Wpływ regulacji ekspresji SPRY2 i miR-590-5p na autofagię w ludzkich chondrocjach z modelu osteoartrozy

Podsumowanie

Stres zapalny w modelu chondrocytów C28/I2 wywołanym IL-1β zwiększył ekspresję miR-590-5p i zmniejszył ekspresję SPRY2. Modulacja tej osi zmieniła ekspresję Beclin-1, LC3-II i Bcl-2, co sugeruje hipotetyczną ścieżkę regulacyjną miR-590-5p/SPRY2, która może wpływać na odpowiedzi związane z autofagią i przeżywalność chondrocytów w osteoartrozie.

Streszczenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest rozpowszechnioną chorobą zwyrodnieniową stawów charakteryzującą się progresywnym niszczeniem chrząstki i utratą homeostazy chondrocytów. Chociaż dysregulacja autofagii przyczynia się do patogenezy OA, mechanizmy molekularne rządzące reakcjami związanymi z autofagia w chondrocytach pozostają niedostatecznie poznane. Niniejsze badanie zbadał rolę osi regulacyjnej miR-590-5p/SPRY2 w zapalnym mikrośrodowisku OA za pomocą ludzkich chondrocytów C28/I2 indukowanych IL-1β. Model OA in vitro został ustanowiony poprzez leczenie komórek C28/I2 IL-1β. Ekspresję miR-590-5p i SPRY2 oceniono za pomocą ilościowej PCR i Western blottingu. Zastosowano podejście zysku i utraty funkcji, aby ocenić wpływ SPRY2 i miR-590-5p na markery związane z autofagia Beclin-1 i LC3-II, a także białko związane z przeżyciem Bcl-2. Analizę bioinformatyczną i eksperymenty ratunkowe wykorzystano do zbadania relacji regulacyjnej między miR-590-5p a SPRY2. Leczenie IL-1β znacząco zwiększyło ekspresję miR-590-5p, jednocześnie zmniejszając poziomy mRNA i białka SPRY2 (P < 0,05). Przewlekła nadekspresja SPRY2 znacząco zmniejszyła ekspresję Beclin-1 i LC3-II, ze zmniejszeniem odpowiednio o około 65% i 77% (P < 0,05). W przeciwieństwie do tego, przewlekła nadekspresja miR-590-5p zwiększyła ekspresję Beclin-1, LC3-II i Bcl-2, podczas gdy inhibicja miR-590-5p odwróciła te efekty i przywróciła ekspresję SPRY2. Analizy funkcjonalne potwierdziły SPRY2 jako domniemany dolny strumieniowy cel regulatorowy miR-590-5p. Te odkrycia identyfikują oś miR-590-5p/SPRY2 jako ważny regulator ekspresji markerów związanych z autofagia i przeżycia chondrocytów w warunkach zapalnych oraz sugerują jej potencjalne znaczenie jako cel terapeutyczny w OA.

Wprowadzenie

Jakoż najczęstsza forma artretyzmu na całym świecie, choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest główną przyczyną bólu, upośledzenia ruchomości i niepełnosprawności fizycznej, obciążając znacznie systemy opieki zdrowotnej i społeczeństwo¹. Patologicznie OA charakteryzuje się postępującą degeneracją chrząstki stawowej, zapaleniem błony maziowej i patologiczną przebudową kości podstawnej chrząstki¹. Szacunki epidemiologiczne wskazują, że około 303 milionów osób na całym świecie jest dotkniętych OA, a liczba ta ma wzrosnąć wraz z starzeniem się populacji i wzrostem otyłości². W Chinach szacunkowa częstość występowania objawowego OA kolan wynosi 8,1%, przy czym znacznie wyższa częstość występowania obserwuje się u kobiet i ludności wiejskiej³. Mimo wysokiej częstości występowania, obecne opcje leczenia są w dużej mierze ograniczone do zarządzania objawami poprzez leki niesteroidowe przeciwzapalne (NLPZ) oraz interwencji chirurgicznej w zaawansowanej chorobie⁴. Brak leków modyfikujących przebieg osteoartretyzmu (DMOAD) odzwierciedla niepełne zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących homeostazę i przetrwanie chondrocytów⁵.

Struktura i funkcjonalność chrząstki stawowej zależy od rezydentnych chondrocytów, które utrzymują obrót macierzy pozakomórkowej (ECM) poprzez równowagę między procesami anabolicznymi i katabolicznymi⁶. Podczas progresji OA, chondrocyty są narażone na nienormalne obciążenia mechaniczne i prozapalne mediatory, szczególnie interleukina-1β (IL-1β) i czynnik nekrozy nowotworu-α (TNF-α), które sprzyjają przejściu z syntezy macierzy do degradacji macierzy⁶. IL-1β przyczynia się do zniszczenia chrząstki poprzez stymulację produkcji metaloproteinaz macierzy (MMP) i agregakan, a jednocześnie hamuje syntezę kolagenu typu II i proteoglikanów⁷. Dodatkowo, IL-1β indukuje stres oksydacyjny i dysfunkcję mitochondriów, prowadząc do apoptozy i starzenia się chondrocytów⁸. W konsekwencji, identyfikowanie wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych regulujących przetrwanie chondrocytów w warunkach zapalnych pozostaje priorytetem w badaniach nad OA.

Autofagia jest ewolucjonującą ścieżką degradacji lizosomalnej, która utrzymuje homeostazę komórkową poprzez usuwanie i recykling uszkodzonych organelli i agregatów białkowych⁹. Bazalna autofagia jest niezbędna dla przetrwania komórkowego i równowagi energetycznej; jednak dysregulowany proces autofagii może przyczyniać się do progresji choroby⁹. W OA autofagia jest ogólnie uważana za ochronną reakcję, która pomaga chondrocytom adaptować się do stresu komórkowego i opierać się apoptozie¹⁰. Poprzednie badania sugerują, że aktywność autofagiczna maleje w trakcie progresji OA, szczególnie w zaawansowanych stadiach choroby, prowadząc do upośledzonej kontroli jakości komórkowej i zwiększonej utraty chondrocytów¹¹. Kilka białek jest powszechnie stosowanych jako wskaźniki aktywności związanej z autofagią. Beclin-1 uczestniczy w inicjacji autofagosomu, podczas gdy konwersja białka związanego z mikrotubulami 1 łańcucha lekkiego 3 (LC3-I do LC3-II) jest szeroko stosowana jako marker formowania autofagosomu¹². Natomiast białko limfoma komórek B2 (Bcl-2) hamuje autofagię zależną od Beclin-1, jednocześnie wywierając efekty anty-apoptotyczne¹³. Mimo to, interpretacja wskaźników związanych z autofagią wymaga ostrożności, ponieważ statyczne pomiary LC3-II i Beclin-1 nie mogą niezależnie odróżnić zwiększonego formowania autofagosomu od upośledzonej degradacji lizosomalnej. Mimo tych ograniczeń, modulacja szlaków związanych z autofagią pozostaje obiecującą strategią terapeutyczną w OA.

MikroRNA (miRNA) to krótkie niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów po transkrypcyjnie poprzez wiązanie się z komplementarnymi sekwencjami w obrębie regionów 3'-niekodujących (3'-UTR) docelowych RNA ribonukleotydowych, prowadząc do degradacji mRNA lub represji translacji¹⁴. Aberracyjna ekspresja miRNA została związana z patogenezą OA poprzez wpływ na stan zapalny, apoptozę i remodelowanie ECM¹⁵. Wśród tych molekuł, miR-590-5p przyciągnęło uwagę ze względu na jego regulacyjne role w metabolizmie kostnym i inne procesy patologiczne. Poprzednie badania wykazały, że miR-590-5p promuje różnicowanie osteogenne i hamuje adipogenezę w komórkach macierzystych mezenchymalnych¹⁶. W modelach nowotworowych, miR-590-5p wykazuje funkcje uzależnione od kontekstu jako regulator onkogenny lub supresor nowotworowy¹⁷. Ponadto, zmienione profile ekspresji mikroRNA, w tym członkowie rodziny miR-590, zostały związane z patologiczną przebudową tkanek stawowych podczas OA¹⁸. Jednak dowody uzyskane z modeli komórek macierzystych lub nowotworowych nie mogą

Protokół

To badanie przeprowadzono wyłącznie przy użyciu komercyjnie dostępnej linii komórek chondrocytów ludzkich C28/I2. W badaniu nie było zaangażowanych ludzkich uczestników, próbek tkanki ludzkiej, materiałów pochodzących od pacjentów ani żywych zwierząt. Dlatego zatwierdzenie Komisji Etycznej (IRB) oraz Komisji Opieki nad Zwierzętami (IACUC) nie było wymagane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi. Narzędzia, chemikalia, zestawy i odczynniki użyte w protokołach są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla komórek i konstrukcja modelu OA 

Ludzka linia komórek chondrocytów C28/I2 (szczegóły podane w Tabeli materiałów) została uzyskana od komercyjnego dostawcy. Aby zapewnić reproduktywalność eksperymentu, komórki zostały uwierzytelnione za pomocą profilowania krótkich tandemowych powtórzeń (STR) i rutynowo testowane w celu potwierdzenia braku skażenia mykoplazmą. Do wszystkich eksperymentów wykorzystywano komórki między przeszczepami 3 a 8. Komórki były utrzymywane w DMEM uzupełnionym o 10% fetalne surowce krwi wołowej (FBS) i 1% penicylinę-streptomycynę (wszystkie odczynniki hodowlane są szczegółowo opisane w Tabeli materiałów) w 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂.

Aby stworzyć in vitro model osteoartrozy (OA), komórki C28/I2 zostały stymulowane rekombinowanym ludzkim IL-1β. Na podstawie ustanowionej literatury^6,7, wstępnych eksperymentów optymalizacji dawki-odpowiedzi zaprojektowanych w celu wywołania wyraźnego stanu katabolizmu bez nadmiernej natychmiastowej cytotoksyczności, komórki były traktowane 20 ng/mL IL-1β przez 24 godziny.

2. Grupowanie eksperymentalne i transfekcja 

Aby wyjaśnić mechanizmy, badanie zostało podzielone na trzy główne moduły eksperymentalne, z których każdy posiadał co najmniej trzy niezależne biologiczne repliki:

1. SPRY2 Zysk/utrata funkcji:
   Komórki zostały przypisane do grupy Kontrolnej, modelu OA, OA + pusty wektor (NC), OA + nadekspresja plazmidu SPRY2 (OE-SPRY2) oraz odpowiadających grup małej interferencyjnej RNA (si-NC i trzech specyficznych konstrukcji si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) w celu przesiewu skuteczności interferencji.
2. Modulacja miR-590-5p:
   Komórki zostały podzielone na grupy Kontrolne, model OA, OA + imitator NC, OA + imitator miR-590-5p, OA + inhibitor NC oraz OA + inhibitor miR-590-5p.
3. Walidacja funkcjonalna relacji regulacyjnej miR-590-5p/SPRY2:
   Aby dalece oceniać proponowaną relację regulacyjną między miR-590-5p i SPRY2, komórki były poddawane warunkom imitatora miR-590-5p i inhibitora, aby ustalić, czy modulacja miR-590-5p zmieniła ekspresję SPRY2 w modelu OA.
   Do transfekcji, komórki C28/I2 zostały zasiano w 6-dołkowych płytkach w liczbie 2 × 10⁵ komórek/dołek. Po osiągnięciu 70-80% konfluencji, transfekcje przeprowadzono przy użyciu komercyjnego lipidowego środka transfekcyjnego zgodnie z protokołem producenta i ustalonymi procedurami dostarczania małej RNA w chondrocitach²⁴. Krótko mówiąc, plazmidy (OE-SPRY2 i NC; 2 μg/dołek) oraz oligonukleotydy (imitacja/inhibitor miR-590-5p i siRNA; 50 nM) były rozcieńczane w środowisku z obniżoną zawartością surowca. Kompleksy lipid-DNA/RNA inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed dodaniem kroplowo do komórek w środowisku DMEM bez surowca. 6 godzin po transfekcji, środowisko zostało zastąpione pełnym DMEM zawierającym 10% FBS, a komórki były hodowane przez kolejne 48 godzin przed ekstrakcją RNA i białka.

3. Wykrywanie qPCR

Całkowite RNA i miRNA zostały izolowane za pomocą dedykowanego zestawu ekstrakcyjnego miRNA zgodnie z protokołem producenta. Czystość i stężenie RNA oceniono za pomocą spektrofotometru UV-Vis, a próbki o stosunku A260/A280 wynoszącym 1,8–2,0 zostały wykorzystane do dalszych analiz. Do syntezy cDNA zastosowano komercyjne odczynniki do odwrotnej transkrypcji. Procedura cyklu qPCR przebiegała następująco: 95 °C przez 10 min; 40 cykli po 95 °C przez 10 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; a następnie analizę krzywej topienia w celu zweryfikowania specyficzności primerów i braku dimeryzacji primerów. β-Aktyna i U6 służyły jako kontrole wewnętrzne dla mRNA i miRNA, odpowiednio. Względna ekspresja genów została obliczona metodą 2-^ΔΔCt25. Wszystkie sekwencje primerów, w tym te dla Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p oraz genów referencyjnych, są wymienione w Tabeli 1.</

Wyniki

Ustanowienie modelu zapalnego chrzęstkowców in vitro

Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw patologii osteoartrozy, stworzono in vitro model zapalny za pomocą ludzkich chrzęstkowców C28/I2 stymulowanych IL-1β. Ważność tego modelu została potwierdzona poprzez ocenę ekspresji łańcucha kolagenu typu II alfa 1 (Col-II), głównego składnika zewnątrzkomórkowej matrycy chrząstki hialinowej i charakterystycznego dla zdrowych chrzęstkowców. Analiza ilościowa wykazała, że ekspozycja na IL-1β prowadziła do statystycznie istotnego zmniejszenia ekspresji mRNA Col-II w porównaniu z grupą kontrolną. Ta zmiana fenotypowa wskazuje na początkową zmianę ku stanowi katabolicznemu przypominające osteoartretyczne środowisko, zapewniając tym samym podstawowy model do dalszych badań mechanistycznych (Rycina 1).

Rycina 1: Ustanowienie in vitro modelu osteoartrozy (OA) w ludzkich chrzęstkowcach C28/I2. Komórki były traktowane 20 ng/mL IL-1β przez 24 godziny. Względna ekspresja mRNA Col-II została określona za pomocą qPCR, przy czym β-aktyna służyła jako kontrola normalizacji. Dane są przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) z trzech niezależnych biologicznych powtórzeń (n = 3). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji. *P < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Walidacja efektywności przewlekania SPRY2 w komórkach C28/I2

Przed oceną funkcjonalnej roli Sprouty2 (SPRY2) w tym modelu, zweryfikowano efektywność transfekcji wektora przewlekania SPRY2. Chrzęstkowce zostały przewleczone za pomocą plazmidu przewlekania (OE) lub ujemnego wektora kontrolnego (NC). Zarówno analizy qPCR, jak i Western blot wykazały znaczne zwiększenie ekspresji SPRY2 na poziomie mRNA i białka w grupie OE w porównaniu z grupami NC i nietraktowanymi kontrolnymi. Te dane, przedstawione na Rycinie 2, potwierdzają, że system eksperymentalny utrzymywał podwyższony poziom SPRY2, umożliwiając badanie jego specyficznych efektów biologicznych.

Rycina 2: Walidacja przewlekania SPRY2 w chrzęstkowcach C28/I2. Komórki zostały przewleczone zarówno ujemnym wektorem (NC), jak i plazmidem przewlekania SPRY2 (OE). Względne poziomy mRNA i białka SPRY2 zostały oceniane za pomocą qPCR i Western blot, odpowiednio. β-aktyna została wykorzystana jako wewnętrzna kontrola ładowania. Dane są wyrażone jako średnia ± SD (n = 3). *P < 0,05 w porównaniu z grupą NC. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Przewlekanie SPRY2 tłumi autofagię i modyfikuje markery apoptozy w warunkach zapalnych

Następne eksperymenty miały na celu określenie, czy SPRY2 działa jako regulator autofagii i apoptozy w kontekście zapalnym. Po ustanowieniu modelu OA, sama stymulacja IL-1β wywołała znaczny wzrost poziomów markerów autofagii Beclin-1 i LC3-II, sugerując kompensacyjną odpowiedź autofagiczną na stres zapalny. Jednocześnie ekspresja Bcl-2 była podwyższona w grupie modelowej. Jednakże wprowadzenie wektora przewlekania SPRY2 znacząco zmieniło ten profil. Jak pokazano na Rycinie 3, grupa Model+OE-SPRY2 wykazała istotne zmniejszenie poziomów mRNA Beclin-1 i LC3-II w porównaniu z grupami Model i Model+NC. Co więcej, przewlekanie SPRY2 tłumiło podwyższenie Bcl-2 indukowane przez zapalenie. Te wyniki sugerują, że SPRY2 negatywnie reguluje ekspresję markerów związanych z autofagia w zapalnych chrzęstkowcach.

Rycina 3: Przewlekanie SPRY2 tłumi autofagię i modyfikuje markery apoptozy w warunkach zapalnych indukowanych przez IL-1β. Względna ekspresja mRNA SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 i LC3-II została zmierzona za pomocą qPCR w grupach Kontrolna, Model (leczona IL-1β), Model+NC i Model+OE-SPRY2. β-aktyna służyła jako wewnętrzna kontrola. Dane są przedstawione jako średnia ± SD (n = 3). Znaczenie statystyczne zostało określone za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji po analizie post hoc S-N-K.

Dyskusja

Poprzednie badania wykazały, że miRNA regulują autofagię na wielu etapach, w tym inicjację, wydłużanie wezykuł i dojrzewanie²⁷. Udział miRNA w patogenezie OA jest coraz częściej dokumentowany, szczególnie poprzez wpływ na stan zapalny, apoptozę, remodelację macierzy zewnątrzkomórkowej i szlaki związane z autofagią. miR-590-5p zostało powiązane z homeostazą komórkową i procesami związanymi z rakiem^28,29,30. W kontekście kostnym i związanym z chrząstką, stwierdzono, że miR-590-5p promuje chondrogeniczną różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych 16, podczas gdy w modelach chondrocytów OA, może regulować proliferację, apoptozę i odpowiedzi zapalne poprzez targetowanie FGF^18,24. Jednak nie jest jasne, czy miR-590-5p wpływa na odpowiedzi związane z autofagią w chondrocytach OA.

Dlatego do zbadania potencjalnych mediatorów poniżej zostały użyte RNAInter i TargetScan, a obie analizy sugerowały SPRY2 jako putatywny docelowy miR-590-5p-skojarzony. TargetScan Human 7.1^31,32 zidentyfikowało przewidywane miejsce wiązania 8mer seed-region w nukleotydach 236–243 SPRY2 3′-UTR (Rysunek 6). SPRY2 jest negatywnym regulatorem sygnałowania receptora tyrozynowych kinaz/MAPK i jest ekspresowany w wielu tkankach¹⁹. Podawanie genu SPRY2 do stawu zostało zgłoszone jako zmniejszające artretyzm wywołany adjuvantem u szczurów²¹. Przewlekła nadekspresja SPRY2 może hamować wzrost komórek, inwazję, migrację i cytokineza pośredniczoną przez HGF/SF³³, podczas gdy utrata funkcji Spry2 została związana z nadmiernym aktywowaniem MAPK-ERK i zwiększoną proliferacją komórek B³⁴. SPRY2 został również zaangażowany w regulację związaną z apoptozą²², kontrolę migracji powiązaną z miRNA³⁵ oraz odpowiedzi związane z autofagią w modelach niedokrwienia²³. Razem, te badania wspierają SPRY2 jako węzeł regulacyjny łączący sygnałowanie zapalne, szlaki związane z przetrwaniem i odpowiedzi związane z autofagią.

Biorąc pod uwagę wcześniej niezgłaszane związki pomiędzy miR-590-5p a SPRY2 w chondrocytach OA, bioinformatyczne przewidywanie ich potencjalnej interakcji zainicjowało dalsze badania eksperymentalne. Obecne wyniki wykazały, że SPRY2 był znacząco zdewaluowany podczas gdy miR-590-5p było nadekspresowane w chondrocytach C28/I2 stymulowanych IL-1β, co implikuje tę oś w reakcji chondrocytów zapalnych. Funkcyjnie, przewlekła nadekspresja SPRY2 zmniejszała ekspresję Beclin-1 i LC3-II, co wspiera efekt hamujący na ekspresję markerów związanych z autofagią. Odwrotnie, hamowanie miR-590-5p zmniejszyło ekspresję Beclin-1 i Bcl-2 i przywróciło ekspresję SPRY2, co jest zgodne z putatywnym odwrotnym związkiem regulacyjnym. Ponieważ Bcl-2 może hamować autofagię zależną od Beclin-1, jednocześnie wykazując efekty przeciwzapalne13, jednoczesne podniesienie Bcl-2 z Beclin-1 i LC3-II powinno być interpretowane w sposób specyficzny dla kontekstu. W tym zapalnym modelu OA, wzrost Bcl-2 może przede wszystkim odzwierciedlać odpowiedź anty-apoptotyczną związaną z przetrwaniem, podczas gdy zwiększona ekspresja Beclin-1 i LC3-II może odzwierciedlać ulgę w supresji związanej z SPRY2. Te wyniki sugerują model, w którym miR-590-5p koordynuje sygnałowanie związane z przetrwaniem chondrocytów i ekspresję markerów autofagii poprzez hamowanie SPRY2 podczas stresu zapalnego.

Chociaż to badanie zapewnia cenny wgląd w mechanizmy osi miR-590-5p/SPRY2, kilka ograniczeń powinno być uznane. Po pierwsze, wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w 2D systemie in vitro przy użyciu umiędzywiórzonej linii komórek C28/I2. Ten uproszczony model nie może w pełni odtworzyć stresu biomechanicznego, interakcji wielokomórkowych i środowiska zapalnego chrząstki stawowej in vivo, co ogranicza natychmiastową przydatność translacyjną wyników. Po drugie, choć przewidywania bioinformatyczne i eseje ratunkowe wspierają putatywny związek regulacyjny pomiędzy miR-590-5p a SPRY2, brak dualnego reportera luciferase uniemożliwia ostateczne potwierdzenie bezpośredniego wiązania fizycznego pomiędzy miR-590-5p a SPRY2 3′-UTR. Po trzecie, statyczne pomiary Beclin-1 i LC3-II nie mogą odróżnić zwiększonego tworzenia autofagosomów od upośledzonej degradacji autolizosomalnej; dlatego przyszłe badania powinny oceniać przepływ autofagii przy użyciu podejść takich jak leczenie Bafylomycyną A1 lub tandemowe testy reporterowe fluorescencyjne. Przyszłe prace powinny również obejmować szerszy panel markerów fenotypu OA (np. MMP13 i ADAMTS5), pierwotne ludzkie chondrocyty, 3D modele eksplantacji chrząstki i in vivo modele OA, takie jak destabilizacja

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Wewnętrzna kontrola ładowania dla analizy Western blot
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	Wykrywanie ekspresji białka SPRY2
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Oznaczanie stężenia białek całkowitych
C28/I2 human chondrocyte cell line	Punocel	CP-H107	In vitro model chondrocytów do badań nad osteoartrozą
Complete DMEM	KeyGen Biotec	KGM12800S	Podstawowe medium do rutynowej hodowli komórek
CWBIO Ultrapure miRNA extraction kit	CWBIO	CW0627S	Izolacja całkowitego RNA i miRNA
ECL detection system	Thermo Fisher Scientific	32106	Chemiluminescencyjne wizualizowanie pasm białkowych
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	1891605	Suplement hodowli komórek
GraphPad Prism version 9.0	GraphPad Software	N/A	Analiza statystyczna i generowanie wykresów
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	Odwrotna transkrypcja mRNA na cDNA
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	Ilościowa ocena intensywności pasm Western blot
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Transfekcja plazmidów i oligonukleotydów
miR-590-5p mimic, inhibitor, and NCs	RiboBio	Syntetyzowane na zamówienie	Modulacja ekspresji miR-590-5p
miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Vazyme	MR101-02	Odwrotna transkrypcja miRNA na cDNA
Opti-MEM medium	Gibco	31985-062	Przygotowanie kompleksów transfekcyjnych
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Profilaktyka zakażeń bakteryjnych w hodowli komórek
Protease and phosphatase inhibitor cocktails	MedChemExpress	HY-K0010	Ochrona białek podczas ekstrakcji
PVDF membranes	Millipore Sigma	ISEQ00010	Membran do transferu białek do immunoblottingu
Recombinant human IL-1β	MedChemExpress	HY-P78459	Indukcja stanów zapalnych przypominających OA
RIPA buffer	Beyotime	P0013B	Lizys komórek i ekstrakcja białek
si-SPRY2 constructs and si-NC	GenePharma	Syntetyzowane na zamówienie	Knockdown ekspresji SPRY2
SPRY2 overexpression plasmid (OE) and empty vector (NC)	GeneChem	Syntetyzowane na zamówienie	Ocena efektów nadekspresji SPRY2
UV-VIS spectrophotometer (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Pomiar stężenia i czystości RNA