$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem Caenorhabditis elegans były prowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i wykorzystania organizmów laboratoryjnych na Uniwersytecie Normalnym w Pekinie.
Rycina 1: Przegląd endogennego znakowania fluorescencyjnego za pomocą CRISPR/Cas9 u C. elegans. Schematyczny przebieg procesu ilustrujący główne etapy generowania i walidacji endogennego wstawienia (knock-in) znacznika fluorescencyjnego. Na etapie projektowania i konstrukcji wybierany jest gen docelowy oraz miejsce insercji wzbogacone w linii zarodkowej, pDD162 służy jako plazmid CRISPR/Cas9 do ekspresji Cas9 i gRNA, a pPD95.75 jako szkielet donora, do którego subklonowany jest znacznik fluorescencyjny (np. GFP) oraz lewe i prawe ramiona homologii. Na etapie mikroiniekcji mieszanina wtryskowa CRISPR/Cas9 (zawierająca plazmid gRNA/Cas9, matrycę donora i markery współiniekcyjne) jest podawana do gonad młodych dorosłych hermafrodyt, po czym następuje rekonwalescencja na wysianych płytkach. Na etapie walidacji potomstwo pozytywne pod kątem markerów jest wybierane do dalszego genotypowania, w tym identyfikacji zdarzeń knock-in metodą PCR oraz potwierdzenia sekwencjonowaniem DNA; linie z sukcesywnie wykonanym knock-in są następnie badane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny ekspresji w linii zarodkowej i lokalizacji subkomórkowej znakowanego białka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
1. Wybór genu docelowego wzbogaconego w linii zarodkowej
- Zidentyfikuj geny kandydackie wykazujące dominującą ekspresję w gonadach lub komórkach zarodkowych, korzystając z publicznych baz danych oraz opublikowanej literatury.
- Wybierz odpowiednie miejsce wprowadzenia znacznika w oparciu o cechy białka. Zapisz wybraną izoformę oraz pozycję insercji znacznika do późniejszego projektu gRNA i matrycy donora (Rysunek 1).
2. Projektowanie gRNA i matrycy donorowej
- Zidentyfikuj 20 nt sekwencję przewodniego RNA (gRNA) powyżej motywu PAM (protospacer adjacent motif; NGG), który jest niezbędny do rozpoznania przez Cas9, i umieść ją jak najbliżej zamierzonego miejsca wstawienia znacznika.
- Oceń potencjalne gRNA za pomocą narzędzia do projektowania online (np. narzędzia IDT CRISPR design tool) z wybranym genomem C. elegans. Wybierz przewodnik o wysokiej przewidywanej wydajności cięcia docelowego i braku wysokoryzykownych przewidywanych miejsc off-target.
- Sklonuj sekwencję gRNA w regionie pomiędzy promotorem U6 a rusztowaniem gRNA w obrębie plazmidowego wektora ekspresyjnego CRISPR.
UWAGA: Zaprojektuj primery zawierające sekwencję gRNA jako nawisy. Przeprowadź amplifikację PCR, a następnie montaż oparty na rekombinacji homologicznej – metodę klonowania niezależnego od ligacji, która eliminuje trawienie enzymami restrykcyjnymi i umożliwia jednokrokowy klonowanie bezpośrednio do wektora ekspresyjnego15.
- Potwierdź poprawność wstawienia sekwencji za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera.
- Zbuduj plazmid donorowy, wykorzystując znacznik fluorescencyjny flankowany przez lewe i prawe ramiona homologii o długości około 1 000 bp każde, pochodzące z locus docelowego.
UWAGA: Amplifikuj ramiona homologii z genomicznego DNA szczepu N2 przygotowanego jako lizat nicieni przy użyciu trawienia proteinazą K. Zaprojektuj primery z 15–20 bp nakładkami na zlinearyzowany wektor i znacznik fluorescencyjny. Zmontuj ramiona homologii i znacznik w szkielecie wektora via rekombinację homologiczną w jednej reakcji. Wstaw znacznik fluorescencyjny bezpośrednio po kodonie startowym ATG dla znakowania N-końcowego lub przed kodonem stop dla znakowania C-końcowego. Uwzględnij sekwencję łącznika (linkera) pomiędzy genem docelowym a znacznikiem fluorescencyjnym, aby zachować prawidłowe fałdowanie i funkcję białka. Użyj łącznika w celu zmniejszenia zawady sterycznej pomiędzy partnerami fuzji i upewnij się, że zarówno łącznik, jak i znacznik są wstawione w ramce odczytu sekwencji kodującej. Starannie wybierz miejsce wstawienia, aby uniknąć zaburzenia znanych lub przewidywanych domen funkcjonalnych, peptydów sygnałowych lub regionów transbłonowych (Supplementary File 1).
- Wprowadź substytucje ciche do sekwencji matrycy homologicznej donora, aby uszkodzić PAM lub sekwencję wiązania przewodnika bez zmiany sekwencji białka, co zapobiegnie ponownemu cięciu przez Cas9 po integracji.
UWAGA: Wprowadź synonimiczne mutacje punktowe do primerów używanych do amplifikacji ramion homologii, celując w kodony w obrębie regionu PAM.
- Potwierdź integralność sekwencji donora w obu ramionach homologii i w miejscach łączenia ze znacznikiem za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera.
UWAGA: Przechowuj zweryfikowane plazmidy w temperaturze −20 °C w przypadku przechowywania krótkoterminowego lub −80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego.
3. Przygotowanie mieszaniny do iniekcji
- Przygotować mieszaninę do iniekcji, łącząc plazmid ekspresyjny CRISPR, plazmid donora (skonstruowany na podstawie pPD95.75) oraz markery współiniekcyjne w sterylnym ddH₂O do końcowej objętości 10 µL, zachowując stężenia wymienione w Tabeli 1.
UWAGA: Stężenia należy optymalizować empirycznie, aby zrównoważyć czytelność markerów, odzysk kandydatów oraz przeżywalność po iniekcji.
- Odwirować mieszaninę do iniekcji przy 10 000 × g przez 10–20 min w celu osadzenia materiału cząsteczkowego i zapobiegania zapychaniu się kapilary do mikroiniekcji.
| Komponent | Funkcja | Stężenie robocze (ng/μL) |
| pDD162 | Plazmid CRISPR/Cas9 (ekspresja Cas9 i gRNA) | 50-100 |
| Plazmid donorowy (szkielet pPD95.75) | Matryca donorowa HDR zawierająca znacznik fluorescencyjny flankowany ramionami homologii o długości ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marker ko-iniekcji (fenotyp Roller) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marker ko-iniekcji (ekspresja GFP) | 5-10 |
| Sterylna ddH2O | Uzupełnienie do objętości końcowej | – |
Tabela 1: Skład mieszaniny do iniekcji i funkcje plazmidów.Mieszanina do iniekcji zawiera plazmid ekspresyjny CRISPR, plazmid donorowy, pRF4 oraz pPD122.11 w indicated stężeniach, przy całkowitej objętości 10 µL.
4. Napełnianie i przygotowanie igły do iniekcji
- Wytwarzaj igły do mikroiniekcji z kapilar szklanych, używając wyciągacza do igieł skonfigurowanego tak, aby uzyskać długi stożek z ostrym końcem odpowiednim do iniekcji w gonady.
UWAGA: Parametry wyciągacza należy zoptymalizować empirycznie. Przykładowe parametry początkowe: heat = 540, pull = 20, velocity = 100.
OSTROŻNIE: Należy ostrożnie obchodzić się z wyciągniętymi igłami, aby uniknąć obrażeń wskutek nakłucia. Do manipulowania igłami należy używać pęsety, a zużyte igły utylizować w pojemniku na odpady ostre.
- Podgrzej pipetę mikrokapilarną i przełam ją na dwa kawałki, aby stworzyć narzędzie do ładowania.
UWAGA: Jako alternatywę można zastosować komercyjne końcówki do ładowania.
- Do szerokiego końca skróconej pipety mikrokapilarnej przymocuj gumową gruszkę aspiracyjną.
- Naciągnij do ładowarki około 1 µL klarownego supernatantu mieszaniny do iniekcji.
UWAGA: Dokładna objętość nie jest krytyczna. Należy upewnić się, że roztwór wypełnia końcówkę igły.
- Wprowadź ładowarkę do tylnego końca igły iniekcyjnej i delikatnie podaj mieszaninę do iniekcji.
- Umieść załadowaną igłę poziomo na 10 min, aby roztwór osiadł w stronę końcówki i potwierdzić obecność ciągłej kolumny cieczy.
- Zamocuj igłę w mikroskopie do iniekcji i ustaw końcówkę w ognisku, korzystając z optyki w jasnym polu.
- Otwórz końcówkę igły, delikatnie dotykając jej krawędzią szkiełka nakrywkowego w oleju halokarbonowym, a następnie sprawdź przepływ.
UWAGA: Dostosuj ciśnienie iniekcji (30–80 psi) tak, aby w ciągu 1 s16 wytworzyć pęcherzyk o średnicy w przybliżeniu równej średnicy gonady.
5. Przygotowanie nicieni do wstrzykiwania
UWAGA: Przygotować płytki z podłożem do wzrostu nicieni (NGM) oraz bufor M9 zgodnie z wcześniejszym opisem17. Hodować nicienie na płytkach zaszczepionych szczepem Escherichia coli OP50 (dalej określanym jako OP50) i wykonywać iniekcje w linii N2.
- Wybierz hermafrodyty w stadium L4 z wyprawionej płytki i inkubuj w temperaturze 20 °C przez 10 h, aby uzyskać młode dorosłe osobniki z dobrze rozwiniętą linią zarodkową.
- Przenieś nicienie na pustą płytkę, aby ograniczyć przenoszenie bakterii.
- Przygotuj suchą podkładkę z 2% agarozy na szkiełku przedmiotowym i nanieś kroplę oleju halokarbonowego.
- Przenieś nicienia na podkładkę agarową za pomocą pędzelka z rzęsy.
- Unieruchom nicienia i ustaw gonadę w pozycji odpowiedniej do wstrzyknięcia.
OSTRZEŻENIE: Iniekcje należy przeprowadzić w ciągu 20–30 min, aby zapobiec wysuszeniu.
6. Wykonaj mikroiniekcję gonadalną
Rysunek 2: Lokalizacja dystalnego syncytium gonady dla mikroiniekcji u młodych dorosłych C. elegans hermafrodytów. (A) Obraz w jasnym polu przy niskim powiększeniu zamontowanego młodej dorosłego hermafrodyty. Widoczne są oba ramiona gonady; dla jednego ramienia zaznaczono miejsce iniekcji (strzałka) jako przykład reprezentatywny. Obszar w ramce oznacza obszar pokazany przy większym powiększeniu na panelu B. (B) Widok w DIC przy większym powiększeniu dystalnej gonady odpowiadający obszarowi w ramce na panelu A. Strzałka wskazuje pozycję iniekcji w obrębie dystalnego syncytium gonady, gdzie podawana jest mieszanina iniekcyjna. Paski skali: 100 µm (A) i 20 µm (B). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Zlokalizuj unieruchomionego nicienia i zidentyfikuj gonadę, korzystając z obiektywu o niskim powiększeniu.
- Ustaw igłę za pomocą sterowników mikromanipulatora.
- Uorientuj nicienia pod kątem 20–40° względem igły.
- Ustaw ostrość na dystalną część linii zarodkowej, korzystając z większego powiększenia.
- Przesuń nicienia w stronę igły i umieść jej końcówkę w obrębie syncytium gonadalnego (Rysunek 2).
- Wstrzyknij roztwór i potwierdź podanie preparatu poprzez widoczne obrzęknięcie gonady.
UWAGA: Zoptymalizuj ciśnienie wtrysku (30–80 psi), ciśnienie kompensacyjne (0,1–0,5 psi) oraz czas trwania wtrysku (0,1–0,3 s).
OSTROŻEŻNIE: Nadmierne ciśnienie lub objętość mogą spowodować rozerwanie organizmu nicienia.
- Wycofaj igłę i ustaw ją ponownie do kolejnych wtrysków.
UWAGA: Wykonaj wtrysk jednostronny, aby zmaksymalizować przeżywalność, lub wtrysk obustronny, aby zwiększyć wydajność edycji.
- Dodaj bufor M9, aby uwolnić nicienie, a następnie przenieś każdego z nich na oddzielną płytkę regeneracyjną.
- Powtórz wtryski dla 20–25 nicieni.
UWAGA: Wymień igłę, jeśli ulegnie zapchaniu lub uszkodzeniu.
- Inkubuj wstrzyknięte nicienie w temperaturze 20 °C przez 2–3 dni w celu regeneracji.
7. Przesiewanie kandydatów F1 w celu zidentyfikowania linii z pozytywnym knock-in
- Przesiewowo sprawdź potomstwo F1 pod kątem markerów współwstrzyknięcia i wybierz zwierzęta wykazujące obecność markerów.
UWAGA: Przykłady alternatywnych fluorescencyjnych markerów współwstrzyknięcia o różnej specyficzności tkankowej i właściwościach widmowych znajdują się w Uzupełniającej tabeli 1.
UWAGA: W celu zwiększenia niezawodności wybierz zwierzęta wykazujące oba markery. Priorytetowo traktuj lęgi o wysokiej częstotliwości występowania markerów („lęgi jackpot”).
- Przenieś każdego nicienia F1 na oddzielną płytkę i pozwól na składanie jaj przez 1–2 dni.
- Zlizuj każdego nicienia F1 w buforze z proteinazą K, aby przygotować matryce do PCR.
UWAGA: Jeśli lizaty nie zostaną przetworzone natychmiast, przechowuj je w temperaturze −80 °C.
- Przeprowadź PCR złączeniowy (junction PCR), używając jednego primera genomicznego poza ramieniem homologii oraz jednego wewnętrznego primera znacznika.
UWAGA: Zachowaj odpowiednie płytki od zwierząt F1, które dały wynik dodatni w teście PCR.
8. Przesiewanie potomstwa F2 w celu wyizolowania homozygotycznych linii knock-in i potwierdzenia integracji
- Wyizoluj potomstwo F2 z linii F1 pozytywnych w testach PCR na oddzielne płytki.
- Pozwól nicieniom F2 na wyprodukowanie potomstwa, a następnie poddaj dorosłe osobniki lizie w celu genotypowania.
UWAGA: W razie potrzeby przechowuj lizaty w temperaturze −20 °C.
- Przeprowadź PCR z użyciem starterów flankujących ramiona homologii, aby odróżnić allele typu dzikiego od alleli knock-in na podstawie wielkości produktu.
- Potwierdź prawidłową integrację za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera na obu złączach insercyjnych.
- Zweryfikuj ekspresję i lokalizację fluorescencji w linii zarodkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Rozmnażaj potwierdzone linie homozygotyczne i prowadź ich zasoby.
UWAGA: Zwalidowane linie poddaj krio konserwacji w celu długoterminowego przechowywania.