Receptor manozowy C typu 2 przewiduje słaby wynik glejaka i wiąże się z fenotypami inwazyjnymi oraz zmianami związanymi z β-kateniną/EMT

Podsumowanie

Analizy kohortowe publiczne oraz eksperymenty oparte na komórkach glejaka wskazują MRC2 jako marker słabej prognozy związany z zwiększoną proliferacją, migracją, inwazją oraz zmianami związanymi z β-kateniną/EMT w glejaku.

Streszczenie

Glejak pozostaje śmiertelnym nowotworem ośrodkowego układu nerwowego, a dodatkowe biomarkery poprawiające stratyfikację prognostyczną i informujące o badaniach terapeutycznych są nadal potrzebne. Badanie oceniało receptor manozowy C-typ 2 (MRC2/Endo180) poprzez integrację publicznych kohort transkryptomicznych z walidacją in vitro . Profile ekspresji i dopasowane adnotacje kliniczne zostały uzyskane z The Cancer Genome Atlas (TCGA) oraz projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) do porównań tumor–normal i przesiewowego badań pan-nowotworowych, a powiązania prognostyczne zostały dodatkowo zbadane w kohorcie chińskiego Atlasu Glejaka (CGGA). Ekspresję MRC2 oceniono w liniach komórkowych glejaka za pomocą transkrypcji odwróconej ilościowej PCR (RT-qPCR) oraz immunoblotowania, a stabilny knockdown MRC2 został ustalony w komórkach U87 i U251 przy użyciu lentiwirusowych krótkich RNA (shRNA). Wzrost i klonogenność komórek oceniano za pomocą testów CCK-8 i tworzenia kolonii, natomiast migrację i inwazję oceniano za pomocą testów z wkładką z błony porowatej. Marker β y związane z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT) związane z CDK4, CDK6 oraz markerami związanymi z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT) zostały przeanalizowane metodą immunoblotu. We wszystkich zbiorach danych MRC2 był podwyższony w glejaku, a wyższa ekspresja wiązała się z gorszym przeżyciem ogólnym, przeżyciem specyficznym dla choroby oraz bezprogresyjnym interwałem. In vitro, wyczerpanie MRC2 zmniejszało proliferację, klonogenność, migrację i inwazję, a towarzyszyło to obniżeniu poziomu białek CDK4 i CDK6 oraz zmianom markerów β-kateniny i markerów EMT. Razem te wyniki wspierają MRC2 jako kandydata prognostycznego biomarkera związanego z fenotypami agresywnych glejaka i uzasadniają dalsze badania mechanistyczne oraz in vivo .

Wprowadzenie

Glejaki stanowią najczęstsze pierwotne guzy powstające w ośrodkowym układzie nerwowym i stanowią znaczną część nowotworów wewnątrzczaszkowych ^1,2. Badania epidemiologiczne szacują częstość występowania rzędu kilku przypadków na 100 000 osób rocznie, przy czym różnice geograficzne i związane ze względu na płeć zgłaszane są w populacjach ^3,4. Klinicznie glejaki obejmują szerokie spektrum zachowań: glejaki o niższym stopniu mogą mieć przedłużony przebieg, podczas gdy choroby wysokiego stopnia — szczególnie glejak blablaściak — pozostają szybko śmiertelne dla większości pacjentów 5,6,7,8. Współczesne klasyfikacje WHO integrują histologię z kluczowymi cechami molekularnymi (np. mutacją IDH, zmianą promotora TERT, metylacją promotora MGMT oraz współdelecją 1p/19q), co upresnia diagnozę i wskazuje na rokowanie ^9,10. Pomimo leczenia wielomodalnego łączącego operację, radioterapię i chemioterapię, nawroty są częste, a długoterminowe wyniki guzów o wysokim stopniu pozostają słabe. Dlatego identyfikacja dodatkowych wskaźników prognostycznych i podatności dostępnych na celowanie pozostaje pilnym priorytetem.

MRC2 (receptor manozowy C-typ 2; znany również jako Endo180/CD280/uPARAP) jest transbłonowym członkiem rodziny receptorów lektynowych typu C¹¹. Jest wzbogacony w przedziały stromalne i immunologiczne, takie jak fibroblasty i makrofagi, oraz uczestniczy w odmianie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), remodelowaniu związanym z włóknieniem oraz interakcjach guz–mikrośrodowisko^12,13. Strukturalnie MRC2 zawiera region bogaty w cysteiny na N-zakończenie, domenę fibronektyny typu II wiążącą kolagen, wiele domen lektynowych typu C, segment transbłonowy oraz ogon cytoplazmatyczny^14,15. Dzięki internalizacji i remodelacji kolagenu MRC2 może ułatwiać ruchliwość komórek i inwazję tkanek, a podwyższony poziom MRC2 został powiązany z agresywnymi zachowaniami w kilku nowotworach, w tym piersi, trzustki, prostaty, czerniaka oraz glejaka blastasta. 11,14,16,17,18. Wcześniejsze badania sugerują również powiązania między MRC2 a programami sygnalizacji proinwazyjnej (np. szlaki związane z TGF-β), aktywnością metaloproteinazy macierzowej oraz zmianami fenotypowymi podobnymi do EMT, a także rolą w stanach fibroblastów i makrofagów związanych z rakiem 17,18,19,20,21. Jednak znaczenie kliniczne MRC2 w glejaku oraz funkcjonalne konsekwencje dysregulacji MRC2 w komórkach glejaka pozostają niejasne.

Chociaż MRC2 był powiązany z remodelacją macierzy zewnątrzkomórkowej i zachowaniami inwazyjnymi w kilku nowotworach, jego znaczenie kliniczne w glejaku nie zostało systematycznie potwierdzone w niezależnych kohortach transkryptomicznych, a jego efekty związane z fenotypem w komórkach glejaka nie zostały ocenzurowane w zintegrowanym systemie łączącym publiczną analizę zbiorów danych z walidacją funkcjonalną. Badanie to zatem wysunęło hipotezę, że MRC2 wiąże się z niekorzystnymi wynikami klinicznymi i złośliwymi fenotypami w glejaku. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zintegrowano badania przesiewowe pan-nowotworowe, niezależną walidację kohort glejaka oraz eksperymenty stabilnego knockdowna w liniach komórkowych glejaka w celu oceny prognostycznego znaczenia MRC2 oraz jego związku z proliferacją, migracją, inwazją oraz zmianami markerów związanych z β-kateniną/EMT. Ponieważ MRC2 należy do rodziny receptorów manozowych, a progresja glejaka jest również kształtowana przez mikrośrodowisko guza, dodano dodatkową analizę ekspresji MRC1 według statusu IDH, aby dostarczyć kontekstowych informacji o różnicach immunologicznych między podtypami glejaków.

Nowością tej pracy jest łączna ocena MRC2 w publicznych zbiorach danych glejaka oraz testach funkcjonalnych in vitro , co dostarcza uzupełniających dowodów klinicznych i eksperymentalnych potwierdzających jego znaczenie w glejaku. W porównaniu z analizami pojedynczych kohort lub badaniami wyłącznie na komórkach, ten zintegrowany workflow oferuje kilka praktycznych zalet. Wprowadzenie TCGA, GTEx i CGGA umożliwia walidację między kohortami i zmniejsza zależność od jednego zbioru danych. Dodatkowo, połączenie analiz kohort publicznych z testami knockdowna komórek glejaka łączy powiązania kliniczne z dowodami na poziomie fenotypu. Wreszcie, zastosowanie komplementarnych odczytów, w tym RT-qPCR, immunoblotowania, CCK-8, tworzenia kolonii oraz testów wkładek z porowatą błoną, umożliwia równoległą ocenę zmian transkrypcyjnych, poziomów białek, proliferacji i motyli. Ogólny projekt badania i proces analityczny są podsumowane na Rysunku 1. Razem ta strategia poprawia odporność i biologiczną interpretowalność wyników w odniesieniu do podejść opartych wyłącznie na bioinformatyce lub pojedynczym assay.

Protokół

W tym badaniu wykorzystano publicznie dostępne, zdezidentyfikowane zbiory danych (TCGA, GTEx i CGGA) oraz ustalone komercyjne linie komórkowe. Nie uczestniczyli w tym nowo zrekrutowani uczestnicy ludzki, identyfikowalne informacje o pacjencie ani próbki pochodzące od pacjentów. Wszystkie analizy przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi i międzynarodowymi dotyczącymi korzystania z publicznie dostępnych danych. Dlatego nie było wymagane dodatkowe zatwierdzenie etyki instytucjonalnej ani świadoma zgoda na to badanie.

1. Bioinformatyczny przepływ pracy i wstępne przetwarzanie danych

Profile ekspresji genów oraz dopasowane adnotacje kliniczne pozyskano z publicznie dostępnych źródeł, w tym The Cancer Genome Atlas (TCGA), projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) oraz Chinese Glejoma Genome Atlas (CGGA). Macierze ekspresji i metadane kliniczne zostały zaimportowane do R i ujednoliczone zgodnie z identyfikatorami próby. Usunięto duplikaty lub niedopasowane wpisy, a próbki pozbawione istotnych informacji o przeżyciu zostały wykluczone z analiz przeżycia. Wartości ekspresji MRC2 oraz odpowiadające im zmienne klinicznopatologiczne zostały wyodrębnione do analiz dalszych. Do porównań z normalnym guzem, ekspresję MRC2 porównywano między typami nowotworów, używając danych wyłącznie TCGA, gdy dostępne były dopasowane tkanki prawidłowe, oraz zintegrowanych danych TCGA–GTEx, gdy wymagane były dodatkowe kontrolne kontrolne w normie. W analizach skoncentrowanych na glejaku pacjenci z kohort TCGA-LGG i CGGA zostali podzieleni na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji zgodnie z medianą ekspresji MRC2 w kohortach. Następnie przeprowadzono analizę przeżycia Kaplana-Meiera, analizę cech operacyjnych odbiornika zależnych od czasu (ROC) oraz regresję Coxa w zakresie ryzyka proporcjonalnego, aby ocenić prognostyczną istotność MRC2. Modele Coxa obejmowały dostępne kowarianty, takie jak wiek, płeć, stopień WHO oraz inne zmienne kliniczno-patologiczne, w zależności od kompletności danych w obrębie każdej kohorty. Analizy podgrup przeprowadzono według zmiennych takich jak wiek, podtyp histologiczny, stopień WHO, status mutacji IDH, status kodletionu 1p/19q oraz informacje dotyczące leczenia, jeśli były dostępne. Dane generowano za pomocą standardowych procesów wykresów statystycznych w R i GraphPad Prism.

2. Analizy ekspresji i przeżycia pannowotworowego

Ekspresja MRC2 została porównana między tkankami nowotworowymi a normalnymi w różnych typach nowotworów przy użyciu zbiorów danych TCGA i GTEx. Różnice były wizualizowane za pomocą wykresów pudełkowych i podsumowywane za pomocą wykresów radarowych. Przeprowadzono analizy regresji Coxa proporcjonalnych zagrożeń w celu oceny zależności między ekspresją MRC2 a ogólnym przeżyciem (OS), przeżyciem specyficznym dla choroby (DSS) oraz przedziałem wolnym od progresji (PFI) w różnych typach nowotworów. Wskaźniki zagrożeń i odpowiadające im poziomy istotności zostały zwizualizowane za pomocą wykresów leśnych i map cieplnych.

3. Prognostyczna walidacja i analizy podgrupowe w kohortach glejaka

W kohorcie glejaka niższego stopnia TCGA (TCGA-LGG) pacjenci byli podzieleni na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji MRC2. Przeprowadzono analizy przeżycia Kaplana–Meiera w celu porównania OS, DSS i PFI między grupami. Opracowano krzywe charakterystyki pracy odbiornika zależne od czasu (ROC) w celu oceny wydajności predykcyjnej. Przeprowadzono jednowymiarowe i wielowartościowe analizy regresji Coxa w celu oceny niezależnej wartości prognosycznej MRC2. Zewnętrzna walidacja została przeprowadzona przy użyciu zbioru danych glejaka CGGA, w tym analizy przeżycia Kaplana–Meiera, analizy ROC oraz regresji Coxa. Analizy podgrupowe przeprowadzono w celu oceny ekspresji MRC2 we wszystkich zmiennych klinicznopatologicznych, takich jak wiek, stopień guza, podtyp histologiczny, status mutacji IDH, status kodolecji 1p/19q oraz zmienne związane z leczeniem.

4. Ekspresja MRC1 w glejakach IDH-mutantów kontra IDH-wildtype

Powiązanie między ekspresją MRC1 a statusem mutacji IDH oceniono przy użyciu platformy internetowej GlioVis oraz zbioru danych GBMLGG TCGA. Przypadki zostały pogrupowane na podstawie anotowanego statusu IDH na gleje IDH-mutantów i IDH-wild-typów. W wybranym zbiorze danych zapytano ekspresję mRNA MRC1, a poziomy ekspresji między obiema grupami porównano za pomocą wbudowanej funkcji analizy statystycznej platformy. Rozkłady wyrażeń według grup były wyświetlane jako wygenerowane przez platformę, a istotność statystyczna została zdefiniowana jako P < 0,05.

5. Hodowla komórkowa

Linie komórkowe glejaka ludzkiego oraz normalne ludzkie astrocyty zostały uzyskane z uznanych repozytoriów komórkowych. Komórki hodowano w zmodyfikowanym medium Eagle's (DMEM) Dulbecco, uzupełnionym o 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i utrzymywano w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ i około 95% wilgotności względnej. Komórki U87 i U251 zostały wybrane do eksperymentów utraty funkcji, ponieważ badania bazowe w panelu komórek glejaka wykazały, że te dwie linie komórkowe wykazują stosunkowo wyższe poziomy MRC2 i dlatego nadają się do analiz funkcjonalnych opartych na knockdownie.

6. Lentiwirusowe osłabienie MRC2

Krótkie RNA (shRNA) skierowane do MRC2 oraz grupy kontrolnej nietargetującej zostały sklonowane do wektorów lentiwirusowych. Cząstki lentiwirusowe powstawały poprzez współtransfekcję komórek HEK293T plazmidami transferowymi oraz plazmidy pakujące za pomocą standardowego odczynnika transfekcyjnego. Supernatanty wirusowe zbierano po 48 i 72 godzinach po transfekcji, wirowano w 2 100 × g przez 5 minut w celu usunięcia komórek opakujących i zanieczyszczeń, a następnie przechodziło przez filtr 0,45 μm przed natychmiastowym użyciem lub przechowywaniem w temperaturze −80 °C¹⁹. Natychmiast stosowano supernatanty zawierające wirusa lub były alicytatowane i przechowywane w temperaturze −80 °C. Unikano powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania. Komórki glejaka były zakażone cząstkami lentiwirusowymi w obecności polibrenu. Po zakażeniu komórki zostały wybrane puromycyną, aby utworzyć stabilne linie komórkowe knockdown. Użyte sekwencje były następujące: sh-MRC2-1: 5′-GAAATGAATGAGCAGCAAGAA-3′; sh-MRC2-2: 5′-CCGGTATTGCTATAAGGTGTT-3′; sh-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.

7. Walidacja obniżenia MRC2 za pomocą RT-qPCR i immunoblotting

Całkowite RNA było ekstrahowane za pomocą odczynnika TRIzol, a cDNA syntetyzowano za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta. Ilościowe PCR wykonano przy użyciu chemii SYBR Green w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s, z analizą krzywej dysocjacji wykonaną na końcu amplifikacji. Sekwencje zapłonników były następujące: MRC2 do przodu, 5′-GGCAAGGACAAGAAGTGCGTGT-3′; MRC2 reverse, 5′-CTTTGGTGACGTTGCTGCGTT-3′; GAPDH forward, 5′-TCCACCCATGGCAAATTCC-3′; oraz GAPDH reverse, 5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′. Relatywna ekspresja mRNA została obliczona metodą porównawczą C_t (2^-ΔΔCt) z GAPDH jako wewnętrzną kontrolą²⁰. Immunoblotting wykonano równolegle, aby potwierdzić knockdown MRC2 na poziomie białka. Dla RT-qPCR przeanalizowano trzy niezależne replikacje biologiczne, a każda próbka była wykonywana w technicznie trzech egzemplarzach.

8. Test proliferacji komórek

Proliferację komórek oceniono za pomocą testu CCK-8. Komórki zostały zasiewane na płytkach z 96 dołkami o odpowiedniej gęstości i hodowane przez wskazane okresy czasowe. W każdym punkcie czasowym do każdego dołku dodawano odczynnik CCK-8 i inkubowano zgodnie z instrukcjami producenta, po czym mierzono absorpcję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Przeprowadzono co najmniej trzy niezależne replikacje biologiczne.

9. Badanie formowania kolonii

Komórki były zasiewane przy niskiej gęstości do płytek sześciodołowych i hodowane przez 10–14 dni. Kolonie były utrwalane 4% paradehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej i barwione 0,1% kryształowym fioletem przez 15 minut. Kolonie były myte solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), suszone na powietrzu i liczone ręcznie lub za pomocą oprogramowania do analizy obrazów²¹. Przeprowadzono co najmniej trzy niezależne replikacje biologiczne.

10. Testy migracji i inwazji komórek

Migrację i inwazję komórek oceniono za pomocą testów z wkładką z błony porowatej²². W testach inwazyjnych górne wkładki były wstępnie pokrywane żelem macierzowym z zewnątrzkomórkową; Do testów migracji stosowano wkładki bez powłoki. Komórki zawiesione w pożywce wolnej od surowicy dodawano do górnej komory, a pożywkę zawierającą surowicę umieszczono w dolnej komorze jako chemioatraktant. Po inkubacji niemigrowane komórki na górnej powierzchni błony były delikatnie usuwane patyczką waciczną. Komórki, które przemigrowały lub przeniknęły na dolną powierzchnię, były utrwalane 4% paradehydem przez 15 minut, barwione 0,1% kryształowym fioletem przez 15 minut, płukane solą fizjologiczną z buforem fosforanowym, suszone na powietrzu i obrazowane pod mikroskopem odwróconym przy powiększeniu ×200. Komórki były liczone w pięciu losowo wybranych mikroskopowych polach na każdą inserwację. Przeprowadzono co najmniej trzy niezależne replikacje biologiczne.

11. Analiza zachodnich plam

Komórki były lizowane w buforze RIPA wzbogaconym inhibitorami proteazy, a stężenie białka określano za pomocą testu BCA. Równe ilości całkowitego białka zostały rozdzielone przez SDS-PAGE i przeniesione do błon PVDF. Błony były blokowane w mleku o stężeniu 5% bez tłuszczu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowane z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4 °C. Do western blottingu zastosowano następujące pierwotne przeciwciała i rozcieńczenia robocze: anty-MRC2 (1:5 000), anty-CDK4 (1:1 000), anty-CDK6 (1:2 000), anty-β-katenina (1:5 000), anty-E-kadheryna (1:10 000), anty-N-kadheryna (1:3 000) oraz anty-β-aktyna (1:5 000). Po myciu błony były inkubowane przeciwciałami przeciw kozam, koimi IgG w konjugowaniu z nadoksydazą chrzanu, lub przeciw królikom IgG (1:5 000) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Sygnały były wizualizowane za pomocą chemiluminescencji, a intensywności pasm były kwantyfikowane i normalizowane do β-aktyny. Przeprowadzono co najmniej trzy niezależne replikacje biologiczne.

12. Analiza statystyczna

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu R i GraphPad Prism. Krzywe przeżycia porównano za pomocą testu logarytmicznego rankingu. Do analiz jednowymiarowych i wielowymiarowych zastosowano modele regresji hazardów proporcjonalnych Coxa. W eksperymentach opartych na komórkach dane prezentowane są jako średnia ± SD. Przed testami parametrycznymi normalność oceniano za pomocą testu Shapiro–Wilk. Dla danych rozłożonych normalnie różnice między dwiema grupami oceniano za pomocą testu Student's t, a porównania między wieloma grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej metody ANOVA. Jeśli założenia normalności nie były spełnione, stosowano odpowiednie testy nieparametryczne. Wartości p zostały skorygowane dla wielokrotnych testów przy użyciu procedury fałszywego wykrywania Benjaminiego–Hochberga^23,24. Statystycznie uznano dwustronne P < 0,05.

Wyniki

Ekspresja pan-nowotworowa i prognostyczny krajobraz MRC2
Najpierw przeprowadzono analizy pan-nowotworowe, aby scharakteryzować wzorzec ekspresji i prognostyczne znaczenie MRC2 dla ludzkich nowotworów. Porównania oparte na zbiorach danych TCGA i GTEx wykazały, że ekspresja MRC2 różniła się istotnie między tkankami nowotworowymi a normalnymi w wielu typach nowotworów (Rysunek 2A, 2B). Podsumowanie wykresu radarowego dodatkowo ilustrowało szerokie zróżnico...

Dyskusja

Standardowa terapia glejaka opiera się na maksymalnej bezpiecznej resekcji, a następnie radioterapii i chemioterapii, najczęściej temozolomidu⁴. Niemniej jednak infiltracja rozlana często ogranicza całkowite usunięcie chirurgiczne i przyczynia się do nieuniknionego nawrotu, szczególnie w chorobach wysokiego stopnia ^3,25. Kilka cech molekularnych — w tym metylacja promotora MGMT, mutacja IDH, współdelecja 1p/19q oraz zmiany EGFR — są wykorz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-CDK4	Proteintech Group, Inc., USA	11026-1-AP	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2078702.
przeciwciało anty-CDK6	Proteintech Group, Inc., USA	66278-1-Ig	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2881661.
Przeciwciało anty-E-kadheryna	Proteintech Group, Inc., USA	20874-1-AP	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi. RRID: AB_10697811.
przeciwciało przeciwciało anty-MRC2	Proteintech Group, Inc., USA	86028-1-RR	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2879692.
przeciwciało przeciwciało przeciw N-kadherynie	Proteintech Group, Inc., USA	22018-1-AP	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2813891.
Przeciwciało anty-beta;-aktyna	Proteintech Group, Inc., USA	66009-1-Ig	Przeciwciało kontrolujące ładunek dla western blotting. RRID: AB_2687938.
Przeciwciało anty-β-katenina	Proteintech Group, Inc., USA	51067-2-AP	Główne przeciwciało przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2086128.
Zestaw do testowania białka BCA	Beyotime Biotechnology, Chiny	P0012	Zestaw do testowania białka BCA do określania stężenia białka.
Zestaw do Liczenia Komórek-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories, Japonia	CK04-500T	Test żywotności/proliferacji komórek.
System obrazowania chemiluminescencyjnego	Uvitec Limited, Francja	Podręcznik Sojuszu Q9 Zaawansowany	System akwizycji obrazu do wykrywania zachodnich plam.
Inkubator CO2	Uniwersalny sprzęt laboratoryjny	Nieokreślona	Nawilżony CO2 inkubator stosowany do hodowli komórek w temperaturze 37 & °F; C i 5% CO2.
Roztwór kryształowego fioletu (0,1%)	Beyotime Biotechnology, Chiny	C0121-100 mL	Roztwór barwienia fioletowego kryształu stosowany w stężeniu 0,1% roboczym.
DMEM, wysoki poziom glukozy	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	C11995500BT	Podstawowe pożywki do hodowli komórek glejaka.
Serum bydła płodu (FBS)	ExCell Bio, Chiny	FSP500	Suplement surowicy do hodowli komórek.
GlioVis	gliovis.bioinfo.cnio.es	Nie dotyczy	Internetowa platforma do wizualizacji i analizy zbiorów danych dotyczących ekspresji guzów mózgu, szczególnie glejaków.
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad, USA	Wersja 10.4.0	Oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów. RRID: SCR_002798.
HEK293T komórki	Kolekcja Kultury Typowej Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny	GNHu43	Opakowanie linii komórkowej używanej do produkcji lentiwirusów. RRID: CVCL_0063.
Kozi anty-myszy IgG (H+L) sprzężony z HRP	Proteintech Group, Inc., USA	SA00001-1	Przeciwciało wtórne przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2722565.
Kozi antykróliczy IgG (H+L) sprzężony z HRP	Proteintech Group, Inc., USA	SA00001-2	Przeciwciało wtórne przeciwko western blottingowi. RRID: AB_2722564.
Astrocyty ludzkie	Kolekcja Kultury Typowej Chińskiej Akademii Nauk, Szanghaj, Chiny	Niepublicznie dostępne	Normalne ludzkie astrocyty używane jako kontrola nie-nowotworowa; Numer katalogowy niedostępny publicznie.
Mikroskop odwrócony	Uniwersalny sprzęt laboratoryjny	Nieokreślona	Odwrócony mikroskop używany do pozyskiwania obrazów w testach migracji i inwazji.
Macierz matrigelowa	Corning, USA	354234	Matryca błony podstawowej używana do pokrywania wkładów do testów inwazyjnych.
Czytnik mikropłyt	Uniwersalny sprzęt laboratoryjny	Nieokreślona	Czytnik mikropłyt używany do pomiaru absorpcji przy 450 nm w testach CCK-8.
Zestaw do przygotowania żelu PAGE, 10%	EpiZyme, Chiny	PG212	Zestaw do przygotowania żelu SDS-PAGE.
Zestaw do przygotowania żelu PAGE, 7,5%	EpiZyme, Chiny	PG111	Zestaw do przygotowania żelu SDS-PAGE.
Roztwór paraformaldehydu (4%)	Beyotime Biotechnology, Chiny	P0099-100 mL	4% paraformaldehydu utrwalający testy do tworzenia kolonii oraz migracji/inwazji.
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	15140163	Suplement antybiotykowy do hodowli komórek.
Polibrene	Beyotime Biotechnology, Chiny	C0351-1 mL	Roztwór bromku heksadymetaryny (10 mg/mL) używany do ułatwiania transdukcji lentiwirusowej.
Prebarwiony marker białkowy	Elabscience, Chiny	E-IR-R331	Białkowy marker masy cząsteczkowej.
PrimeScript RT Reagent Kit	Takara Bio Inc., Japonia	RR047A	Zestaw do odwrotnej transkrypcji do syntezy cDNA.
Puromycyna	Beyotime Biotechnology, Chiny	ST551-10 mg	Puromycyna dihydrochlorkowa używana do selekcji stabilnych komórek knockdown.
Membrana PVDF	Beyotime Biotechnology, Chiny	FFP20	Hydrofilowa membrana PVDF (0,45 & mikro; m) do zachodniego transferu blot.
R	Fundacja R ds. Obliczeń Statystycznych, Austria	Wersja 4.5.1	Środowisko obliczeń statystycznych wykorzystywane do analiz bioinformatycznych. RRID: SCR_001905.
Bufor lizy RIPA	Beyotime Biotechnology, Chiny	P0013B	Mocny bufor lizy RIPA do ekstrakcji białek.
Bufor ładowania SDS-PAGE (5&razy;)	Beyotime Biotechnology, Chiny	P0015L	Bufor ładowania próbki białkowej.
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Bio Inc., Japonia	RR066A	mikser qPCR.
Wkłady transwellowe, 8.0-µ Rozmiar porów m	Corning, USA	3422	Wkładki do hodowli komórkowych z 8.0 & mikro; poliwęglanowa membrana o rozmiarze poru m; Standardowy format 24-dołkowy do testów migracji i inwazji.
Odczynnik TRIzol	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, USA	10296010CN	Czynnik do ekstrakcji RNA.
Komórki glejaka U251	Narodowa Kolekcja Autentycznych Kultur Komórkowych, Chiny	SCSP-559	Linia komórkowa ludzkiego glejaka używana do testów knockdownowych i funkcjonalnych. RRID: CVCL_0021.
Komórki glejaka U87	Narodowa Kolekcja Autentycznych Kultur Komórkowych, Chiny	SCSP-5432	Linia komórkowa ludzkiego glejaka używana do testów knockdownowych i funkcjonalnych. RRID: CVCL_0022.