Uniwersalne urządzenie obciążające ciśnieniem do obrazowania komórek żywych pod długotrwałym obciążeniem fizjologicznym mechanicznym

Summary

Opisane tutaj urządzenie obciążające ciśnieniem umożliwia obrazowanie optyczne poklatkowe hodowanych komórek i jest kompatybilne ze standardowymi naczyniami hodowlanymi komórek oraz mikroskopami odwróconymi. Dzięki zastosowaniu tego urządzenia mikrośrodowisko ciśnienia hydrostatycznego guza potwierdza zwiększenie transdukcji sygnału wapnia, zapewniając realną platformę do badania mechanicznej transdukcji sygnału w mikrośrodowisku nowotworowym.

Abstract

Protokół ten opisuje urządzenie do obciążania hydrostatycznego ciśnieniowo, które umożliwia mikroskopową obserwację przylegających komórek w czasie rzeczywistym podczas długotrwałej stymulacji hydrostatycznej i jest kompatybilne z komercyjnymi talerzami hodowli komórek o średnicy 3,5 cm. Aparat składa się z hermetycznej komory hodowli wykonanej z aluminiowej podstawy, optycznie przezroczystej pokrywy poli(metakrylanu metylowego), portów wlotowych/wylotowych gazu zintegrowanych w pokrywie oraz zamkniętego okna obserwacyjnego. Podłączając się do regulowanego źródła gazu, urządzenie utrzymuje stabilne ciśnienie hydrostatyczne (0–200 kPa, regulowane), jednocześnie umożliwiając ciągłe obrazowanie fazowe lub fluorescencyjne. Dzięki temu urządzeniu obciążającemu ciśnieniem można rejestrować wpływy zależne od dawki na fenotyp i zachowania komórek, takie jak morfologia, proliferacja i migracja. Ponadto sygnały fluorescencyjne mogą być również rejestrowane w czasie rzeczywistym. Tutaj obserwowano i ilościowo zidentyfikowano heterogeniczność i dynamikę sygnalizacji Ca^2⁺ wywołanej ciśnieniem w komórkach raka piersi MDA-MB-231 oraz komórkach HeLa szyjki macicy za pomocą mikroskopii odwróconej fluorescencji z użyciem obrazowania poklatkowego. Platforma ta integruje mechaniczne ładowanie z obrazowaniem żywych komórek, aby przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych systemów końcowych, zapewniając uniwersalne narzędzie do badań mechanobiologicznych.

Introduction

Wiele komórek, tkanek i narządów doświadcza długotrwałych lub przerywanych sił uciskowych w ramach swojej fizjologii¹. Na przykład komórki pęcherzyka są poddawane cyklicznemu sprężeniu podczas oddychania², podczas gdy komórki nabłonka pęcherza podlegają mechanicznym obciążeniom podczas zatrzymania moczu³. W patologicznych kontekstach, takich jak guzy lite, komórki nowotworowe są nieustannie narażone na siły ściskające pochodzące z izolacji przestrzennej i podwyższonego ciśnienia płynu śródmiąższowego⁴. Podobnie w innych chorobach, takich jak zwyrodnienie łąkotki i włóknienie płuc, komórki łąkotki⁵ i nabłonka pęcherzyka pęcherzyka⁶ również podlegają długotrwałym naprężeniom mechanicznym spowodowanym ciśnieniem wynikającym ze sztywności i sztywności macierzy.

Coraz więcej dowodów potwierdza, że ciśnienie mechaniczne pełni rolę silnego regulatora fenotypu i zachowania komórek ^7,8. W komórkach niezłośliwych naprężenie ściskające zwiększa proliferację komórek macierzystych przyzębia i indukuje zespolenie osteoklastu poprzez inwazyjne wypustki⁹. Natomiast w modelach nowotworowych kompresja wykazuje efekty Janusa: hamuje proliferację i migrację komórek czerniaka, jednocześnie aktywując transkryptomiczną reprogramację, która sprzyja chemiooporności^10,11. Ponadto kompresja objętościowa spowodowana ciśnieniem hiperosmotycznym może indukować stłoczenie wewnątrzkomórkowe i stymulować redystrybucję stężenia białek oraz siły jonowej poprzez separację faz ciecz-ciecz (LLPS), co głęboko zmienia zachowania i losy komórek. To fizyczne zaburzenie zwiększa rozszerzanie organoidów jelitowych poprzez aktywowane sygnalizowanie Wnt/β-kateniny oraz zwiększoną samoodnowę komórek macierzystych jelit.¹². Ponadto w jądrze komórkowym LLPS wywołane zmianami objętości uczestniczy w kontroli transkrypcji genów poprzez koordynację inicjacji, wydłużenia i zakończenia transkrypcji ^13,14.

Aby ilościowo zbadać te biologiczne efekty wywołane ciśnieniem, niezbędne są systemy eksperymentalne zdolne do stosowania dobrze określonych i jednorodnych bodźców kompresyjnych. W przypadku komórek hodowanych in vitro, które otoczone jest ośrodkiem wodnym, ciśnienie hydrostatyczne jest podstawowym i fizjologicznie istotnym środkiem stosowania takich sił ściskania, co zostało szeroko przyjęte do badania mechanotransdukcji komórkowej¹⁵. Ciśnienie hydrostatyczne może zwiększyć aktywność fosfatazy alkalicznej i przyspieszyć osteogenezę ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu mezenchymalnych bez uzupełniania czynników osteoindukcyjnych¹⁶. W niealkoholowej stłuszczeniowej chorobie wątroby siły mechaniczne, takie jak ciśnienie hydrostatyczne, mogą przyczyniać się do nadciśnienia wrotnego bez istotnego zwłóknienia, co podkreśla jego rolę w różnorodności tkanek¹⁷. Chociaż ciśnienie hydrostatyczne odgrywa ważną rolę w regulacji patofizjologicznej, badania mechanistyczne ciśnienia hydrostatycznego napotykają na istotne ograniczenie: konwencjonalne komory ciśnieniowe uniemożliwiają obserwację żywych komórek w czasie rzeczywistym podczas stymulacji. Większość systemów eksperymentalnych pozwala jedynie na analizę punktów końcowych, maskując dynamikę przestrzenną i czasową zdarzeń mechanotransdukcji, takich jak mechanoaktywacja Piezo1, heterogeniczność strumienia Ca²⁺ oraz reorganizacja cytoszkieletu. Ta luka ograniczała zrozumienie, jak ciśnienie hydrostatyczne wpływa na różnorodność fenotypów w guzach lub innych tkankach.

Aby wypełnić tę lukę technologiczną, opracowano nowatorską platformę eksperymentalną, która umożliwia w czasie rzeczywistym obserwację odpowiedzi komórkowych na precyzyjnie kontrolowane ciśnienie hydrostatyczne za pomocą obrazowania optycznego. System ten integruje trzy kluczowe funkcje: (1) stosowanie utrzymującego się ciśnienia hydrostatycznego w zakresie od 0 do 100 kPa za pomocą regulowanego regulatora ciśnienia gazu (manometr ma zakres od 0 do 200 kPa, a przyłożone ciśnienie można dobierać na podstawie parametrów fizjologicznych. Na przykład, na podstawie zgłaszanych naprężeń ściskających różnych typów komórek: 8-16 kPa dla ludzkich komórek stromalnych szpiku^{kostnego 18}, 12–24 kPa dla komórek mięśni gładkich naczyń^{naczyniowych 19} oraz 0–15 kPa dla nabłonka nabłonka mleczowego u człowieka²⁰.); (2) ciągłe obrazowanie w komórkach żywych o wysokiej rozdzielczości czasowej podczas stosowania ciśnienia hydrostatycznego; oraz (3) utrzymanie warunków fizjologicznych hodowli podczas długotrwałych eksperymentów. Takie podejście pozwala na bezpośrednią wizualizację procesów dynamicznych, w tym rekrutacji i aktywacji kanałów Piezo1, fal sygnalizacyjnych wapnia oraz remodelacji cytoszkieletu, które zachodzą w odpowiedzi na stymulację mechaniczną. Ponadto urządzenie to jest kompatybilne z większością komercyjnie dostępnych miszek hodowlanych i mikroskopami odwróconymi, co czyni je bardzo wygodnym w użyciu w laboratoriach. Możliwość monitorowania tych wewnątrzkomórkowych zjawisk biochemicznych w czasie rzeczywistym dostarcza bezprecedensowych informacji o tym, jak komórki odczuwają i adaptują się do ciśnienia hydrostatycznego. Poprzez uchwycenie temporalnej sekwencji zdarzeń mechanotransdukcji, które obejmują początkowe wykrywanie siły, sygnalizację w dalszej części oraz zmiany fenotypowe, platforma ta stanowi potężne narzędzie do badania podstawowych mechanizmów, dzięki którym ciśnienie hydrostatyczne wpływa na zachowanie komórek w kontekstach fizjologicznych i patologicznych.

Protocol

1. Materiały

1. Specyfikacje urządzeń (patrz Rysunek 1)
   1. Przygotuj komponenty zgodnie z poniższymi specyfikacjami:
      Podstawa: aluminium (Ø 56 mm, wysokość 15 mm), centralne okno Ø 40 mm.
      Pokrywa: PMMA (Ø 56 mm) z: 6 otworami gwintowanymi × M3, portem gazowym Luer-lock, silikonową uszczelką (średnica wewnętrzna 25 mm, średnica zewnętrzna 32 mm, grubość 0,8 mm)
      Regulator ciśnienia: (zakres 0–200 kPa)
2. Komórki i odczynniki
   1. W tym badaniu wykorzystaj komórki MDA-MB-231 i HeLa. Użyj podłoża L-15, medium RPMI 1640, surowicy noworodka (NCS), 1% roztworu antymykotycznego oraz sondy obrazowania wapnia do hodowli komórek i znakowania Ca²⁺.

2. Przygotowanie urządzenia

1. Produkcja
   1. Projektowanie na zamówienie to kluczowy element tego badania. Precyzyjnie obrabiaj aluminiową podstawę i obudowę PMMA zgodnie ze specyfikacją (patrz Rysunek 1 i Dodatkowy Rysunek 1).
   2. Przetnij silikonową uszczelkę i przetworz ją do wymaganego rozmiaru.
      UWAGA: Przepuszczalność optyczna materiału PMMA jest wystarczająca do standardowego obrazowania światła przepuszczającego. Wszystkie składniki były sterylizowane i biokompatybilne do kolejnych eksperymentów hodowli komórkowych. Nie nakłada się żadnych specjalnych wymagań dotyczących tolerancji produkcyjnych tej komory (w tym badaniu przyjęto tolerancję ±0,1 mm).
2. Sterylizacja
   1. Aby wysterylizować bazę (aluminium), poddaj ją autoklawowi w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
   2. Aby wysterylizować pokrywę (PMMA), przetrzyj ją 75% etanolem, a następnie sterylizuj UV przez 30 minut.
   3. Sterylizuj silikonową uszczelkę przez autoklawowanie w 121 °C przez 20 minut.

3. Przetwarzanie komórek

1. Hodowla komórkowa
   1. Komórki nasion w naczyniach o średnicy 35 mm z konfluencją 30%–70%. Hodować komórki przez 24 godziny w podłożu RPMI-1640 lub L15 (uzupełnionym 10% NCS) w inkubatorze_CO2 w temperaturze 37 °C z 5% CO₂.
   2. W przypadku przekazywania komórek należy rozdzielić je 0,25% trypsyną i zakończyć trawienie za pomocą pełnego nośnika. Wykorzystaj komórki do ponownego zasiewania, gdy osiągną 70%–80% zbiegu.
2. Barwienie Ca²⁺
   1. Usuń podłoże, a następnie dwukrotnie przemyj komórki podgrzanym roztworzeniem Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) w szafce na zabezpieczenia biologicznego.
   2. Barwi międzykomórkowy Ca²⁺ sondą wapnia o stężeniu 5 μM w medium wolnym od surowicy. Inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w środowisku chronionym przed światłem.
   3. Usuń barwnik, umyj komórki trzy razy HBSS, a następnie odesterifikuj przez 30 minut w medium bezsurowicowym.

4. Montaż urządzeń (Rysunek 2)

1. Przenieś miskę hodowlę do centralnego okna komory ciśnieniowej, a następnie usuń podłoże hodowlane.
2. Włóż sterylną uszczelkę do misy do hodowli.
3. Wyrównaj pokrywę z uszczelką naczynia.
4. Dokręć śruby po przekątnej, najpierw dokręcając je ręcznie, aż poczujesz opór, a następnie dodaj dodatkowe 1,5 obrotu za pomocą śrubokręta sterowanego momentem obrotowym.
5. Podłącz silikonową rurkę gazową do portu Luer-lock i wstrzykni mieszany gaz do urządzenia, aby sprawdzić wycieki.
6. Odłącz silikonową rurkę gazową i wstrzyknij świeże medium do talerza hodowlanego przez port Luer-lock za pomocą 5 mL sterylnej strzykawki.

5. Obciążenie ciśnieniowe i obrazowanie

1. Podłącz silikonową rurkę gazową (średnica wewnętrzna 4 mm) z portu Luer-lock na silikonowej uszczelce z cyfrowym manometrem i zbiornikiem paliwa.
2. Zamontuj złożone urządzenie na scenie mikroskopu.
3. Skalibruj ciśnienie.
   1. Zweryfikować stabilność zakresu 0–200 kPa za pomocą manometru.
      UWAGA: Do hodowli komórek HeLa stosuje się mieszankę gazu zawierającą 75% azotu, 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Do hodowli komórek MDA-MB-231 stosuje się mieszankę gazów zawierającą 80% azotu i 20% tlenu. Rodzaj gazu użytego w eksperymencie obciążenia ciśnieniowym można zastąpić w zależności od typu ogniwa, typu medium lub specyficznych wymagań eksperymentalnych. Żaden element nie jest specyficzny dla modelu, a wymiary modułu detekcji ciśnienia i jego rury wlotowej można wybrać w zależności od potrzeb.
4. Ustaw docelowe ciśnienie (np. 100 kPa) za pomocą cyfrowego regulatora ciśnienia.
5. Rozpocznij obrazowanie po osiągnięciu ciśnienia docelowego.
6. Obrazowanie
   1. Reguluj stopień, potwierdź obszar obrazowania i upewnij się, że komórki są ostre.
   2. Wykonanie obrazów fluorescencyjnych komórek barwionych za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20×, z następującymi parametrami: czas naświetlania 400 ms, 5 s interwały poklatkowe oraz całkowity czas obrazowania 10 min (filtr FITC: Ex/Em = 490/525 nm, cutoff = 515 nm).
   3. Obraz w warunkach nieciśnieniowych przez 10 minut, aby zapewnić prawidłową pracę systemu i uzyskać dane sygnału bazowego.
   4. Po otwarciu zaworu gazowego, aby załadować ciśnienie, ponownie wyreguluj wysokość stopnia, aby upewnić się, że ogniwa są ostre, a następnie rozpocznij obrazowanie dynamicznych sygnałów wapnia.
   5. Wybierz soczewkę obiektywu na podstawie grubości dolnej części naczynia hodowlanego oraz odległości roboczej obiektywu. Wybierz czas naświetlania używany do monitorowania oscylacji sygnału wapnia, unikając jednocześnie nadmiernego wybielania i użycia foto.
   6. Dostosowywanie parametrów zgodnie z typem sondy i wymaganiami eksperymentalnymi podczas obserwacji innych sygnałów dynamicznych.

6. Rozwiązywanie problemów

1. Sprawdź Tabelę 1 , aby uzyskać porady dotyczące rozwiązywania problemów.

7. Analiza statystyczna

1. Przedstawij wszystkie dane jako średnią ± odchyleniu standardowym (SD). Oprogramowanie GraphPad Prism (USA) zostało użyte do porównania wyników między dwiema grupami za pomocą t-testu niesparowanego Studenta. Różnice można uznać za statystycznie istotne, gdy **p < 0,01, ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001.

Results

Aby zweryfikować funkcję obrazowania w czasie rzeczywistym tego urządzenia obciążającego ciśnieniem hydrostatycznym, obserwowano dynamikę sygnałów wapnia w komórkach nowotworowych po zastosowaniu ciśnienia hydrostatycznego. Łączne komórki MDA-MB-231, HeLa i A549 zostały zasiewane do misek hodowlowych o średnicy 35 mm do dalszego użytku. Po barwieniu sondą wapniową, komórki wolne od surowicy hodowane zostały poddane ciśnieniu hydrostatycznemu 40 kPa. Po 10 minutach obciążenia ciśnieniowego hydrostatycznego poziom wapnia w...

Discussion

Protokół ten wykazał uniwersalnie adaptowalne urządzenie obciążające ciśnieniem, które umożliwiało obserwację dynamiki mechanotransdukcji w czasie rzeczywistym przy regulowanym ciśnieniu hydrostatycznym. Integrując optycznie przezroczystą osłonę PMMA z precyzyjnie obrabianą aluminiową podstawą, system pokonuje krytyczne ograniczenia konwencjonalnych komór, które mogą wykonywać jedynie analizę końcową. To urządzenie obciążające ciśnienie, współpracujące ze standardowym mikroskopem odwróconym, może dostarczać dynamicznych ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antybiotyk przeciwmykotyczny (100x)	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122	1% stężenia w ośrodku pełnym
Autoklaw	Panasonic, Japonia	MLS-3751-PC	Do sterylizacji aluminiowej podstawy i silikonowej uszczelki
Szafka Bezpieczeństwa Biobezpieczeństwa	Thermo Fisher Scientific, USA	Szafki bezpieczeństwa biologicznego serii A2 klasy II serii 1300 A2	Zapewnia sterylne środowisko do obsługi komórek
Cal-520 AM, wskaźnik wapnia przechodzący przez komórki	AAT Bioquest, USA	21131	Do dynamicznego wykrywania stężenia jonów wapnia w komórkach żywych
Talerz do hodowli komórkowej (35 mm)	BIOFIL, Chiny	TCD010035	Standardowa antena 35 mm używana do wysiewu komórek
Podstawa komory (aluminium)	Quanyi, Chiny	/	Custom-designed Ø 56 mm, H 15 mm, centralne okno i Oslash; 40 mm
Pokrywa komory (PMMA)	Quanyi,   Chiny	/	Custom-designed Ø 56 mm, z 6&; Otwory gwintowane M3, port gazowy Luer-lock
CO2 Inkubator	Thermo Fisher Scientific, USA	HERAcell 3111	Utrzymuje warunki hodowli na poziomie 37 stopni stopni; C z lub bez 5% CO2
HBSS (Zrównoważony roztwór soli Hanksa)	Beyotime, Chiny	C0219	Do mycia komórek przed i po barwieniu
Linia komórkowa HeLa	Centrum Zasobów Komórkowych, Instytut Podstawowych Nauk Medycznych, CAMS/PUMC, Chiny	CRM-CCL-2	Ludzkie komórki raka szyjki macicy
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Nikon, Japonia	Eclipse Ti2	Do obrazowania fluorescencyjnego
Leibovitz L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	41300039	Dla hodowli komórek MDA-MB-231
Linia komórkowa MDA-MB-231	Centrum Zasobów Komórkowych, Instytut Podstawowych Nauk Medycznych, CAMS/PUMC, Chiny	CRM-HTB-26	Ludzkie komórki raka piersi
Serum dla noworodków (NCS)	Thermo Fisher Scientific, USA	16010142	10% stężenia w medium pełnym
Regulator ciśnienia	Hongrun, Chiny	DP20	Zakres: 0-200 kPa
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific, USA	31800022	Dla hodowli komórek MDA-MB-231
Strzykawka sterylna (5 mL)	KDL, Chiny	1101010198	Do wstrzykiwania medium lub odczynników przez port Luer-lock
Trypsyna (0,25%)	Thermo Fisher Scientific, USA	2520056	Do dysocjacji komórek przylegających do przechodzenia