwia wysokorozdzielcze charakteryzowanie heterogeniczności immunologicznej i zidentyfikowało odpowiadające na pasożyty podzbiory komórek T CD4⁺, programy wyczerpania i sieci regulacyjne w malarii6,7,8,9. Jednak zmienność analityczna w kontroli jakości, normalizacji, klasteryzacji i integracji może ograniczać powtarzalność i komplikować porównania międzybadawcze10,11. Jednakże, znormalizowany i biologicznie kierowany przepływ pracy specjalnie zoptymalizowany do analizy dynamiki komórek T CD4⁺ podczas reinfekcji malarycznej jest niedostępny.

Istniejące ramy obliczeniowe do analizy scRNA-seq, w tym Seurat i Scanpy, zapewniają kompleksowe zestawy narzędzi do przetwarzania wstępnego, klasteryzacji i interpretacji danych jednokomórkowych12,13,14. Seurat, implementowany w R, oferuje ściśle zintegrowane przepływy pracy do normalizacji, integracji danych i wizualizacji, w tym podejścia stabilizujące wariancję, takie jak SCTransform, które poprawiają wykrywanie sygnału w heterogenicznych zestawach danych immunologicznych13. Scanpy, implementowany w Pythonie, zapewnia skalowalne rozwiązania zoptymalizowane dla dużych zestawów danych i wydajnego użycia pamięci, co czyni je szczególnie odpowiednimi dla analiz wysoko przepustowości lub opartych na chmurze12,14. Pomimo tych postępów, nadal istnieje potrzeba standaryzowanych, odtwarzalnych przepływów pracy, które wyraźnie zwracają się do pytań biologicznych w ustawieniach infekcyjnych, zachowując przejrzystość, przystosowanie i spójność w całym zestawie danych. Obecny protokół wypełnia tę lukę, łącząc odporność Seurat-based przetwarzania wstępnego z strukturalną interpretacją biologiczną dostosowaną do odpowiedzi komórek T CD4⁺ podczas reinfekcji malarycznej. W porównaniu z istniejącymi ogólnymi przepływami pracy, ten protokół podkreśla odtwarzalność, biologicznie zinforrmowaną selekcję parametrów i spójną analizę między punktami czasowymi dostosowaną do modeli infekcji.

Kluczową cechą tego protokołu jest nacisk na odtwarzalność i praktyczną użyteczność. Progi kontroli jakości nie są stałe, ale są wyprowadzane za pomocą podejść opartych na danych na podstawie mediany bezwzględnego odchylenia, co pozwala na skalowanie progów dla złożoności transkryptu, głębokości sekwencjonowania i zawartości mitochondrialnej w zależności od dystrybucji specyficznych dla zestawu danych. Ta konstrukcja sprawia, że przepływ pracy jest zastosowany w zestawach danych o różnej wielkości, zazwyczaj od kilku tysięcy do kilkudziesięciu tysięcy komórek i w szerokim zakresie głębokości sekwencjonowania powszechnie spotykanych w eksperymentach scRNA-seq opartych na kroplach. Wprowadzenie zawarte w przepływie pracy wspiera odpowiednią selekcję parametrów dla redukcji wymiarowości, rozdzielczości klasteryzacji i integracji, zapewniając, że analizy pozostają zarówno biologicznie znaczące, jak i technicznie solidne. Niemniej jednak, przepływ pracy zależy od jakości danych i głębokości sekwencjonowania i może wymagać dostosowania dla zestawów danych o ekstremalnej rzadkości lub efektach wsadu.

Ten protokół jest zaprojektowany dla użytkowników średnio-zaawansowanych z podstawową znajomością R i analizy jednokomórkowej, pozostając jednocześnie dostępny dla motywowanych początkujących dzięki strukturalnej, krok po kroku implementacji i w pełni odtwarzalnym wyników. Przepływ pracy generuje standaryzowane tabele i figury na każdym etapie, w tym podsumowania kontroli jakości, wyniki klasteryzacji, wyniki różnicowej ekspresji i analizy wzbogacenia, ułatwiając w ten sposób przejrzystość, walidację i ponowne wykorzystanie w kontekście współpracy lub wielobadawczym. Ten protokół jest szczególnie odpowiedni dla badań dotyczących heterogeniczności immuno

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne:

Wszystkie dane wykorzystane w niniejszym badaniu pochodzą z publicznie dostępnych zestawów danych (GSE233703 i GSE233713). Oryginalne badania zgodne były z instytucjonalnymi i etycznymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach. Niniejsze badanie obejmowało wtórne analizy bioinformatyczne publicznie dostępnych i anonimizowanych zestawów danych sekwencji RNA z pojedynczych komórek, uzyskanych z repozytorium Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE233703 i GSE233713). W badaniu nie uczestniczyli żadni nowi uczestnicy, kliniczne próbki lub identyfikowalne informacje o pacjentach. Zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi badań z wykorzystaniem publicznie dostępnych anonimizowanych zestawów danych, dodatkowa zgoda etyczna i zgoda na udział w badaniu nie były wymagane dla tej analizy bioinformatycznej. Oryginalne badania związane z tymi zbiorami danych przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi instytucjonalnymi standardami etycznymi i obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi badań biomedycznych.

1. Reprodukowalny przepływ pracy analizy scRNA-seq komórek T CD4⁺ na podstawie Seurata dla GSE233703 i GSE233713

UWAGA: Ten przepływ pracy jest dostępny jako Dodatek S1. Zobacz także schemat, który przedstawia przegląd całego przepływu pracy (Rysunek 1).

  1. Zdefiniuj zakres i przewidzianych użytkowników przed rozpoczęciem protokołu
  2. Zdefiniuj przewidzianych użytkowników
    1. Zastosuj ten protokół, jeśli użytkownik ma średnio zaawansowaną znajomość języka R i analizy sekwencji RNA z pojedynczych komórek (scRNA-seq).
    2. Zastosuj ten przepływ pracy do zestawów danych komórek T CD4⁺ ze śledzi wygenerowanych w formacie macierzy 10x. Użyj struktury krok po kroku i przewidywanych wyników, aby zweryfikować każdy etap przed kontynuacją.
      UWAGA: Upewnij się, że stosują się odpowiednie praktyki obsługi danych i bezpieczne przechowywanie podczas pracy z dużymi zbiorami danych sekwencjonowania.
  3. Zdefiniuj scRNA-seq
    1. Traktuj sekwencjonowanie RNA z pojedynczych komórek (scRNA-seq) jako metodę transkryptomu²¹, która ilościowo określa ekspresję genów w pojedynczych komórkach.
    2. Zastosuj scRNA-seq do identyfikacji dyskretnych stanów komórkowych, populacji przejściowych i heterogenicznych programów odpornościowych w złożonych tkankach.
  4. Przygotuj wymagania oprogramowania i pakietów
  5. Zainstaluj podstawowe oprogramowanie
    1. Zainstaluj R 4.2 lub nowsze.
    2. Otwórz interfejs RStudio. Ustaw katalog roboczy za pomocą setwd().
    3. Wykonuj skrypty sekwencyjnie za pomocą funkcji source(). Zapisz dokładne wersje R, RStudio i systemu operacyjnego w notatkach projektu.
  6. Zainstaluj pakiety R
    1. Zainstaluj wymagane pakiety CRAN: Seurat, Matrix, tidyverse, patchwork, pheatmap, RColorBrewer, cluster, glmGamPoi i ggplot2.
    2. Zainstaluj wymagane pakiety Bioconductor: clusterProfiler, org.Mm.eg.db, enrichplot i DESeq2.
    3. Zainstaluj opcjonalne pakiety tylko wtedy, gdy są potrzebne: DoubletFinder do usuwania podwójnych i monocle3 do analizy trajektorii. Załaduj wszystkie wymagane pakiety na początku sesji analizy.
  7. Zapisz wersje
    1. Zapisz informacje o pakiecie i sesji na końcu przepływu pracy za pomocą sessionInfo() lub równoważnej funkcji.
    2. Wyraźnie zgłoś kluczowe komponenty analizy w manuskrypcie, w tym wersję R, wersję Seurat, wersję DESeq2 i wersję clusterProfiler.
  8. Uruchom przykładowe polecenia instalacyjne wymienione w Dodatku 2
  9. Potwierdź wymagania sprzętowe i pamięci masowej
  10. Potwierdź minimalne zasoby
    1. Użyj stacji roboczej z co najmniej 16 GB pamięci RAM, 4 rdzeniami CPU i 20 GB wolnej przestrzeni na dysku do rutynowej analizy zestawów danych zawierających kilka tysięcy do kilkudziesięciu tysięcy komórek.
  11. Potwierdź zalecane zasoby
    1. Użyj 32 GB pamięci RAM lub więcej dla zintegrowanych analiz, powtarzanego rysowania lub opcjonalnego wykrywania podwójnych.
    2. Zwiększ future.globals.maxSize, jeśli duże obiekty lub zintegrowane zestawy danych powodują błędy związane z pamięcią.
    3. Zastosuj przykładowe ustawienia pamięci
  12. Uruchom następujące polecenia, aby ustawić opcje pamięci wymienione w Dodatku 2

2. Utwórz strukturę projektu

  1. Utwórz główny katalog projektu
    1. Utwórz katalog projektu na potrzeby analizy.
    2. Utwórz podkatalogi o nazwach data/, scripts/ i results_spleen_cd4/.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jakość sekwencjonowania i kontrola jakości na poziomie komórkowym (Antygenowo-specyficzne (reaktywne na PcAS) transgeniczne dla TCR komórki T CD4⁺ (GSE233703))

Rozkłady kontroli jakości przed filtrowaniem (Rysunek 2A) wykazały heterogeniczną złożoność transkryptomów, przy czym większość komórek charakteryzowała się umiarkowaną liczbą genów i zliczeń UMI, a mniejsza podgrupa wykazywała profile z wysokimi wartościami odstającymi, co było zgodne z po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie przedstawia znormalizowany i możliwy do powtórzenia przepływ prac Seurat do analizy dynamiki transkrypcyjnej komórek CD4⁺ T podczas reinfekcji malarią. Protokół integruje adaptacyjną kontrolę jakości, normalizację, redukcję wymiarowości, grupowanie, integrację zestawów danych, walidację markerów, wynikowanie modułów oraz analizę różnicowej ekspresji w jednolitym środowisku obliczeniowym. Wszystkie te kroki analityczne umożliwiły powtarzalne identyfikowanie i interpretację biologicznie znaczących stanów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa materiału / sprzętuFirma / ŹródłoNumer katalogowyKomentarze / Opis
Macierze zliczeń sformatowane przez 10x Genomics–NCBI GEON/APliki w formacie Matrix Market (matrix.mtx, features.tsv, barcodes.tsv)
clusterProfiler (pakiet R)BioconductorN/ARRID:SCR_016884; Analiza wzbogacania funkcjonalnego (GO, KEGG)
enrichplot (pakiet R)BioconductorN/ARRID:SCR_017030; Wizualizacja wyników analizy wzbogacania
Zestaw danych GEO GSE233703NCBI Gene Expression OmnibusGSE233703ScRNA-seq zestaw danych komórek T CD4+ przekształconych przez TCR specyficzne dla PcAS
Zestaw danych GEO GSE233713NCBI Gene Expression OmnibusGSE233713ScRNA-seq zestaw danych poliklonalnych komórek T CD4+ (D273 vs D30)
GitHub (opcjonalnie)GitHub Inc.N/ARRID:SCR_002630; Kontroli wersji i odtwarzalności (opcjonalnie)
glmGamPoi (pakiet R)BioconductorN/ARRID:SCR_021001; Przyspieszone dopasowywanie modelu SCTransform
Matrix (pakiet R)CRANN/ARRID:SCR_008389; Obsługa macierzy rzadkich dla danych scRNA-seq
System operacyjnyMicrosoft / Apple / LinuxN/AObsługiwane są Windows 10+, macOS lub Linux
org.Mm.eg.db (pakiet R)BioconductorN/ARRID:SCR_002643; Baza danych dotycząca adnotacji genów myszy
patchwork (pakiet R)CRANN/ARRID:SCR_018787; Montaż wielopanelowych figur
Odtwarzacz PDFDowolnyN/AOdtwarzanie wykresów QC, UMAP i heatmap
Komputer osobisty lub stacja roboczaDowolnyN/AZalecana minimalna pamięć RAM 16–32 GB dla integracji
pheatmap (pakiet R)CRANN/ARRID:SCR_016418; Wizualizacja heatmap ekspresji genów
Oprogramowanie statystyczne R (wersja ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingN/ARRID:SCR_001905; Środowisko obliczeniowe rdzeniowe
RStudio DesktopPosit SoftwareN/ARRID:SCR_000432; Zintegrowane środowisko programistyczne dla R
Seurat (pakiet R, v4 lub nowszy)Satija LabN/ARRID:SCR_016341; Analiza scRNA-seq
tidyverse (zestaw pakietów R)CRANN/ARRID:SCR_019186; Manipulacja danymi i wizualizacja

Bibliografia

  1. World Health Organization. WHO malaria policy advisory group (MPAG) meeting report, 18–20 April 2023. Geneva: World Health Organization; 2023.
  2. Stevenson MM, Riley EM. Innate immunity to malaria. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):169-80.
  3. Langhorne J, Ndungu FM, Sponaas AM, Marsh K. Immunity to malaria: more questions than answers. Nat Immunol. 2008;9(7):725-32.
  4. Perez-Mazliah D, Langhorne J. CD4 T-cell subsets in malaria: TH1/TH2 revisited. Front Immunol. 2015;5:671.
  5. Illingworth J, et al. Chronic exposure to Plasmodium falciparum is associated with phenotypic evidence of B and T cell exhaustion. J Immunol. 2013;190(3):1038-47.
  6. Tang F, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6(5):377-82.
  7. Lönnberg T, et al. Single-cell RNA-seq and computational analysis using temporal mixture modeling resolves TH1/TFH fate bifurcation in malaria. Sci Immunol. 2017;2(9):eaal2192.
  8. Butler NS, et al. Therapeutic blockade of PD-L1 and LAG-3 rapidly clears established blood-stage Plasmodium infection. Nat Immunol. 2012;13(2):188-95.
  9. Soon MS, Haque A. Recent insights into CD4+ Th cell differentiation in malaria. J Immunol. 2018;200(6):1965-75.
  10. Slovin S, et al. Single-cell RNA sequencing analysis: a step-by-step overview. RNA Bioinformatics. 2021:343-65.
  11. Vieth B, Parekh S, Ziegenhain C, Enard W, Hellmann I. A systematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines. Nat Commun. 2019;10(1):4667.
  12. Wolf FA, Angerer P, Theis FJ. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 2018;19(1):15.
  13. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019;20(1):296.
  14. Stuart T, et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 2019;177(7):1888-902.
  15. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 2015;33(5):495-502.
  16. Crotty S. T follicular helper cell differentiation, function, and roles in disease. Immunity. 2014;41(4):529-42.
  17. Wherry EJ, Kurachi M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 2015;15(8):486-99.
  18. Belkaid Y, Rouse BT. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat Immunol. 2005;6(4):353-60.
  19. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
  20. Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
  21. Gulati GS, et al. Profiling cell identity and tissue architecture with single-cell and spatial transcriptomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26(1):11-31.
  22. Schofield L, Grau GE. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 2005;5(9):722-35.
  23. Plebanski M, Hill AV. The immunology of malaria infection. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):437-41.
  24. Crotty S. T follicular helper cell biology: a decade of discovery and diseases. Immunity. 2019;50(5):1132-48.
  25. Vinuesa CG, Linterman MA, Yu D, MacLennan IC. Follicular helper T cells. Annu Rev Immunol. 2016;34:335-68.
  26. Wherry EJ. T cell exhaustion. Nat Immunol. 2011;12(6):492-9.
  27. Maizels RM, Smith KA. Regulatory T cells in infection. Adv Immunol. 2011;112:73-136.
  28. Choudhary S, Satija R. Comparison and evaluation of statistical error models for scRNA-seq. Genome Biol. 2022;23(1):27.
  29. Li M, et al. Rediscovering publicly available single-cell data with the DISCO platform. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D932-8.
  30. Islam MT, Xing L. Cartography of genomic interactions enables deep analysis of single-cell expression data. Nat Commun. 2023;14(1):679.
  31. Luecken MD, Theis FJ. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 2019;15(6):e8746.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunologia i ZakażeniaNumer 233Numer 233Wartość pustaNumerscRNA-seqPBMCIntegracja transkryptomicznaPunktacja modułów odpornościowych

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.