Protokół NetDecoder do budowy sieci interakcji białkowych specyficznych dla kontekstu na podstawie danych transkryptomowych z wykorzystaniem modelowania przepływu informacji

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół korzystania z NetDecoder, narzędzia do modelowania sieci, aby skonstruować sieci interakcji białkowych specyficznych dla kontekstu i zbudować modele użyteczności genów (GUM). Korzystając z danych transkryptomiki, w połączeniu z kurowanymi sieciami interakcji białko-białko (PPI), NetDecoder umożliwia identyfikację kluczowych celów i podsieci.

Streszczenie

Analiza różnicowej ekspresji to powszechnie stosowana technika wyznaczania potencjalnych docelowych terapii, ale ignoruje złożoność sieci genów w różnych szlakach biologicznych. Często wysoko eksponowane geny niekoniecznie wyjaśniają właściwości biologicznego fenotypu. NetDecoder, narzędzie do biologii sieciowej, które integruje dane transkryptomowe z sieciami interakcji białko-białko (PPI), aby modelować przepływ informacji specyficznych dla kontekstu, użyteczność genów oraz kluczowe krawędzie i różnicująco wykorzystywane sieci genów, zostało opracowane w celu zajęcia się tą ograniczającą cechą analizy różnicowej ekspresji.

Ten protokół to przyjazny dla początkujących, krok po kroku przewodnik po korzystaniu z NetDecoder, z kompleksowymi wytycznymi obejmującymi przetwarzanie danych, wykonywanie NetDecoder oraz analizę wyników. Przepływ pracy obejmuje konfigurację oprogramowania, budowę sieci oraz analizę modelowania opartego na przepływie w celu ilościowego określenia różnic między warunkami biologicznymi na poziomie genów (węzłów) i interakcji gen-gen (poziom krawędzi). Wynikiem są kluczowe cele i routery, różnicowe pod-sieci przepływowe oraz dystrybucje przepływu krawędzi, umożliwiające identyfikację kluczowych genów i ścieżek regulacyjnych związanych z określonymi stanami biologicznymi. Po przeprowadzeniu wyszczególnionych kroków naukowcy będą w stanie przeprowadzić niezależne badania, aby odkryć przepływ genów fenotypu między fenotypami za pomocą danych transkryptomowych i kurowanych sieci PPI.

Wprowadzenie

Wybór genów i powiązanych szlaków do badań terapeutycznych jest często napędzany przez analizy różnicowej ekspresji¹. Ta metoda analizy jest skuteczna w określaniu, jak różni się ekspresja genów w dwóch lub więcej warunkach. Jednak geny funkcjonują w złożonych, powiązanych sieciach biologicznych, co oznacza, że indywidualna ekspresja genów nie uchwycuje w pełni, jak geny współdziałają w sieci i jakie są ich relacje gen-gen². Metody propagacji sieci integrują ekspresję genów z sieciami interakcji, aby zidentyfikować biologicznie ważne geny, które mogą zostać przeoczone przez samą analizę różnicową ekspresji³. Obecne podejścia nie liczą wprost funkcjonalnej ważności genów i tego, jak informacje biologiczne są redystrybuowane w sieciach interakcji białko-białko (PPI) w różnych warunkach biologicznych. Dlatego potrzebna była metoda modelowania zachowania sieci specyficznych dla warunków i ilościowego określania zmian w przepływie informacji w układach biologicznych. Aby uwzględnić, jak geny współdziałają w szerszym biologicznym sieci, platforma biologii sieciowej NetDecoder została opracowana, aby odkrywać geny o największej różnicy w przepływie informacji między warunkami. NetDecoder wykorzystuje algorytm przepływu kierowany procesem, aby przełożyć istniejące wiedzę na temat ludzkiej sieci PPI, w połączeniu z danymi sekwencji RNA w dużej skali, aby skonstruować model interakcji napędzanych przepływem informacji⁴.

Wykorzystując dane dotyczące przepływu informacji dla sieci fenotypowych, model użyteczności genów (GUM)⁵ może zostać opracowany, aby zidentyfikować geny o wysokim przepływie informacji jako mające najwyższą ogólną użyteczność genów w sieci, niezależnie od ich wartości różnicowej ekspresji. To podejście wspiera bardziej efektywne strategie priorytetyzacji i identyfikacji celów, zapewniając wgląd, którego tradycyjna analiza często nie uchwyca. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod analizy różnicowej ekspresji lub opartych na korelacji metod sieciowych, NetDecoder ilościowo określa zarówno zmiany w przepływie informacji na poziomie genów (poziom węzłów), jak i zmiany w interakcjach (poziom krawędzi), umożliwiając identyfikację funkcjonalnie ważnych genów, nawet w przypadku braku dużych zmian ekspresji^4,5. NetDecoder jest szeroko stosowany do danych sekwencji RNA w dużej skali, które obejmują analizę porównawczą między dwoma warunkami biologicznymi, umożliwiając identyfikację zmian w przepływie informacji i organizacji sieci. Chociaż NetDecoder obsługuje integrację innych danych omics, w tym proteomiki i epigenetyki, obecny protokół specyficznie pokazuje przepływ pracy przy użyciu danych transkryptomowych. W tych zastosowaniach użytkownicy mogą definiować geny źródłowe na podstawie białek lub genów regulowanych epigenetycznie, pozwalając na rozpoczęcie analizy przepływu informacji od tych cech molekularnych. Ta elastyczność umożliwia włączenie do analizy opartej na sieci dowodów multi-omics i ułatwia odkrywanie mechanizmów regulacyjnych międzymodalnych leżących u podstaw różnic fenotypowych.

Typowe projekty badań obejmują porównania binarne, w tym, ale nie tylko, warunki chorobowe w porównaniu ze zdrowymi, pacjenci reagujący na leczenie w porównaniu z niereagującymi, leczenia farmakologicznego, eksperymentów z wyciszeniem lub wyłączeniem w porównaniu z eksperymentami kontrolnymi oraz analizy przejść stanów rozwojowych lub komórkowych. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie reproduktywalnej ramy dla stosowania NetDecoder w celu odkrycia genów o zmienionym wpływie sieci w różnych warunkach biologicznych. Osiąga się to dzięki łatwym w naśladowaniu krokom konfiguracji i uruchomienia NetDecoder, a także przykładom do naśladowania, podstawowym technikom rozwiązywania problemów oraz metodom interpretacji wyników, które są również przedstawione w protokole.

Protokół

To badania wykorzystały publicznie dostępne zestawy danych sekwencjonowania RNA i nie obejmowały bezpośrednio badań na ludziach ani na zwierzętach. Dlatego nie było wymagane zatwierdzenie przez komitet etyczny instytucji i zgoda na udział w badaniu.

UWAGA: NetDecoder wymaga następujących plików wejściowych: znormalizowane wyrażenie genów w dwóch określonych warunkach biologicznych; plik metadanych opisujący warunki biologiczne; lista genów źródłowych do budowy i modelowania sieci; sieć oddziaływań białko-białko (PPI) z domeny publicznej; oraz sieć o ważonych krawędziach (EWN) zbudowana dla każdego warunku biologicznego.

1. Przygotowanie danych

1. Pobierz dane z sekwencjonowania RNA i metadane
   1. Pobierz dane z sekwencjonowania RNA (macierz surowych danych liczby ekspresji genów i nazw próbek) oraz odpowiadające im metadane (nazwy próbek, warunki itp.) z publicznego repozytorium, takiego jak Gene Expression Omnibus (GEO), lub użyj eksperymentalnych zestawów danych wygenerowanych w laboratorium. Zazwyczaj jest to macierz, w której wiersze odpowiadają nazwom genów, a kolumny nazwom próbek.
      UWAGA: Zestaw danych przykładowych wykorzystany do zademonstrowania tego protokołu został uzyskany z repozytorium National Omics Data Encyclopedia (NODE) (baza danych BioSino) pod numerem dostępu OEP001105⁶. Użytkownicy mogą zastąpić go własnymi zestawami danych z sekwencjonowania RNA.
   2. Utwórz plik adnotacji próbek (metadane) zawierający nazwy próbek i ich grupy lub powiązane warunki; na przykład “kontrola” i “choroba” to typowe rodzaje warunków. Upewnij się, że nazwy próbek pasują między metadanymi a plikami ekspresji.
2. Zbierz dane ekspresji i metadane
   1. Upewnij się, że wygenerowana macierz danych zawiera liczby ekspresji, nazwy genów i plik metadanych z nazwami próbek i warunkami. Jeśli to konieczne, użyj pakietu R, takiego jak org.Hs.eg.db (człowiek) lub AnnotationDbi, aby dopasować różne identyfikatory genów.
   2. Usuń nieistotne informacje z pliku metadanych za pomocą R lub podobnego języka programowania.
   3. Połącz informacje z plików liczby ekspresji w jednym pliku, aby ułatwić manipulację.
3. Filtruj dane ekspresji
   1. Przed przetwarzaniem macierzy danych ekspresji genów wykluczaj duplikaty genów, wartości null (NA), niskie ekspresje (<10 liczby ekspresji), i/lub geny o niskiej wariancji itp.
4. Przetworzenie wstępne danych
   1. Normalizacja sekwencjonowania RNA i analiza różnic w ekspresji
      UWAGA: Ten krok jest jednym (1.4.1) z dwóch (1.4.2) podejść do selekcji genów do utworzenia sieci o ważonych krawędziach (EWN) i selekcji genów źródłowych (kroki 1.5–1.6), gdy analiza rozpoczyna się od danych z sekwencjonowania RNA. Jako alternatywę można zastosować dopasowanie szablonów oparte na korelacji Pearson, pomijając krok 1.4.3.
      1. Wykonaj konwersje identyfikatorów genów na tym etapie za pomocą pakietu R, AnnotationDbi, w uzgodnieniu z pakietami dla poszczególnych organizmów. NetDecoder używa symboli genów (czyli identyfikatorów genów), które pasują do przykładowej PPI.
      2. Wykonaj normalizację i analizę różnic w ekspresji między dwoma warunkami za pomocą pakietów R limma, edgeR, DESeq2 lub podobnych narzędzi.
      3. Jeśli używasz DESeq2, skonstruuj zestaw DESeq za pomocą funkcji DESeqDataSetFromMatrix() z macierzą liczby (geny i próbki) i metadanymi próbek (warunki) jako wejście.
      4. Użyj funkcji DESeq() z ustawieniami domyślnymi na obiekcie utworzonym w kroku 1.4.1.3, aby obliczyć wartości różnic w ekspresji.
      5. Zapisz wyniki w macierzy danych z identyfikatorami genów (Gene ID) jako nazwami wierszy i kluczowymi wynikami, w tym log2 fold change (log2FC), p-value i poprawioną wartością p, jako kolumnami.
      6. Opcjonalnie, wyfiltruj wyniki za pomocą poprawionej wartości p (<0.05) i/lub wartości log2FC (na przykład: |log2FC| > 1) za pomocą dplyr lub podobnego narzędzia.
      7. Upewnij się, że wszystkie przetworzone listy genów i macierze log2 fold change są eksportowane jako pliki tabulatorowe (.txt lub.csv) do wejścia do NetDecoder.
      8. Wykonaj porównania parowe dla kroku 1.4.1, jeśli użyto więcej niż 2 warunków biologicznych i uzyskaj parowe wyniki za pomocą funkcji results() z obiektu DESeq wygenerowanego w kroku 1.4.1.5.
   2. Normalizacja ekspresji mikroarray - opcjonalnie
      UWAGA: Jeśli używasz danych mikroarray, wykonaj ten krok w celu normalizacji danych.
      1. Normalizuj dane, otwierając skrypt normalizacji NetDecoder (HuLiLab/NetDecoder_Example/raw_data/NetDecoder_normalize.R), dostępny z https://github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main, na platformie deweloperskiej R i edytując kursywę, aby pasowała do katalogu roboczego zawierającego pliki intensywności komórek (CEL).
         setwd(~/NetDecoder_Example/raw_data

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 1, NetDecoder działa w oparciu o strukturalny przepływ pracy składający się z przetwarzania danych, konfiguracji sieci i analizy opartej na przepływie, przy czym wyniki są uporządkowane w odrębnych katalogach odpowiadających każdemu etapowi potoku. Ta modułowa struktura umożliwia systematyczną weryfikację wyników, zapewniając, że wyniki można prześledzić do każdego kroku obliczeniowego i wspierając ogólną możliwość powtórzenia.

Udana realizacja NetDecoder (Rysunek 2) produkuje wynik w czterech katalogach (analysis, collect, networks i “your_shortname”) zawierających dane odpowiadające różnym warunkom, w tym figury i ilościowe wyniki wartości przepływu, podsieci i innych wyników oddziaływań przepływowych (Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 3). Obecność skatalogizowanych plików i figur w tych katalogach wskazuje, że potok wykonał się poprawnie. W przeciwieństwie do tego, nieudane uruchomienia charakteryzują się brakującymi wynikami i/lub niekompletnymi figurami. Ponieważ NetDecoder ocenia tysiące genów w sieci PPI, udane uruchomienia zazwyczaj wymagają wielu godzin obliczeń, w zależności od wielkości zestawu danych i dostępnych zasobów. W przypadku przedstawionej tu reprezentatywnej analizy raka przewodu żółciowego u człowieka, realizacja NetDecoder wymagała czasu wykonania około 4–6 godzin na stacji roboczej Puget3 (Puget Systems) opartej na Linuxie. Niezwykle krótki czas wykonania może wskazywać na niewłaściwie sformatowane dane wejściowe lub niekompletne wykonanie potoku. Niewłaściwie sformatowane dane wejściowe lub nieudane wykonanie potoku mogą skutkować komunikatami o błędach, które można prześledzić do przyczyny problemu. Rysunek 3 przedstawia przykładowe wyniki, które są obecne po pomyślnym uruchomieniu NetDecoder. Reprezentatywna analiza przedstawiona tu wykorzystuje dane sekwencjonowania RNA z 255 próbek raka przewodu żółciowego (OEP001105)⁶, umożliwiające porównanie stanów choroby I–II i III–IV oraz zmienionego przepływu informacji między warunkami.

Trzy mapy cieplne na Rysunku 4 podsumowują ogólne zmiany w przepływie informacji w sieci między genami w różnych warunkach, w tym geny routerów przekazujące znaczny przepływ informacji w sieci, ważne dolne strumienie docelowe geny lub geny ogólnie silnie dotknięte. Szerokie rozmieszczenie zarówno dodatniego, jak i ujemnego różnicowego przepływu wskazuje, że informacje są redystrybuowane w sieci, zamiast jednolicie zwiększane lub zmniejszane. Ta różnorodność i różne typy genów wspierają zdolność NetDecoder do identyfikacji genów o zmienionej funkcjonalnej ważności między fenotypami.

Rysunek 4 przedstawia również wykresy barowe na poziomie krawędzi, które ilościowo określają zmiany przepływu dla poszczególnych interakcji gen-gen w różnych warunkach. Wyniki te pokazują, że przepływ przez określone interakcje może się różnić w zależności od warunków, co odzwierciedla przekształcanie sieci w zależności od kontekstu. W ten sposób przepływ na krawędziach rejestruje zmiany na poziomie interakcji w przekazywaniu informacji, podczas gdy różnicowy przepływ zapewnia podsumowanie zmian na poziomie węzłów, umożliwiając priorytetyzację genów o największej ogólnej zmianie wpływu na sieć.

Razem, te wyniki pokazują, że NetDecoder rejestruje zmiany w przepływie informacji na poziomie genu (węzła), gen-gen (krawędzi) i sieci w obrębie sieci biologicznych (Rysunek 4). Mapy cieplne identyfikują geny o zmienionym przekazywaniu informacji, routerach i odbiorze w sieci, podczas gdy analizy na poziomie krawędzi ujawniają konkretne interakcje napędzające te zmiany. Fenotypowe sieci informacyjne zapewniają wizualną reprezentację przekształcania sieci między warunkami, gdzie węzły reprezentują geny, a grubość krawędzi odpowiada wielkości przepływu informacji (Rysunek 4). Ta reprezentacja na poziomie systemu wspomaga identyfikację kluczowych regulatorowych genów i szlaków związanych z badanymi warunkami. Ponadto, pomyślne wytworzenie tych figur wskazuje, że NetDecoder został wykonany poprawnie.

Ponieważ NetDecoder produkuje dużą liczbę plików wyjściowych, identyfikacja najbardziej istotnych wyników jest niezbędna do interpretacji. Na przykład, aby zbadać różnice w przepływie między warunkami (np. niski etap a wysoki etap), można użyć dwóch kluczowych plików (kroki nawigacji są sterowane przez strukturę plików z Rysunku 3). Pierwszy, “EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Disease.txt” (znajdujący się w katalogu analysis/Disease), identyfikuje interakcje (krawędzie) o największych zmianach w przepływie między warunkami. Drugi, “flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt” (znajdujący się w katalogu ̶

Dyskusja

Ten protokół opisuje implementację NetDecoder, ramy sieciowej biologii, która integruje dane ekspresji genów z sieciami interakcji białko-białko (PPI), aby modelować przepływ informacji specyficznych dla warunków i priorytetyzować geny na podstawie ich funkcjonalnego wpływu w systemach biologicznych. Skuteczne zastosowanie tej metody zależy od kilku kluczowych kroków, starannego doboru metod oraz właściwej interpretacji wyników.

Wstępne etapy protokołu obejmują pobieranie danych ekspresji, generowanie metadanych i konstrukcję zjednoczonej macierzy ekspresji. Te kroki są krytyczne dla zapewnienia kompatybilności z dalszą analizą. Macierz ekspresji musi być sformatowana tak, aby geny były wierszami, a próbki kolumnami, przy czym nazwy próbek w macierzy i pliku metadanych muszą być identyczne. Jakiekolwiek niezgodności na tym etapie (np. niedopasowane identyfikatory próbek lub duplikaty nazw genów) będą się rozprzestrzeniać przez potok przetwarzania i prowadzić do niepowodzeń na późniejszych etapach.

Filtrowanie danych niskiej jakości (np. genów o niskich wartościach, brakujących wartościach lub genach o niskiej wariancji) jest szczególnie ważne, ponieważ te cechy mogą wprowadzać szum do konstrukcji sieci opartej na korelacji. Sukces przetwarzania wstępnego jest wskazany przez czystą macierz ekspresji bez brakujących wartości i spójne identyfikatory genów pasujące do tych użytych w sieci PPI.

Kluczowym punktem decyzyjnym w protokole jest wybór między analizą różnic w ekspresji a dopasowaniem szablonów do wyboru genów źródłowych używanych w konstrukcji sieci ważonej krawędziami (EWN). Analiza różnic w ekspresji jest najbardziej odpowiednia przy porównywaniu dobrze zdefiniowanych grup eksperymentalnych z wystarczającą liczbą powtórzeń. To podejście identyfikuje geny o statystycznie znaczących zmianach ekspresji między warunkami i dostarcza ilościowych wyników, takich jak zmiany w log2 i wartości p skorygowanych. Sukces wykonania jest wskazany przez dystrybucję zarówno znaczących, jak i nieznaczących genów, a nie jednolicie ujemnych wyników. W przeciwieństwie do tego, dopasowanie szablonów jest lepiej dostosowane, gdy celem jest identyfikacja genów o wzorach ekspresji skorelowanych z ciągłym lub referencyjnym profilem. Ta metoda zatrzymuje geny na podstawie siły korelacji zamiast wielkości różnic w ekspresji. Sukces etapu dopasowania szablonów daje zestaw genów o statystycznie znaczących korelacjach z warunkiem referencyjnym. Wybór między tymi podejściami wpływa na dalszą topologię sieci; analiza różnic w ekspresji podkreśla zmiany wielkości, podczas gdy dopasowanie szablonów podkreśla skoordynowane wzorce ekspresji.

Krok konstrukcji EWN jest jednym z najważniejszych elementów protokołu. Tutaj znormalizowane dane ekspresji genów są zintegrowane z siecią PPI, aby obliczyć korelacje gen-gen na pary dla wszystkich interakcji obecnych w sieci. Zachowane są tylko geny wspólne dla zbioru danych ekspresji i sieci PPI, co zapewnia biologiczną istotność i spójność obliczeniową. Dla każdego warunku obliczane są współczynniki korelacji Pearson dla wszystkich krawędzi, wraz z odpowiadającymi im wartościami p i wartościami bezwzględnymi korelacji. Te metryki definiują wagi krawędzi używane przez NetDecoder. Sukces konstrukcji EWN jest wskazany przez tysiące korelacji gen-gen, szeroką dystrybucję wartości korelacji i minimalne braki wartości po filtrowaniu. Niepowodzenie na tym etapie jest często spowodowane niedopasowaniu identyfikatorów genów, niewystarczającą wielkością próby lub niewłaściwie znormalizowanymi danymi ekspresji. Typowe punkty niepowodzenia NetDecoder często mogą być rozwiązane poprzez skomplikowaną weryfikację plików wejściowych i konfiguracji oprogramowania. Jeśli NetDecoder kończy działanie nieoczekiwanie lub generuje niekompletne wyniki, użytkownicy muszą sprawdzić, czy identyfikatory próbek są identyczne między macierzami ekspresji a plikami metadanych, czy identyfikatory genów są spójne między zbiorami danych ekspresji, listami źródłowych genów i siecią PPI, oraz czy macierze ekspresji nie zawierają brakujących wartości. Jeśli wystąpią błędy lub wyniki zostają skrócone, użytkownicy mogą zweryfikować kompatybilność instalacji i wersji oprogramowania, sprawdzić komunikaty generowane podczas działania i potwierdzić pomyślne zakończenie każdego pośredniego kroku przed przejściem do dalszych analiz. Przegląd plików wyjściowych i/lub komunikatów konsoli może pomóc w zlokalizowaniu źródła błędu przed podjęciem dalszych analiz. NetDecoder wymaga szczegółowej konfiguracji ścieżek plików, argumentów wejściowych i zależności. Kluczowe kroki obejmują określenie katalogu roboczego i ścieżek bibliotek, plików ontologii i adnotacji genów, warunków specyficznych dla EWN oraz list źródłowych genów.

Ponieważ potok jest wykonywany etapami (generacja sieci dla obu warunków, analiza i zbieranie wyników), błędy we wcześniejszych etapach uniemożliwią udane zakończenie kolejnych. Prawidłowo funkcjonujące uruchomienie produkuje cztery katalogi (analiza, zbieranie, sieci, "nazwa_krótka"), z których każdy zawiera wyniki specyficzne dla warunków. Innym praktycznym wskaźnikiem poprawnego uruchomienia jest czas działania. Pomyślne uruchomienia za

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AnnotationDbi	Bioconductor	version 1.68.0	Annotation and gene mapping
Bioconductor	Bioconductor	version 3.19	Framework for transcriptomic data analysis and package ecosystem supporting DESeq2, edgeR, limma, AnnotationDbi, and organism databases, etc.
Cytoscape	The Cytoscape Consoritum	version 3.10.4	Network visualization and analysis
DESeq2	Bioconductor	version 1.46.0	Differential expression analysis (with negative binomial modeling)
dplyr	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	version 1.1.4	Data manipulation and transformation
edgeR	Bioconductor	version 4.4.2	Count-based differential expression analysis
ggplot2	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	version 4.0.0	Data visualization and plotting
GNU Bash	GNU Project	System default	Bash, Execution of NetDecoder pipeline scripts
igraph	igraph Development Team	version 2.1.4	Network construction and graph analysis
Limma	Bioconductor	version 3.62.2	Linear modeling for gene expression analysis
NetDecoder	Hu Li Laboratory, Mayo Clinic	(2024 Hu Li Lab)	Construction of context-specific protein interaction networks via information flow modeling
org.Hs.eg.db	Bioconductor	version 3.20.0	Human gene annotation database
Oracle JDK	Oracle Corporation	≥ version 1.8	Runtime environment for NetDecoder execution
pheatmap	Raivo Kolde	version 1.0.13	Visualization of expression and correlation structure
R	The R Foundation	version 4.4.2	Core environment for transcriptomic and network analysis