Wizualizacja i ilościowa parowanie baz międzycząsteczkowych RNA w klastrach in vitro z wykorzystaniem raporterów RNA brokułów podzielonych

Summary

Protokół ten opisuje wizualny test z wykorzystaniem rozdzielonych reporterów RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro.

Abstract

Klasteryzacja RNA, napędzana wielocząsteczkowymi interakcjami RNA–RNA, może zachodzić in vitro bez obecności białek. Chociaż do przewidywania tych interakcji stosowano sondowanie chemiczne i symulacje obliczeniowe, metody bezpośredniej oceny parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA pozostają ograniczone. Niniejsze badanie przedstawia wizualny test oparty na rozdzielonych raportach RNA brokułów sprzężonych z fluorescencyjnie oznakowanymi RNA, które są interesujące. Test umożliwia wykrywanie i ilościowe określenie parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA. Układ rozszczepiony brokułów zawiera komplementarne sekwencje reporterowe, które dimeryzują, tworząc aptamer RNA brokułów. Powstała struktura dimeryzowanego RNA wiąże DFHBI-1T, fluorofor, który emituje zieloną fluorescencję podczas wiązania. Po klastrzowaniu RNA pojawienie się zielonej fluorescencji wskazuje na parowanie baz pośredniczone przez komplementarne sekwencje raportowe wśród interesujących RNA. Pomiar fluorescencji DFHBI-1T umożliwia ilościową ocenę, jak warunki klasteryzacji RNA in vitro wpływają na parowanie zasad międzycząsteczkowych między tymi sekwencjami reporterowymi.

Introduction

RNA transkrybowane in vitro mogą samoorganizować się w widoczne skupiska po dodaniu soli i odczynników do stłoczenia molekularnych ^1,2,3,4,5. Warto zauważyć, że te klastry RNA mogą powstawać bez innych składników komórkowych, w tym białek, co wskazuje, że w określonych warunkach interakcje międzycząsteczkowe RNA–RNA są wystarczające, by napędzać kondensację RNA in vitro.

Spośród różnych typów interakcji międzycząsteczkowych RNA–RNA, parowanie zasad międzycząsteczkowych zyskało znaczną uwagę w dziedzinie kondensatu 1,2,4,6,7,8,9,10. Interakcje te mogą być wywoływane przez odsłonięte komplementarne sekwencje ("kody pocztowe") między transkrypcjami, co wykazano przez współklasteryzację mRNA BNI1 i SPA2 w grzybie włóknistym Ashbya gossypii² lub oligomerizację mRNA oskara u Drosophila melanogaster ^6,7. Alternatywnie, parowanie zasad międzycząsteczkowych można promować poprzez przebudowę wtórnych struktur RNA, odsłaniając sekwencje komplementarne, które w innym przypadku byłyby strukturalnie osadzone. Mechanizm ten zaobserwowano w powtarzających się RNA in silico⁹ oraz w ribotoswitchach guanidyny in vitro¹⁰. Zarówno odsłonięte sekwencje komplementarne, jak i strukturalne remodelowanie RNA można mierzyć za pomocą sondowania chemicznego^11,12 lub podejść symulacyjnych ^4,9,13,14. Jednak metody bezpośrednio wizualizujące parowanie zasad międzycząsteczkowych w testach klastrowania RNA in vitro pozostają ograniczone.

Testy RNA pull-down z użyciem krzyżowych krzyżyków z parowaniem zasad 15,16,17 oraz elektroforezy żelowej ^4,6,7 są powszechnie stosowane do badania parowania zasad międzycząsteczkowego RNA in vitro. Jednak te metody nie mają wystarczającej rozdzielczości przestrzennej, by odróżnić parowanie zasad wewnątrz klastrów od tych poza nimi. Ponadto izolacja klastrów RNA do analizy dalszej jest technicznie trudna, ponieważ wymaga zachowania stabilności klastrów przy jednoczesnym zapewnieniu zgodności buforowej z kolejnymi testami.

Wcześniej stosowano wizualny test oparty na rozdzielonych reporterach RNA brokułów¹⁸ sprzężonych z fluorescencyjnie znakowanymi RNA, które go interesują, aby umożliwić bezpośrednie wykrywanie parowania zasad międzycząsteczkowych podczas kondensacji RNA in vitro⁴. W tym kontekście system podzielonego brokuła informuje o prawdopodobieństwie interakcji międzycząsteczkowych między reporterami lub między RNA noszącymi je w określonych warunkach klasteryzacji in vitro . W ten sposób test bada, jak kontekst sekwencji i czynniki środowiskowe wpływają na skłonność do parowania zasad międzycząsteczkowych w środowisku przypominającym klaster RNA.

System rozszczepionych brokułów składa się z dwóch komplementarnych sekwencji RNA , górnej i dolnej, które dimeryzują, aby odtworzyć aptamer RNA brokułów (rysunki 1A–C)¹⁸. Po dimerizacji aptamer wiąże fluorofor DFHBI-1T, co skutkuje zieloną fluorescencją (Rysunki 1A–C)¹⁸. Korzystając z tego systemu, zakres łączenia zasad międzycząsteczkowych między sekwencjami komplementarnymi raportującymi w klastrze RNA zależy od fałdowania RNA. Porównując stosunek fluorescencji DFHBI-1T do poziomów RNA w różnych warunkach eksperymentalnych, można ilościowo ocenić wpływ warunków in vitro na parowanie zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA za pośrednictwem reportera.

Test ten uzupełnia podejścia RNA pull-down oraz elektroforezy żelowej do badania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrach RNA. Jednak solidne wykrywanie sygnałów może wymagać odczynników do stłoczenia cząsteczek, a czułość jest ograniczona przez efektywność dimeryzacji i fałdowania rozszczepionych górnych i dolnych RNA brokułów.

Protocol

Protokół ten oferuje krok po kroku metodę implementacji tego testu i omawia jego zastosowania. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie szablonów DNA do transkrypcji RNA in vitro

1. Do 5′ końca każdego szablonu DNA zawierającego sekwencje aptamerów brokułów dołącz sekwencję promotorową T7 do transkrypcji RNA in vitro. Używaj sekwencji rozdzielonych aptamerów brokułów (górnych i dolnych) samodzielnie lub wstawiaj je w dowolnej pozycji poniżej promotora T7, z dodatkową sekwencją RNA lub bez niej.
   UWAGA: Sekwencje dla promotora T7, raporterów Broccoli oraz starterów używanych do amplifikacji szablonów DNA są wymienione w Tabeli 1.
   UWAGA: Polimeraza RNA T7 zdecydowanie preferuje inicjowanie transkrypcji z literą "G" na pozycji +1. Obecność dodatkowych przeciążeń bezpośrednio poniżej na pozycjach +2 i +3 może zwiększyć wydajność transkrypcji¹⁹. Jednak gdy sekwencja w dół zaczyna się od G, jak w konstrukcjach górnej i dolnej zaczynającej się od dwóch G, transkrypcja może rozpocząć się na różnych pozycjach²⁰. W rezultacie transkrypcje mogą zawierać jeden, dwa lub trzy G na końcu 5′ (np. GATCC, GGATCC lub GGGATCC), co może wpływać na interpretację parowania zasad w zaprojektowanych konstrukcjach.
2. Używaj komercyjnie syntetyzowanych bloków genów, plazmidów lub fragmentów DNA jako szablonów do PCR. Jeśli oryginalny szablon nie zawiera promotora T7, użyj zapalnika do przodu z nawissem promotora 5′ T7 wraz z odpowiednim zapalnikiem odwróconym.
3. Przygotuj reakcję PCR o pojemności 50 μL w rurce PCR o pojemności 200 μL zawierającej po 2,5 μL po 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 20 ng DNA matryc, 25 μL 2× wysokiej jakości mieszankę główną oraz wodę wolną od nukleazy. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i wirując w 2000 × g przez 2 sekundy.
4. Uruchom reakcję PCR w cyklerze termicznym, korzystając z następującego programu: 98 °C przez 30 s (1 cykl); 98 °C przez 10 s, zoptymalizowana temperatura wyżarzania przez 30 s, a 72 °C przez 30 s na kilobazę (35 cykli); 72 °C przez 2 minuty (1 cykl).
   UWAGA: Określ zoptymalizowaną temperaturę wyżarzania za pomocą narzędzia online, takiego jak kalkulator Tm. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C po zakończeniu produkcji.
5. Zmieszaj 2 μL produktu PCR z 8 μL wody wolnej od nukleazy oraz 2 μL barwnika 6× obciążającego. Załaduj mieszankę na 1% żelu agarozowego do elektroforezy.
   UWAGA: Produkt PCR powinien pojawiać się jako jedno pasmo. Jeśli zaobserwuje się więcej pasów, usuń właściwy pasek i oczyści go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelowej przed rozpoczęciem działania.
6. Oczyść produkt PCR lub DNA ekstrakcjonowane żelem za pomocą zestawu do oczyszczania DNA i eluować w wodzie wolnej od nukleazy o pojemności 20–30 μL do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
7. Zmierz stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Upewnij się, że A260/A280 to około 1,8, a A260/A230 większe niż 2,0.
   UWAGA: Jeśli A260/A230 jest poniżej 2,0, wykonaj dodatkowy etap oczyszczania.
8. Przechowuj szablon DNA w temperaturze −20 °C do czasu użycia.

2. Przygotowanie reakcji transkrypcyjnej RNA in vitro

1. Przetrzyj powierzchnię roboczą, stojaki na rurki i pipety roztworzeniem dekontaminującym RNazę. Używaj końcówek bez RNazy, filtrowanych.
2. Roztwory buforu reakcji rozmrażającej i nukleotydów (ATP, CTP, GTP, UTP) dostarczane w zestawie transkrypcyjnym T7, wraz z UTP-Cy5, na lodzie. Wszystkie probówki wiruj w 2000 × g przez 2 sekundy przed użyciem.
   UWAGA: Chroń UTP-Cy5 przed światłem.
3. Oblicz liczbę zasad tyminowych w szablonie DNA (z wyłączeniem promotora T7) i określ wymagane objętości UTP i UTP-Cy5 dla reakcji transkrypcyjnej 20 μL. Utrzymuj spójną gęstość znakowania we wszystkich gatunkach RNA.
   UWAGA: Na przykład, aby oznaczyć RNA zawierające 100 zasad uracilowych około trzech uracyli oznaczonych Cy5, dodaj 4,5 μL 1 mM UTP-Cy5 oraz 1,9 μL 75 mM UTP.
4. Przygotuj reakcję transkrypcyjną o objętości 20 μL przez połączenie po 2 μL ATP, CTP i GTP, obliczone objętości UTP (wszystko dołączone do zestawu) i UTP-Cy5, 2 μL 10× buforu reakcji, 2 μL mieszanki enzymów, 200 ng DNA oraz wody wolnej od nukleazy. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i wiruj w 2000 × g przez 2 sekundy.
5. Inkubuj reakcję w 37 °C przez 6 godzin.
6. Dodaj 1 μL DNazy dołączonej do zestawu. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i wiruj w 2000 × g przez 2 sekundy.
7. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 15 minut.
8. Przenieś reakcję (~20 μL) do probówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj 115 μL wody wolnej od nukleazy oraz 15 μL roztworu stopowego octana amonu dołączonego do zestawu. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, i wirując w 2000 × g przez 2 sekundy.
   UWAGA: Zamiast kroków 2.9–3.7 można użyć komercyjnego zestawu do oczyszczania RNA.
9. Dodaj 150 μL fenolu/chloroformu i wymieszaj delikatnie.
   UWAGA: Obsługuj fenol/chloroform w chemicznym okapie spalającym (chifle).
10. Wiruj w 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
11. Przenieś górną fazę wodną do nowej rurki.
    UWAGA: Unikaj zakłócania interfazy; Dolna warstwa może wyglądać na niebieską z powodu niewłączonego barwnika.
12. Dodaj równą ilość chloroformu i dokładnie wymieszaj.
    UWAGA: Obsługa chloroformu w okapie chemicznym.
13. Wirówka w 16 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
14. Powtórz kroki 2.11–2.13.
15. Przenieś warstwę wodną (~100–150 μL) do nowej rurki. Dodaj 900 μL izopropanolu i dokładnie wymieszaj.
16. Aliquot do trzech równych objętości w oddzielnych lampach.
    UWAGA: Każda aliquota wystarcza do wielu reakcji klasteryzacji RNA.
17. Przechowuj w temperaturze −20 °C przez noc lub do miesiąca.

3. Oczyszczanie RNA transkrybowanego in vitro

1. Wiruj próbkę RNA w izopropanolu w 16 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
2. Ostrożnie usuń izopropanol, nie naruszając granulki RNA.
3. Dodaj 1 ml etanolu 70% przygotowanego w wodzie wolnej od nukleazy.
4. Wirować w 16 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
5. Usuń etanol i powtórz kroki 3.3–3.4.
6. Podczas końcowego mycia etanolem usuń większość etanolu pipetą o pojemności 1000 μL. Krótko wiruj w 2000 × g przez 2 sekundy w miniwirówce stołowej i usuń resztki etanolu pipetą 20 μL.
7. Susz na powietrzu pellet RNA przez 1–2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
8. Ponownie zawiesij pellet RNA w wodzie wolnej od nukleazy o pojemności 20 μL. Trzymaj próbkę na lodzie i chroń ją przed światłem.
9. Zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Upewnij się, że A260/A280 to około 2.0, a A260/A230 większe niż 2.0.

4. Przygotowanie reakcji klasteryzacyjnej RNA in vitro

UWAGA: W tym protokole indukcja klasteryzacji RNA wymaga sperminy i PEG 8000, na podstawie wcześniejszych badań ^2,4,5. Konkretnie, 100 mM roztwór tetrahydrochlorku sperminy przygotowany w wodzie wolnej od nukleazy był alicytatowany do wielu rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL i przechowywany w temperaturze −20 °C.

1. Rozmroź probówkę z roztworem sperminy 100 mM i 50% PEG 8000 na lodzie.
   UWAGA: Po otwarciu 50% PEG 8000 powinno być używane nie dłużej niż dwa miesiące ze względu na potencjalne uszkodzenie.
2. Aby przygotować świeżo wyprodukowany bufor składania 10× RNA o pojemności 500 μL, połącz 50 μL 2M KCl, 50 μL 1M MgCl₂, 50 μL 1M Tris (pH 7,0) oraz 350 μL wody wolnej od nukleazy. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Wirówka w 2000 × g przez 2 sekundy w miniwirówce stołowej.
   UWAGA: Bufor składania powinien być przygotowany w dniu eksperymentu klastrowania RNA.
   UWAGA: Kroki 4.3-4.4 zależą od warunków eksperymentalnych i mogą być dostosowywane w razie potrzeby. Poniżej opisano dwa przykładowe warunki klastrowania RNA użyte w tym badaniu. Warunek współskładania został zaadaptowany z metody stosowanej do wyżarzania oligonukleotydów antysensowych do RNA². W tej metodzie RNA są mieszane w buforze solnym i podgrzewane razem, aby sprzyjać parowaniu zasad międzycząsteczkowych między RNA przenoszącymi komplementarne sekwencje. Natomiast w przypadku warunku oddzielnego składania każde RNA jest składane indywidualnie przed zmieszaniem. Ten warunek ma na celu przybliżenie scenariusza komórkowego, w którym RNA są składane przed interakcją.
3. Współskładanie
   UWAGA: Ten stan sprzyja parowaniu zasad międzycząsteczkowych między RNA zawierającymi sekwencje górne i dolne. Pełni funkcję dodatniej kontroli nad parowaniem zasad międzycząsteczkowych sterowanych przez reportera w warunkach klasteryzacji RNA.
   1. W probówce PCR o pojemności 200 μL połącz 16 pmol każdego in vitro transkrybowanego RNA z sekwencją górną lub dolną, 2 μL buforu 10× refoldującego RNA oraz wodę wolną od nukleazy do końcowej objętości 14 μL. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie w górę i w dół. Wirówka w 2000 × g przez 2 sekundy w miniwirówce stołowej.
      UWAGA: Aby obliczyć masę RNA odpowiadającą 16 pmol.
   2. Podgrzej próbkę RNA w temperaturze 90 °C przez 2 minuty.
   3. Natychmiast przenieś próbkę do RT i chroń ją przed światłem. Inkubuj reakcję w RT przez 1 godzinę.
4. Oddzielne składanie
   1. Podgrzej próbkę RNA w temperaturze 90 °C przez 2 minuty, a następnie natychmiast umieść ją w lodzie na co najmniej 15 minut.
   2. W 200 μL probówce PCR połącz 16 pmol in vitro transkrybowanego RNA z sekwencją górną lub dolną, 1 μL 10× buforu RNA refoldującego oraz wodę wolną od nukleazy do końcowej objętości 7 μL.
      UWAGA: Aby obliczyć masę RNA odpowiadającą 16 pmol.
   3. Inkubuj reakcję w RT przez 30 minut, chronioną przed światłem.
   4. Połącz próbki RNA zawierające górną i dolną sekwencję w jedną rurkę PCR. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Wirówka na 2 000 × g przez 2 sekundy w miniwirówce stołowej. Inkubuj w RT przez 30 minut.
5. Dodaj 6 μL mieszanki 1:2 (v/v) zawierającej 100 mM sperminy i 50% PEG 8000. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Wirówka w 2000 × g przez 2 sekundy w miniwirówce stołowej.
   UWAGA: 50% PEG 8000 jest bardzo lepkie. Pipetuj powoli i ostrożnie.
6. Dodaj 2 μL 1 mM DFHBI-1T do reakcji. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Wirówka o stężeniu 2 000 × g przez 2 sekundy w miniwirówce stołowej. Reakcja powinna wyglądać żółto-zielono.
   UWAGA: Aby przygotować 20 mM roztwór DFHBI-1T z 1 mg barwnika liofilizowanego DFHBI-1T (MW: 320,21), należy dodać 156 μL bezwodnego DMSO o jakości biologii molekularnej. Zachowaj bulion w małych ilościach w wielu mikrowirówkach i przechowuj w temperaturze -20 °C. Unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania barwnika. Przygotuj świeżo rozcieńczony roztwór roboczy o pojemności 1 mM DFHBI-1T, rozcieńczając 20 mM zapasy w wodzie wolnej od nukleazy i przechowując je na lodzie.
7. Załaduj reakcję do szklanej szklanej pokrywy.
8. Inkubuj komorę w RT przez 4 godziny w ciemności, z pokrywą, aby zminimalizować parowanie.

5. Przygotowanie do obrazowania

1. Uzyskuj obrazy trójwymiarowe za pomocą mikroskopu strukturalnego lub konfokalnego wyposażonego w odpowiednie lasery i obiektywy.
   UWAGA: Mikroskopia konfokalna jest wymagana, aby zminimalizować światło nieostre.
2. Skonfigurować mikroskop tak, aby obrazował każdy obszar zainteresowania (ROI) z kanałem Cy5 najpierw na każdej płaszczyźnie z, a następnie obraz tego samego ROI za pomocą kanału GFP.
3. Ustaw czas naświetlania na 500 ms dla wszystkich kanałów. Ustaw moc lasera na 80% dla GFP i 40% dla Cy5.
4. Zobrazuj obszar pokrywy poza kroplą reakcji w RT, używając kroku z 150 nm.

6. Kwantyfikacja parowania zasad międzycząsteczkowych

1. Importuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazów²¹. Zidentyfikuj kanały GFP (DFHBI-1T) i Cy5 (RNA).
2. Narysuj ROI 5 × 5 pikseli w klastrze RNA i zmierz zintegrowaną gęstość obu kanałów na tej samej płaszczyźnie z. Wybierz 5–8 zwrotów z inwestycji z różnych klastrów RNA na każdym obrazie.
   UWAGA: Dostosuj rozmiar zwrotu z inwestycji w zależności od ustawienia kamery, ale zachowaj spójność między eksperymentami.
3. Wybierz 5–8 zwrotów z inwestycji poza kroplą reakcji do pomiaru tła i oblicz średnią gęstość zintegrowaną dla obu kanałów.
4. Oblicz znormalizowaną intensywność DFHBI-1T dla każdego ROI, używając:
   

7. Typowe problemy i rozwiązywanie problemów

1. Jeśli po wirowaniu nie zaobserwowano pelletu RNA, należy rozważyć degradację RNA, niewystarczający czas transkrypcji, nieaktywną polimerazę, sole pozostałe lub niskie stężenie RNA. Używaj odczynników wolnych od RNazy, wydłuż czas transkrypcji, używaj świeżych enzymów i oczyszczaj szablony.
2. Jeśli nie zaobserwuje się klastrów RNA znakowanych Cy5, rozważ degradację RNA lub degradację PEG 8000 lub UTP-Cy5. Używaj świeżych odczynników i warunków wolnych od RNazy.
3. Jeśli nie zaobserwuje się sygnału DFHBI-1T w warunkach współskładania, należy rozważyć słabą jakość barwnika, brak formowania struktury brokułów lub obcięcia transkryptów. Użyj świeżego barwnika, upewnij się o prawidłowy skład buforu i zweryfikowaj rozmiar transkrypcji za pomocą analizy żelowej.
4. Jeśli sygnał fluorescencyjny wybiela, zmniejsz moc lasera i czas naświetlania, zminimalizuj etapy obrazowania i chroń próbki przed światłem podczas inkubacji.

Results

W tym eksperymencie demonstracyjnym po raz pierwszy oceniono zdolność samego raportującego górnego i dolnego RNA do parowania zasad i tworzenia struktury brokułów, stosując wcześniej opisany protokół klasteryzacji in vitro RNA⁴. Parowanie zasad między górą a dolną generuje dwa ramiona brokułów, z których każde może wstawać jedną cząsteczkę DFHBI-1T (rysunki 1A–C)^18,22.

Po indukcji klastrowania RNA spermyną i PEG 8000 oba RNA tworzyły klastry indywidualnie lub razem (Rysunki 1D–Eii). Gdy badano górne lub dolne RNA w izolacji, fluorescencja DFHBI-1T w klastrzach RNA była znacznie niższa niż w warunkach współskładania, w których oba RNA były łączone przed denaturacją cieplną i ponownym składaniem (rysunek 1F). W warunkach współskładania oszacowano stosunek molowy DFHBI-1T (0,1 mM) do góry (0,8 μM) i dołu (0,8 μM) na 125:1:1. Odpowiada to około 62,5-krotnemu nadwyżkowi DFHBI-1T w stosunku do maksymalnej liczby potencjalnych struktur brokułów.

Niski, ale niezerowy sygnał DFHBI-1T obserwowany wyłącznie dla góry i dołu jest zgodny z wcześniejszymi raportami wykazującymi minimalną fluorescencję DFHBI-1T, gdy każdy raport jest wyrażany^{indywidualnie 18}. DFHBI-1T również wykazywał bardzo niskie, ale wykrywalne fluorescencje tła bez obecności RNA (Rysunek 1F). Wyniki te razem pokazują, że DFHBI-1T jest kompatybilny z testem klasteryzacji RNA in vitro oraz że współskładanie poprawia parowanie zasad międzycząsteczkowych między górnym a dolnym RNA.

Po normalizacji do intensywności RNA, znormalizowana intensywność fluorescencji DFHBI-1T w warunkach współskładania osiągnęła 1,03, co było istotnie wyższe niż tylko u góry i dołu (odpowiednio 0,054 i 0,023) (Rysunek 1D, Rysunek 1Ei Rysunek 1F). Następnie przeanalizowano klastry RNA powstałe przez mieszanie górnego i dolnego RNA, które zostały oddzielnie złożone przed klastrowaniem (Rysunek 1D, Rysunek 1EII i Rysunek 1F). W tym oddzielnym warunku składania znormalizowany sygnał DFHBI-1T wynosił 0,031, co jest porównywalne z poziomami bazowymi obserwowanymi w kontrolach ujemnych (tylko góra lub dół) (Rysunek 1F). Wyniki te wskazują, że współfałdowanie sprzyja parowaniu zasad międzycząsteczkowych między górnym a dolnym RNA, podczas gdy oddzielne fałdowanie ogranicza takie interakcje.

Sekwencje górne i dolne zostały następnie wstawione do 3′ nieprzetłumaczonego regionu (UTR) Drosophila melanogaster shutdown (shu), mRNA granulek zarodkowych ^4,23,24 oraz jego antysensowego odpowiednika (shu^anti). UTR shu 3′ został wybrany, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że to RNA występuje głównie jako monomer u Drosophila melanogaster i nie dimerizuje nawet przy wysokich stężeniach molowych w testach żelowych RNA ^4,24. Ponadto shū-top i shu-bottom nie tworzą homodimerów w żelach RNA⁴, co pozwala na bardziej bezpośrednią ocenę interakcji międzycząsteczkowych między górą a dolną oraz wpływu sekwencji flankujących pochodzących z shu.
Szablony DNA dla shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} i ^{shu anti-bottom} są wymienione w Tabeli 2. Sekwencje górne i dolne zostały wstawione do środka shu lub shu^anty-3′ UTR, co wymagało przebudowy strukturalnej w celu ułatwienia interakcji i lepszego naśladowania fizjologicznych interakcji RNA–RNA, w których obszary oddziałujące są zazwyczaj osadzone w transkrypcjach⁴.

Po indukcji klastrowania RNA, shu-top, shu-bottom, ^{shu anty-top} i shu^anty-bottom wykazywały minimalną fluorescencję DFHBI-1T, podobną do samych górnych i dolnych (rysunki 2A i 2B). Konsekwentnie współskładanie shu-top z shu-bottom lub ^{shu anty-top} z ^{shu anty-bottom} dawało wyższy sygnał DFHBI-1T niż oddzielne składanie (Rysunki 2Ci i Cii). Po normalizacji do intensywności RNA i kontroli ujemnej (definiowanej jako średni znormalizowany sygnał DFHBI-1T z każdego RNA), współskładanie shu-top i shu-bottom spowodowało 5,63-krotny wzrost znormalizowanej fluorescencji DFHBI-1T (Rysunki 2Di i 2Dii). Dla porównania, oddzielne składanie wykazało jedynie 1,04-krotny wzrost, co jest porównywalne z poziomami wyjściowymi obserwowanymi indywidualnie dla shu-top i shu-bottom. Podobne trendy zaobserwowano dla shu anty-top i ^{shu anty-bottom} w warunkach współskładania i oddzielnego składania (Rysunki 2Di i 2Dii). Wyniki te wskazują, że oddzielne fałdowanie nie sprzyja parowaniu zasad międzycząsteczkowych między shu-top a shu-bottom ani shu^anti-top i shu^anti-bottom, podczas gdy współfałdowanie wzmacnia te interakcje, prawdopodobnie dzięki wstawionym sekwencjom reportera.

Aby sprawdzić, czy shu i shu^anty-can to para bazowa, shu-top został wymieszany z shu^anti-bottom, a shu^anti-top z shu-bottom. Obie kombinacje wykazywały wyższą fluorescencję DFHBI-1T zarówno w warunkach współskładania, jak i oddzielnego fałdowania w porównaniu do shu-top z shu-bottom lub ^{shu anty-top} z shu^anty-bottom (Rysunki 2Ci i 2Cii). Po normalizacji współskładanie shu-top z ^{shu anti-bottom} i ^{shu anti-top} z shu-bottom spowodowało odpowiednio 61,86- i 82,60-krotny wzrost fluorescencji DFHBI-1T (rysunki 2Di i 2Dii). Dla porównania, oddzielne składanie przyniosło odpowiednio tylko wzrost o 2,69 i 4,94 razy (rysunki 2Di i 2Dii). Chociaż wartości te były znacznie niższe niż w warunkach współskładania, były wyższe niż dla shu-top z shu-bottom lub ^{shu anti-top} z ^{shu anti-bottom} (odpowiednio 1,04 i 1,16).

Wyniki te wskazują, że reporterzy posiadający dodatkowe sekwencje komplementarne mają większą zdolność do tworzenia par bazowych niż ci, którzy takich sekwencji nie mają. Efekt ten jest dodatkowo wzmacniany w warunkach współskładania, które sprzyjają interakcjom międzycząsteczkowym.

Rysunek 1: Przewidywane struktury wtórne górnych i dolnych RNA oraz ilościowe określenie ich sparowania zasad międzycząsteczkowych w klastrach in vitro RNA. (A–B) Przykłady struktur wtórnych górnych (A) i dolnych (B) fałdowanych indywidualnie, zgodnie z przewidywaniem RNAfold²⁵. Po złożeniu oddzielnie górna i dolna część nie odtwarzają aptamera brokułów, a DFHBI-1T (gwiazda szara) wytwarza minimalną fluorescencję. (C) Przykład struktury wtórnej pary górnych i dolnych RNA, przewidzianej przez RNAcofold²⁵. Międzycząsteczkowe parowanie zasad między dwoma RNA rekonstruuje dwa ramiona brokułów¹⁸, umożliwiając wiązanie DFHBI-1T i skutkując silną zieloną fluorescencją (zielone gwiazdy). (D) Obrazy samego DFHBI-1T (kontrola wyłącznie barwniku) oraz klastrów RNA in vitro (magenta) utworzonych przez górne i dolne RNA w obecności DFHBI-1T (zielone). (Ei, ii) Klastry RNA in vitro (magenta) tworzone przez górne i dolne RNA w warunkach współfałdowania (i) i oddzielnego fałdowania (ii) w obecności DFHBI-1T (zielone). Dla paneli D i E RNA były oznaczane Cy5 tak, że średnio około jedna trzecia RNA zawiera pojedynczy uracyl oznaczony Cy5, podczas gdy pozostałe dwie trzecie są nieoznakowane. Obrazy reprezentują średnie projekcje Z 27 przekrojów uzyskanych z krokiem 150 nm, przy użyciu tej samej ekspozycji i mocy lasera dla każdego kanału we wszystkich warunkach. Fluorescencja DFHBI-1T została znormalizowana do tego samego zakresu intensywności w różnych warunkach. Paski skali: 2 μm. (F) intensywność DFHBI-1T została znormalizowana do obfitości RNA, mierzonej fluorescencją Cy5. Dane przedstawiane są jako średnia ± SEM. Wartości p dla dwustronnego testu t-test (**** vs. współskładanie): 1,0 × 10⁻²² (tylko barwnik), 2,3 × 10⁻²² (góra), 4,9 × 10⁻²³ (dolny) oraz 7,0 × 10⁻²³ (oddzielne składanie). n = 30 regionów dla warunków wyłącznie barwnikowych oraz 30–31 klastrów RNA dla wszystkich pozostałych schorzeń. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy i ilościowa identyfikacja parowania zasad międzycząsteczkowych dla raportatorów górnych i dolnych shu^przeciw przenoszeniu. (A) Obrazy samego DFHBI-1T (kontrola tylko barwnik) oraz klastrów RNA in vitro (magenta) utworzonych przez RNA shu-top, shu-bottom, shu^anty-top i ^{shu anty-bottom} w obecności DFHBI-1T (zielony). RNA były oznaczane Cy5 tak, że średnio podczas transkrypcji in vitro inkorporowano trzy uracyle UTP-Cy5. Obrazy reprezentują średnie projekcje Z 27 przekrojów uzyskanych z krokiem 150 nm, przy użyciu tej samej ekspozycji i mocy lasera dla każdego kanału we wszystkich warunkach. Fluorescencja DFHBI-1T została znormalizowana do tego samego zakresu intensywności w różnych warunkach. Paski skalowe: 2 μm. (B) intensywność DFHBI-1T została znormalizowana do obfitości RNA, mierzonej fluorescencją Cy5. Dane przedstawiane są jako średnie ± SEM. n.s., nieistotne. Wartości p dla dwustronnego testu t (vs. tylko barwnikowego): 3,1 × 10⁻³ (**; Shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (n.s.; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; Shu anty-top), oraz 2,2 × 10⁻² (; Shu Anti-Bottom). n = 30 obszarów dla warunków wyłącznie barwnikowych oraz 30–32 klastrów RNA dla wszystkich pozostałych warunków. (Ci, ii) Obrazy klastrów RNA in vitro (magenta) powstałych przez mieszanie shu-top z shu-bottom, shu^anti-top z shu^anti-bottom, shu-top z shu^anti-bottom oraz shu^anti-top z shu-bottom w obecności DFHBI-1T (zielony) pod warunki współfałdowania (i) i oddzielnego fałdowania (ii). Obrazy reprezentują średnie projekcje Z 27 przekrojów uzyskanych z krokiem 150 nm, przy użyciu tej samej ekspozycji i mocy lasera dla każdego kanału we wszystkich warunkach. Dla niskiego zakresu fluorescencja DFHBI-1T została znormalizowana do tego samego zakresu intensywności co na rysunkach 1D–Eii i 2A. Dla wysokiego zakresu fluorescencja DFHBI-1T została znormalizowana do wyższego, ale stałego zakresu intensywności we wszystkich warunkach w panelach Ci i Cii. Skala: 2 μm. (Di, ii) intensywność DFHBI-1T została najpierw znormalizowana do intensywności RNA, a następnie do kontroli ujemnej, definiowanej jako średni znormalizowany sygnał DFHBI-1T z każdego RNA osobno. Dane przedstawiane są jako średnie ± SEM. n.s., nieistotne. (i) Wartości p dla dwustronnego testu t-test (**** vs. shu-top + shu-bottom): 1,1 × 10⁻³¹ (^{shu anty-top} + shu^anty-dolny), 1,1 × 10⁻²² (shu-top + ^{shu anty-dolny}) oraz 4,3 × 10⁻²⁷ (shu^anty-top + shu-bottom). (ii) Wartości p dla dwustronnego testu t (vs. shu-top + shu-bottom): 2,2 × 10⁻¹ (n.s.; ^Shu anty-góra + shu anty-dolna), 1,9 × 10⁻9 (; shu-top + ^{shu anty-bottom}), oraz 1.3 × 10⁻¹⁵ (; shu anty-top + shu-bottom). n = klastry RNA 29–32 dla wszystkich schorzeń. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Nazwa	Sekwencje (5′-3′)
Promotor T7	TAATACGACTCACTATAG
top	GGATGATGGAGACGGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
dno	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Na górnej części T7 napastnik	TAATACGACTCACTATAG GGATGATGGAGACGGTCG
Top-Reverse	ATCCGCATCATCTGGACCC
Dolny T7 forward	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
Dolny odwrót	GGATGATGGAGCCCACACT
Przednie zapalniki zawierają nawis sekwencji promotora T7 (pogrubiony), po którym następują sekwencje skierowane na 5′ koniec RNA.

Tabela 1: Sekwencje promotora T7, podzielonych raportatorów brokułów oraz starterów używanych do amplifikacji szablonów DNA do transkrypcji T7. Wymienione primery zostały użyte do generowania szablonów DNA do transkrypcji in vitro górnego i dolnego RNA, które następnie wykorzystano w testach klasteryzacji RNA opisanych w tym badaniu.

Nazwa	Sekwencje (5′-3′)
shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATCATCATATCTTACTCAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATCATGGCAAGAGAGGGTCGGGTCCAGATGATGCGGA TAAAAAACATACCAAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTCATT AGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGAATGTTAACGTTTTTGTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAAAACACAATAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
shu-bottom	GCTTACTAAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTTTCATCATCTCTCAAAAAGGATCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGTGGGCTTGCCCATGTGTGTGTGTGTCAACCCACATACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGCTCCATCCAAAAAACAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTAGTTTTTCGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGAACGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAA AAACCACAATAAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTTTTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTGTGGGCTCTTACGATGATATTGTGTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTTTTTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTTGGGTCCAGGATCATCATCATGGCAAGAGAGGGTTGGGGGTCCAGATGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAAGATGAAATATGAAATACTGGGGCTTTAGTAAGC
shuanty-bottom	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTTTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTGTGGGCTTACGATGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTTTTTTTTTTTTTT GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGGGCTTGCCCCATGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTGGTGGGCTCCATCATCCTTTTTGAGTAA GATATGAAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
shu-top lub shu-dolny-T7 do przodu	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
shu-top lub shu-bottom-Rewers	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
shuanty-górny lub shuprzeciw-dolny-T7 do przodu	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuanty-top czyshu anty-dolny-Rewers	GCTTACTAAAGAAGCCCCAGTA
Przednie zapalniki zawierają nawis sekwencji promotora T7 (pogrubiony), po którym następują sekwencje skierowane na 5′ koniec RNA. Dodano jeden lub dwa dodatkowe G-G między promotorem T7 a shu-top i shu-bottom lub shuanty-top i shuanty-bottom. Wynika to z faktu, że obecność G-G na pozycjach +2 i +3 może znacząco zwiększyć wydajność transkrypcji19. Jednak te dodatkowe przeciążenia mogą potencjalnie wpływać na interpretację parowania baz w zaprojektowanych konstrukcjach. Zobacz notatkę w kroku 1.1.

Tabela 2: Sekwencje shu-top, shu-bottom, shu anti-top, shu^anti-bottom oraz startery używane do amplifikacji szablonów DNA do transkrypcji T7. Wymienione primery zostały użyte do generowania szablonów DNA do in vitro transkrypcji ^{shu i shu antyRNA} zawierających raporty górne i dolne, które następnie wykorzystano w testach klasteryzacji RNA opisanych w tym badaniu.

Discussion

W tym badaniu system rozdzielonego aptameru^{brokuła 18} został przystosowany do bezpośredniej wizualizacji i ilościowej identyfikacji parowania zasad międzycząsteczkowych w warunkach klasteryzacji RNA in vitro. Takie podejście umożliwia ocenę parowania zasad międzycząsteczkowych w różnych warunkach in vitro i uzupełnia późniejsze testy biochemiczne, takie jak eksperymenty z RNA pull-down z użyciem krzyżowych linkerów^krzyżowych 15,16,17 oraz elektroforezy żelowej ^4,6,7. W przeciwieństwie do tych metod biochemicznych, które nie mają wystarczającej rozdzielczości przestrzennej pozwalającej odróżnić parowania zasad w klastrzach RNA od tych występujących poza nimi, to podejście umożliwia bezpośrednią przestrzenną wizualizację tych interakcji w obrębie klastrów. Konkretnie, umożliwia monitorowanie parowania zasad między górnym a dolnym RNA, czyli RNA niosących te raporty, w określonych warunkach klastrowania RNA. Ponadto zapewnia ilościowy odczyt parowania zasad między RNA raportującymi w czasie rzeczywistym bez konieczności sieciowania czy ekstrakcji RNA, minimalizując tym samym utratę próbki i niezgodność buforów.

Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej mierzono ilościowo parowanie zasad międzycząsteczkowych między sekwencjami aptamerów brokułów za pomocą sygnału DFHBI-1T, co wykazało zgodność DFHBI-1T z protokołem klasteryzacji RNA in vitro . Zakres parowania zasad międzycząsteczkowych różnił się w zależności od warunków fałdowania RNA, co obserwowano w warunkach współfałdowania i oddzielnego fałdowania (Rysunek 1F i Rysunek 2Di–2Dii). Wyniki te wskazują, że warunki fałdowania RNA mają istotny wpływ na interakcje międzycząsteczkowe RNA i powinny być starannie brane pod uwagę przy interpretacji wyników eksperymentalnych.

Test ten stanowi również platformę do oceny, czy sekwencje po obu stronach raportatorów górnego i dolnego wzmacniają parowanie zasad międzycząsteczkowych, co zostało wykazane za pomocą shu. Fluorescencja DFHBI-1T była wyższa dla shu-top z ^{shu anty-bottom} i ^{shu anty-top} z shu-bottom niż dla shu-top z shu-bottom lub ^{shu anty-top} z shu^anty-bottom, co wskazuje na interakcje międzycząsteczkowe między shu a ^{shu anti} dodatkowo wzmacnia sygnał brokułów. Obserwacje te sugerują, że sygnał fluorescencyjny DFHBI-1T uzyskany wyłącznie z współskładania górnego i dolnego reportera nie stanowi górnej granicy testu.

Fluorescencja DFHBI-1T mierzona w tych eksperymentach obejmowała szeroki zakres dynamiczny, od 1,04-krotnego wzrostu (shu-top z shu-bottom przy oddzielnym składaniu) do 82,60-krotnego wzrostu (shu^anty-top z shu-bottom w warunkach współskładania). Ten zakres dynamiczny umożliwia wykrywanie różnic w interakcjach międzycząsteczkowych RNA między RNA niosącymi te reportery.

Kilka etapów tego protokołu jest kluczowych dla skutecznego wykrywania parowania zasad międzycząsteczkowych między rozdzielonymi RNA Broccoli górnym i dolnym w klastrzach RNA. Do niezawodnego indukowania klasteryzacji RNA należy stosować świeże aliquoty PEG 8000, a powtarzające się cykle zamrożenia i rozmrażania powinny być minimalizowane ze względu na niestabilność odczynników. DFHBI-1T powinien być alicytatowany i przechowywany w temperaturze −20 °C, aby zachować właściwości fluorescencji. Produkty transkrypcji in vitro powinny być analizowane na żelu RNA denaturującego przed klasterowaniem, aby potwierdzić prawidłowy rozmiar transkryptu. Ponadto utrzymanie warunków wolnych od RNazy, w tym czystego środowiska pracy i komory obrazowania, jest niezbędne, ponieważ krople RNA są inkubowane w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas przed obrazowaniem.

Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że DFHBI-1T konkretnie opisuje parowanie zasad międzycząsteczkowych pośredniczone przez sekwencje górne i dolne. Nie można wykryć innych zdarzeń parowania zasad międzycząsteczkowych w różnych regionach RNA. Ponadto struktura brokułów powstała przez parowanie zasad między górną i dolną nicią jest termodynamicznie stabilna²⁶ i może nie odzwierciedlać w pełni słabszych lub przejściowych interakcji, takich jak te powstałe przez rozproszone, na powierzchni eksponowane zasady, jak obserwowano w klastrzach mRNA granulowanych Drosophila ⁴.

Ponadto interakcje międzycząsteczkowe RNA–RNA mogą być rozwiązłe i niespecyficzne, a sekwencje otaczające górny i dolny raport mogą wpływać na fluorescencję DFHBI-1T. Te obszary flankujące mogą bezpośrednio oddziaływać z sekwencjami reporterowymi, hamując tworzenie brokułów lub zmieniając strukturę RNA, co wpływa na interakcje między RNA przenoszącymi raporty. W związku z tym test odzwierciedla połączone efekty struktury RNA, parowania zasad górno-dolnych, interakcji między sekwencjami flankującymi oraz interakcji między sekwencjami flankującymi a reporterami.

Ten test daje możliwość dalszych badań. Na przykład zmiana sekwencji RNA po obu stronach reporterów, wprowadzenie helikaz lub chaperonów RNA lub modyfikacja warunków soli może wpływać na parowanie zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA. Takie efekty można ocenić, mierząc sygnał DFHBI-1T w warunkach współskładania i oddzielnego składania. Biorąc pod uwagę, że podobne aptamery RNA były stosowane w komórkach, bakteriach i drożdżach 26,27,28,29,30, podejście to może zostać rozszerzone na systemy cellulo lub organizmy modelowe, aby zbadać parowanie zasad międzycząsteczkowych w klastrzach mRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Używany do przygotowania 10& razy; Bufor składania RNA.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Używany do przygotowania 10& razy; Bufor składania RNA.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Składnik zestawu ligazy RNA T4; używany jako odczynnik do stłoczenia molekularnego do indukowania klasteryzacji RNA.
Absolutny etanol, 200 proof	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Wykorzystywany do przygotowania buforu płukania RNA.
Kwas fenol:chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	Używany do oczyszczania RNA.
Aminoallyl-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	Wykorzystywany do znakowania RNA podczas transkrypcji in vitro.
Komorowe szkło okładkowe	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Komora obrazowa do reakcji klasteryzacji RNA.
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C298-500	Używany do oczyszczania RNA.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Stosowany jako fluorofor do wykrywania aptamera RNA brokułów.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	bezwodny; poziom biologii molekularnej; używany do przygotowania DFHBI-1T.
DNA Clean & Clean & Zestaw koncentratora	Zymo	D4014	Wykorzystywany do oczyszczania produktów DNA przed transkrypcją T7.
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA	NEB	T1020L	Używany do ekstrakcji żelem.
Kąpiel sucha	Benchmark Scientific	BSH1001	Wykorzystywany do podgrzewania próbek RNA w probówkach mikrowirówkowych.
FIJI/ImageJ	NIH (Narodowe Instytuty Zdrowia)	Nie ma	oprogramowanie do analizy obrazów open-source; wykorzystywane do ilościowego określania intensywności fluorescencji i analizy ROI.
System elektroforezy żelowej	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Używany do elektroforezy żelowej DNA.
Żelowy barwnik ładujący, fioletowy (6& razy;)	NEB	B7024S	Stosowany jako barwnik ładujący do elektroforezy żelowej DNA.
Mikroskop natychmiastowej strukturyzowanej iluminacji	VisiTech International	VT-iSIM	Mikroskop konfokalny zdolny do obrazowania fluorescencji GFP i Cy5.
Izopropanol	Thermo Fisher Scientific	327272500	Używany do oczyszczania RNA.
Zestaw transkrypcjonujący MEGAscript T7	Thermo Fisher Scientific	AM1334	Wykorzystywane do transkrypcji in vitro T7. Zestaw zawiera roztwory nukleotydów (ATP, CTP, GTP, UTP) oraz DNazę.
Rurki mikrowirówkowe	Genesee Scientific	22-284	1,5 mL rurki; wykorzystywane do przechowywania szablonów DNA do transkrypcji in vitro, produktów RNA oraz aliquotów sperminy i DFHBI-1T.
Mini wirówka	Benchmark Scientific	Z763845	Używany do krótkotrwałej wirówki.
Nanodrop One spektrofotometr	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Spektrofotometr mikroobjętościowy do pomiaru stężenia i jakości DNA oraz RNA.
Woda wolna od nukleazy	Thermo Fisher Scientific	AM9937	Wykorzystywany do ponownej zawieszania pelletów RNA, przygotowania buforów płuczących i składania RNA oraz rozcieńczania sperminy i DFHBI-1T.
Internetowy kalkulator masy molowej	New England Biolabs (NEB)	Nie ma	Narzędzie online służące do obliczania masy RNA na podstawie ilości molowej (np. pmol).
Rurki PCR z polipropylenu	Corning	3745	200 μ Rurki PCR L używane do PCR, transkrypcji in vitro oraz reakcji klastrowych RNA
Zasilacz PowerPac Basic	Bio-rad	1645050	Używany do elektroforezy żelowej DNA.
Termiczny cykler PCR Proflex	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Stosowane do PCR, transkrypcji in vitro oraz podgrzewania próbek RNA w probówkach PCR.
P5 Wysoka jakość 2& razy; Master Mix	NEB	M0492S	Używane jako 2&; Wysoko wierny miks master.
Chłodnicza wirówka	Eppendorf	5424R	Wykorzystywany do oczyszczania RNA i granulowania.
Roztwór dekontaminacji RNazy	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Używany do czyszczenia stołów laboratoryjnych i powierzchni w celu minimalizacji skażenia RNazą.
Spermine  Tetrahydrochlorek	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Wykorzystywane do indukowania klastrowania RNA.
Baza Tris	Millipore Sigma	T1503-1KG	Używany do przygotowania buforu Tris (pH 7,0).
Ultraczysta agaroza	Thermo Fisher Scientific	16500500	Stosowany do elektroforezy żelowej DNA.