Model myszy do selektywnego przecięcia nerwów autonomicznych jelit

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu umożliwienie precyzyjnego, selektywnego przecięcia nerwów współczulnych i przywspółczulnych unerwiających jelito u myszy, przy użyciu górnej tętnicy krezki jako stałego punktu orientacyjnego anatomicznego, zapewniając skoncentrowany i możliwy do powtórzenia model do badania autonomicznej regulacji fizjologii i chorób jelit.

Streszczenie

Nerwy autonomiczne obejmują układy współczulny i przywspółczulny, które działają w dużej mierze antagonistycznie, aby regulować różnorodne funkcje fizjologiczne. Wraz ze zwiększającym się zainteresowaniem rolami unerwienia autonomicznego w fizjologii i patologii jelit, rośnie potrzeba modeli eksperymentalnych, które umożliwiają precyzyjne manipulowanie unerwieniem współczulnym i przywspółczulnym skierowanym na jelita. Przedstawiamy tutaj protokół chirurgiczny do selektywnego przecięcia współczulnych i przywspółczulnych nerwów unerwiających jelito. Wykorzystując tętnicę krezową górną (SMA) jako odtwarzalny punkt anatomiczny, podejście to umożliwia niezawodne zidentyfikowanie pęczków nerwów autonomicznych jelita i następujące po sobie przecięcie. W przeciwieństwie do szerszych podejść do obwodzenia, takich jak ganglioektomia czy przecięcie nerwu błędnego pod przeponą, podejście to ma na celu osiągnięcie bardziej anatomicznie zlokalizowanego przecięcia pęczków autonomicznych skierowanych na jelita, co może pomóc zmniejszyć ingerencję pozajelitową. Obrażenie jest kontrolowane i zwykle wiąże się z minimalnym krwawieniem, co wspiera konsekwencję procedury i powrót do zdrowia po zabiegu. Chociaż operacja wymaga odpowiedniego szkolenia z zakresu mikrochirurgii, protokół jest elastyczny, umożliwiając użytkownikom dostosowanie kluczowych parametrów do określonych celów eksperymentalnych. Co ważne, model ten zapewnia praktyczną platformę do badania ról nerwów współczulnych i przywspółczulnych w regulacji funkcji jelitowych zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i chorobowych. Celem niniejszego artykułu jest szczegółowe opisanie procedury w celu ułatwienia jej przyjęcia przez nowych użytkowników w ich badaniach.

Wprowadzenie

Układ pokarmowy jest pod ciągłą kontrolą autonomicznego układu nerwowego (AUN), przy czym ścieżki współczulne i przywspółczulne koordynują podstawowe aspekty fizjologii jelit, w tym motorykę, sekrecję, funkcję bariery nabłonkowej i homeostazę immunologiczną^1,2. W okrężnicy zewnętrzne współczulne impulsy mogą wywierać działanie zależne od regionu na wielu zespołach komórkowych, co podkreśla, że szerokie zaburzenia AUN mogą zacierać fenotypowe cechy jelitne specyficzne dla danego miejsca¹. Z kolei obwody przywspółczulne, klasycznie pośredniczone przez przewód błędny i mechanizmy cholinergiczne w dół szlaku, są coraz częściej rozpoznawane jako integralne dla utrzymania równowagi immunologicznej jelit i kształtowania reakcji śluzówki, co motywuje dalsze strategie eksperymentalne, które mogą rozdzielić wkład współczulny i przywspółczulny z precyzją anatomiczną².

Poza regulacją fizjologiczną, aktywność autonomiczna stała się istotnym modyfikatorem biologii chorób jelit, w tym raka jelita grubego (RJG). Ostatnie prace nad RJG wykazują dwukierunkowy program współczulny nerw-mezenchima, w którym działanie sygnałowe receptorów α2-adrenergicznych i fibroblastów związanych z rakiem ekspresujących NGF wzmacnia interakcje nerwowo-stromalne i promuje progresję nowotworową, dostarczając bezpośrednich dowodów, że obwody współczulne mogą być funkcjonalnie sprzężone z patogenezą RJG³. Równocześnie działanie cholinergiczne zostało powiązane z wzrostem RJG i cechami immunologicznymi związanymi z guzem, jak wykazano przez farmakologiczne hamowanie receptora muskarynowego 3 w ortotopowym modelu myszym i przez połączenie działania cholinergicznego z ekspresją punktów kontrolnych odpowiedzi immunologicznej i innymi cechami złośliwego charakteru^4,5. Co ważne, wpływy autonomiczne na choroby jelitowe mogą również stykać się z innymi modyfikatorami, takimi jak stres psychiczny i mikrobiota jelitowa. Układ nerwowy jelitowy może przekazywać sygnały stresu do stanu zapalnego jelit⁶, a sygnały mikrobiomu mogą angażować obwody jelitowo-mózgowe, które dostrajają zewnętrzne neurony współczulne jelit, wspierając w ten sposób wieloczynnikowy rama, w której regulacja nerwowa krzyżuje się z ekologią immunologiczną i mikrobiologiczną^6,7.

Te zbieżne linie dowodów podkreślają potrzebę podejść eksperymentalnych, które mogą izolować efekty autonomiczne skierowane na jelita z wystarczającą precyzją anatomiczną, aby wspierać wnioski przyczynowe zarówno w ustawieniach fizjologicznych, jak i patologicznych. Mimo szybkiego postępu w mapowaniu obwodów i neuromodulacji, wiele powszechnie stosowanych interwencji nadal jest ograniczone w swojej specyficzności dla narządów. Ogólnoustrojowa manipulacja farmakologiczna, chemiczna sympathectomia i przecięcie włókien błędnych poniżej przepony mogą wpływać na szerokie efekty autonomiczne i tym samym zmieniać punkty ustawienia immunologicznego i metabolicznego poza jelitami, komplikując przypisywanie przyczynowe do specyficznych dla okrężnicy wejść nerwowych⁸. Na przykład obwody błędne mogą hamować produkcję cytokin zapalnych⁹, a stymulacja błędnych nerwów może modulować funkcję trzustki i dynamikę komórek β, co ilustruje, że interwencje górstrumieniem lub niewybiórcze mogą wprowadzić efekty pozajelitowe, które komplikują interpretację fenotypu jelitnego¹⁰. Te ograniczenia są szczególnie istotne dla badań mających na celu izolację ograniczonych do okrężnicy mechanizmów autonomicznych w fizjologii i patologii. Dlatego ogólnym celem metody jest umożliwienie anatomicznie kierowanego, selektywnego przecięcia włókien współczulnych i przywspółczulnych skierowanych na jelita u myszy, zapewniając praktyczny model do badania autonomicznej regulacji jelit z zmniejszonym wpływem poza docelowym obszarem.

Podsumowując, niniejszy protokół opisuje dokładniejsze podejście do autonomicznej denerwacji jelit u myszy z minimalnymi zakłóceniami w unerwieniu autonomicznym innych narządów brzusznych, zwiększając interpretowalność poprzez zmniejszenie potencjalnego skręcenia efektów narządów pozajelitowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) z Przyjaźni Szpitala w Pekinie, Capital Medical University (NR. 24-2026). W badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6J typu dzikiego (w wieku 8–10 tygodni, 20–30 g). Szczegółowe informacje na temat reagentów i sprzętu są podane w Tabeli Materiałów.

Kryteria dołączenia: Do każdego eksperymentu używano myszy tej samej rasy, płci i zakresu wiekowego, aby zminimalizować zmienność biologiczną. Dołączono tylko zdrowe zwierzęta, które wykazywały normalną aktywność, zachowania pielęgnacyjne, przyjmowanie pokarmu i wody oraz wydalanie kału w okresie aklimatyzacji. Ponadto myszy były przyzwyczajone do obiektu hodowlanego przez co najmniej 7 dni przed operacją.

Kryteria wykluczenia: Myszy były wykluczone w przypadkach niekontrolowanego krwawienia lub poważnej kontuzji naczyń krwionośnych podczas operacji, perforacji jelit, lub znaczącego uszkodzenia tkanek niekompatybilnego z przetrwaniem. Zwierzęta, które nie powróciły do przytomności po znieczuleniu, zdefiniowane jako brak zdolności do samodzielnego przemieszczania się w ciągu 2 godzin po operacji, również zostały wykluczone. Dodatkowe kryteria wykluczenia obejmowały powikłania pooperacyjne, takie jak uporczywe otwarcie rany, poważna infekcja lub utrata masy ciała przekraczająca 15% w ciągu 48 godzin lub 20% w ciągu dowolnego okresu 72 godzin. Myszy z chirurgicznym błędem identyfikacji gałęzi nerwowej, potwierdzonym przez oceny histologiczne po operacji, również zostały wykluczone z badania.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Wysterylizuj wszystkie instrumenty chirurgiczne.
2. Podaj wszystkim myszom zapobiegawczą analgezję 30 min przed operacją, aby uniknąć uczulenia na ból. Podaj meloxicam (5 mg/kg masy ciała) poprzez podwęzłowe wstrzyknięcie.
3. Podgrzej poduszkę grzewczą do 37 °C i umieść ją pod platformą chirurgiczną.
4. Spryskaj obszar operacyjny (w tym komorę indukcji znieczulenia) 75% etanolem i dokładnie wytrzyj ręcznikami papierowymi. Umieść wystarczającą liczbę ręczników papierowych na dnie komory indukcji.
5. Sprawdź komorę indukcji znieczulenia i przewody, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Uzupełnij i upewnij się, że masz wystarczającą ilość izofluanu. Wywołaj znieczulenie 3%–3,5% izofluanu dostarczanym w tlenie 1 L/min. Monitoruj mysz ciągle; poziom chirurgiczny osiąga się zazwyczaj w ciągu 1–2 min.
6. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach ze wszystkimi kończynami w pełni rozprostowanymi i zabezpiecz za pomocą hipoalergicznej taśmy. Przymocuj i zabezpiecz kołnierz nosowy. Zmniejsz ilość izofluanu do 1,5%–2,5% na utrzymanie. Oceń głębokość znieczulenia na podstawie braku odbicia stopy (brak reakcji na szczypnięcie palca) i regularnego oddechu (55–65 oddechów/min).
   UWAGA: Podczas długotrwałych procedur mikrochirurgicznych głębokość znieczulenia jest ciągle monitorowana poza początkowym poziomem chirurgicznym. Oprócz oceny odruchu odbicia stopy i częstości oddechów co 5–10 min, monitorujemy także wzorzec oddechu (np. regularność i głębokość) oraz częstotliwość akcji serca poprzez obserwację wzrokową lub kontakt z ścianą klatki piersiowej. Okresowo sprawdzamy kolor błon śluzowych (ocenianych na łapach lub wargach), aby upewnić się, że utlenowanie jest wystarczające. Jeśli mysz wykazuje jakiekolwiek oznaki zmniejszenia głębokości znieczulenia, takie jak zwiększona częstość oddechów (>80 oddechów/min), spontaniczne ruchy lub powrót odbicia stopy, zwiększa się stężenie izofluanu o 0,25%–0,5%, aż do przywrócenia odpowiedniego poziomu chirurgicznego. Odwrotnie, jeśli oddech staje się płytki lub nieregularny lub jeśli częstość akcji serca znacząco spada, zmniejsza się stężenie izofluanu o 0,25%–0,5%, aż do przywrócenia stabilnej czynności układu krążenia i oddechowego. Ta dynamiczna korekta zapewnia, że mysz pozostaje na odpowiednim poziomie znieczulenia przez cały zabieg, minimalizując jednocześnie depresję układu krążenia i oddechowego.
7. Nanieś maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysychaniu i uszkodzeniu rogówki podczas znieczulenia.
8. Ogol grzywkę brzuszną od poziomu łączenia łonowego do obszaru poniżej krawędzi żebrowej za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Następnie przesuń platformę chirurgiczną pod stereomikroskop.
9. Dezynfekuj miejsce operacyjne za pomocą wacików z powidem jodowym w zewnętrznym, koncentrycznym wzorze (od środka do obwodu), pokrywając obszar od dołu mieczyka do łączenia łonowego i bocznie do obu boków. Powtórz 3 razy. Następnie wytrzyj 70% etanolem w ten sam sposób. Upewnij się, że pole jest wolne od włosów.
10. Załóż maskę chirurgiczną i jednorazową czapę, założ maskę chirurgiczną i założ rękawice sterylne.</

Wyniki

Używając tętnicy krezkowej górnej jako stałego punktu orientacyjnego anatomicznego, wiązki nerwów autonomicznych jelit mogą być zidentyfikowane jako cienkie, perłowobiałe struktury biegnące równolegle do naczynia. Na podstawie ich położenia anatomicznego względem tętnicy krezkowej górnej, górny wiązek został wskazany jako domniemany wiązek przywspółczulny, a dolny jako domniemany wiązek współczulny (Rysunek 1A,D). Pozytywny wynik operacyjny osiąga się, gdy docelowy wiązek je...

Dyskusja

Ucho krętcze u myszy wychodzi od przedniej ściany tętnicy brzusznej, poniżej pnia szyjnego trzewi, i dostarcza krwi do głównych narządów jamy brzusznej, w tym do jelit¹⁴. Przed UCB znajdują się jelito grube i jego otrzewna, podczas gdy z tyłu jest ono ściśle związane z lewą żyłą nerki i tętnicą brzuszną; żyła śledzionowa biegnie zwykle po prawej stronie UCB. U myszy UCB jest niezwykle delikatne i jest otoczone krytycznymi narządami i głównymi naczyniami. Co ważne, podobnie delikatne włókna współcz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-0 silk braided non-absorbable suture	Ethicon	W500
6-0 PGA Suture	Jinhuan	CR631
Anesthesia Induction Chambers	RWD Life Science	V100
Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500IP
Anti-Choline Acetyltransferase antibody	Abcam	ab181023
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Cholera Toxin Subunit B (CTB), Alexa FluorTM 555 Conjugate	Thermo Scientific	C34776
Compound Microscope	Yuyan Instruments	512
DAPI and Hoechst Nucleic Acid Stains	Invitrogen	D3571
Fast Green	Thermo Scientific	F7252
Fine Hemostatic Forceps	Jinzhong surgical instrument	JCG020
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Micro Forceps(Curved)	Jinzhong surgical instrument	WCC200
Micro Forceps(Straight)	Jinzhong surgical instrument	WCC190
Micro Needle holders	Jinzhong surgical instrument	WBA050
Micro scissors	Jinzhong surgical instrument	Y3F010
Micro syringe	Hamilton	7632-01
Ophthalmic Scissors(pointed tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Ophthalmic Scissors(rounded tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Povidone-Iodine Swabstick	Winner Medical	206
Tissue and Cell Fixative (4% Paraformaldehyde, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Tissue OCT-Freeze Medium	Sakura	C2077
Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	58844S