Ostry protokół mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Summary

Ten protokół przedstawia wydajny przepływ pracy dla mikroskopii lokalizowania pojedynczych cząsteczek obrazują izolowanych jąder Arabidopsis, z wykorzystaniem zoptymalizowanego izolowania, fiksacji i etykietowania, aby osiągnąć niezawodną wizualizację na skalę nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście może być łatwo dostosowane do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokorozdzielczego obrazu.

Abstract

Chociaż konfokalna mikroskopia fluorescencyjna dostarczyła cennych informacji na temat organizacji chromatyny w jądrach roślin, jej rozdzielczość ograniczona dyfrakcją ogranicza badania nad architekturą chromatyny, motywując zastosowanie technik superrezolucję, takich jak Mikroskopia Lokalizacji Pojedynczych Cząstek (SMLM). Wśród tych podejść, bezpośrednia stochastyczna optyczna rekonstrukcja mikroskopowa (dSTORM) zapewnia rozdzielczość na skalę nanometrów w pojedynczych komórkach, umożliwiając precyzyjne wizualizowanie domen chromatyny, modyfikacji histonów i organizacji jądrowej. Chociaż takie metody są coraz częściej stosowane w systemach ssaków, ich zastosowanie w biologii roślin pozostaje ograniczone, głównie ze względu na wyzwania techniczne w przygotowywaniu próbek.

Przedstawiamy tutaj usprawniony i możliwy do powtórzenia przepływ pracy dotyczący obrazowania SMLM jąder izolowanych z Arabidopsis thaliana. Ten protokół zaczyna się od fiksacji sadzonek w celu zachowania morfologii jądra, a następnie delikatnego krojenia tkanki i wirowania w celu wzbogacenia o nienaruszone jądra. Izolowane jądra są następnie oznakowane fluoroforem w płynnym medium i unieruchamiane na podkładkach z agarozy o niskiej temperaturze topnienia, co poprawia stabilność podczas długotrwałych sesji obrazowania pojedynczych cząstek. Te kroki łącznie minimalizują tło fluorescencyjne, poprawiają spójność oznakowania i zwiększają powtarzalność wśród replikat biologicznych.

Wynikiem tych przygotowań jest zwiększona czytelność obrazowania modyfikacji chromatyny i architektury jądra u roślin. Obniżając bariery techniczne wdrażania obrazowania SMLM w Arabidopsis, ten protokół zapewnia uniwersalny sposób badania regulacji epigenetycznej, organizacji chromatyny i zmian topologicznych jądra na skalę nanometrów. Praca ta stwarza podstawę metodologiczną dla stosowania SMLM u roślin, nadrabiając lukę w biologii komórki ssaków i otwierając nowe możliwości badania, w jaki sposób architektura jądra przyczynia się do regulacji genomu w odpowiedzi na sygnały rozwojowe i środowiskowe w systemach roślinnych.

Introduction

Mikroskopia od dawna jest filaretem badań nad organizacją chromatyny i architekturą jądra komórkowego, ujawniając, jak DNA i białka związane z histonami układają się w 3D przestrzeni jądrowej i wpływają na regulację genów^1,2. Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna dostarczyła cenny wgląd w duże domeny chromatyny, takie jak terytoria chromosomów, chromocentry i ciała jądrowe^3,4, wykonalne in situ, szczególnie w tkankach korzeniowych roślin^3,5,6. Jednak techniki te są zasadniczo ograniczone przez barierę dyfrakcyjną światła, ograniczając rozdzielczość przestrzenną do około 200 nm w kierunku poziomym i 500 nm wzdłużnie⁷. To ograniczenie zasłania szczegóły na skalę nanometrów fałdowania chromatyny, wzorców modyfikacji histonów i kompartmentalizacji transkrypcyjnej, które leżą u podstaw regulacji epigenetycznych. Aby pokonać tę barierę, opracowano metody mikroskopii superrozdzielczej (SRM) takie jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM)⁸, deplecja emisji stymulowanej (STED)^9,10 i mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząstek (SMLM)^11,12 w celu osiągnięcia rozdzielczości od 100 nm do kilku nm¹³.

Wśród technik SRM, SMLM – w tym PhotoAktywowana Mikroskopia Lokalizacji (PALM)¹³ i bezpośrednia Mikroskopia Rekonstrukcji Optycznej Stochastycznej (dSTORM) – oferuje wyjątkową rozdzielczość przestrzenną w połączeniu z specyficznością molekularną¹⁴. Wykrywając pozycje pojedynczych fluoroforów w czasie, SMLM rekonstruuje wysokiej precyzji obraz nanoskalowych domen chromatyny, znaków histonowych i struktur jądrowych w pojedynczych komórkach^15,16. Ta zdolność przekształciła badania nad chromatyną w systemach ssaków, gdzie SMLM zostało zastosowane do wizualizacji skupiania nukleosomów, zagęszczania chromatyny i wzorców modyfikacji histonów z bezprecedensowym szczegółem^15,16,17. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie SMLM do jąder roślinnych jest ograniczone, głównie z powodu wyzwań technicznych związanych z właściwościami tkanek roślin – takimi jak wysoka autofluorescencja, sztywność ściany komórkowej i obecność związków rozpraszających światło, jak skrobię i chlorofil¹⁸. Co więcej, delikatna natura jąder podczas ich izolowywania i znakowane jest wymaga zoptymalizowanych procesów, aby zachować integralność strukturalną i zminimalizować fluorescencje tła podczas długotrwałych sesji obrażania.

Opisany tutaj protokół został pierwotnie opracowany przez Elizabeth Kracik-Dyer i Célię Baroux na potrzeby mikroskopi deplecji stymulowanej emisji (STED)¹⁹. Następnie został zoptymalizowany i dostosowany, aby spełnić specyficzne wymagania obrazowania STORM z integracją wiedzy pochodzącej z opublikowanych zastosowań mikrobiologii^20,21,22. Głównym celem jest zapewnienie uproszczonego i powtarzalnego procesu obrazowania SMLM izolowanych jąder Arabidopsis thaliana. Poprzez integrację zoptymalizowanej fiksacji, delikatnego mechanicznego niszczenia i znakowane fluoroforami w zawiesinie, ta metoda zachowuje morfologię jądra, efektywnie usuwając zanieczyszczenia cytoplazmy, które często pogarszają jakość obrazu. Unieruchomienie znakowane jąder na poduszkach z agarozy o niskiej temperaturze topnienia zapewnia stabilność mechaniczną podczas akwizycji, pozwalając na długotrwałe obrażanie pojedynczych cząstek na poziomie nanoskalowym. W porównaniu z wcześniej opisanymi protokołami SRM dla jąder roślinnych – szczególnie tymi opartymi na mikroskopii STED^19,23 – ten proces używa fluoroforów fotoprzełączalnych (np. AF647, JF549) i zmniejsza fluorescencje tła dzięki krokom mycia, które usuwają chlorofil i reszty tkankowe, a także poprawia jednorodność znakowane poprzez dodanie cząstek znakowane bezpośrednio do fiksowanych i permeabilizowanych jąder. W konsekwencji, umożliwia spójne wizualizacje modyfikacji chromatyny, działów jądrowych i wzorców epigenetycznych w pojedynczych jądrach. Poprzez obniżenie barier technicznych dla wdrożenia SMLM w roślinach, ta metoda poszerza dostępność obrazowania na skalę nanometrów i zapewnia fundament dla badań nad tym, jak organizacja chromatyny i architektura jądra komórkowego przyczyniają się do regulacji genów w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Protocol

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat materiałów i instrumentów użytych w tym protokole są dostępne w Tabeli materiałów. O ile nie zaznaczono inaczej, bufory są przefiltrowane przez apyrogenowane filtry 0,2 µm. W całym protokole używano podwójnie destylowanej ultraczystej wody H₂O (ddH₂O). Kroki wirowania przeprowadza się w 1,5 mL mikrotrubkach za pomocą wirówki kątowej.

1. Fiksacja sadzonek i uwolnienie jąder

1. Umieść 6-dołkową płytkę hodowlaną na lodzie pod kapturem laboratoryjnym, następnie dodaj do każdego dołka około 4 mL lodowatej cieczy fiksacyjnej przygotowanej extemporaneously pod kapturem (4% (v/v) metanol stabilizowanego formaldehydu, 0,1% Triton X-100 w 1x Buforowanym Roztworze Fosforanowym [PBS]).
2. Używając czystych kleszczy, usuń sadzonki (między 8 a 15 dniami po kiełkowaniu), które zostały wyhodowane na stałym (0,8% agar) połowie stężenia Murashige and Skoog Medium 2,2 g/L MS salts, 1% sacharozy (w/v), pH 5,7, zgodnie z opisem sadzonek MS w referencji²⁴, i natychmiast zanurz je w roztworze fiksacyjnym. Użyj jednego dołka na około 20 sadzonek (potrzebne były 3 dołki, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału na próbkę).
3. Umieść płytkę w komorze próżniowej wypełnionej lodem i zastosuj próżnię o ciśnieniu cyklicznie zmieniającym się między 0,2 bar a 0,8 bar przez 15 min, aby usunąć uwięzione powietrze i pozwolić na głębokie przenikanie środka fiksacyjnego do tkanek roślinnych²⁵. Powoli zwolnij próżnię, wymieszaj próbkę, a następnie zastosuj próżnię przez dalsze 15 min.
4. Pod kapturem laboratoryjnym usuń roztwór fiksacyjny pipetą i wypłucz każdy dołek 3 razy przez 10 min pod delikatnym agitowaniem, używając 5 mL lodowego PBS.
5. Usuń PBS i użyj kleszczy, aby przenieść utkwione tkanki do 120 mm × 120 mm naczynia Petriego. Dodaj do utkwionych sadzonek 50 µL Buforu Izolacji Jąder (NIB), przygotowanego zgodnie z opisem Kracik-Dyer i Baroux (45 mM MgCl₂, 20 mM MOPS, 30 mM cytrynianu sodu, 0,3% Triton X-100. Dostosuj do pH 7 za pomocą 1 N HCl)¹⁹. Przeciąć za pomocą ostrza.
   UWAGA: Okazuje się, że ostrza mikrotomowe są bardziej efektywne niż konwencjonalne ostrza do golenia w tym zadaniu.
6. Zdrap utkane tkanki na jedną krawędź naczynia Petriego za pomocą tego samego ostrza i dodaj 600 µL NIB, upewniając się, że z ostrza zostaną zmyte również wszelkie kawałki tkanki.
7. Przenieś zawiesinę tkankową do 2 mL tubki homogenizacyjnej Dounce i uderzaj 5–10 razy mniejszym tłoczkiem, a następnie większym tłoczkiem, aż zawiesina będzie się płynnie poruszać w tubce (znowu zwykle wymaga to 5–10 uderzeń).
8. Przefiltruj uzyskaną zhomogenizowaną próbkę przez filtr o siatce 30 µm do 1,5 mL mikrotrubki.
9. Wiruj zawiesinę przez 10 min przy 800 × g używając najniższego przyspieszenia i spowolnienia. Wśród zielonego gruzu tkankowego widoczny jest mały biały pelet.
10. Odsuń nadstan i ponownie zawieś pelet w 150 µL NIB.
11. Wiruj ponownie przez 10 min przy 800 × g i odsuń nadstan. Jeśli widoczne są zielone gruzy, wypłucz po raz drugi. Ponownie zawieś w 50 µL do 150 µL NIB, w zależności od wielkości peletu.
12. Przechowuj uzyskaną zawiesinę izolowanego jądra w 4 °C maksymalnie przez 1 tydzień przed przeprowadzeniem barwienia. Jednakże, zaleca się natychmiastowe przejście do następnego kroku.

2. (Immuno)barwienie

UWAGA: W kolejnych krokach protokół jest stosowany do objętości 50 µL zawiesiny jąder, odpowiadającej zazwyczaj 20 sadzonkom. O ile nie zaznaczono inaczej, kolejne kroki są przeprowadzane w temperaturze pokojowej.

1. Wiruj roztwór przez 10 min przy 800 × g i odsuń nadstan. Uważaj, aby nie dotknąć peletu.
2. Ponownie zawieś jądra delikatnym pipetowaniem w 50 µL buforu blokującego (143 mM NaCl, 4% BSA w PBS, przechowywany w 4 °C). Inkubację prowadzić przez 30 min pod delikatnym agitowaniem.
3. Wiruj roztwór przez 10 min przy 800 × g i odsuń nadstan bez dotykania peletu jąder.
4. Ponownie zawieś jądra delikatnym pipetowaniem w 50 µL 1x PBS. Wiruj ponownie przez 10 min przy 800 × g. Odsuń nadstan jak wyżej.
5. Ponownie zawieś jądra w 50 µL roztworu przeciwciała pierwotnego przygotowanego w buforze immunobarwienia składającym się z 143 mM NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20 w PBS (przeciwciało i stężenie robocze są szczegółowo opisane w

Results

Opisany wyżej protokół umożliwia przygotowanie wysokiej jakości jąder Arabidopsis thaliana nadających się do SMLM. Przeprowadzono kilka rund optymalizacji w celu poprawy integralności jąder i zmniejszenia cytoplazmy oraz zanieczyszczeń komórkowych, które pogarszają jakość obrazu. Po każdym kroku optymalizacji jakość przygotowywanych jąder była ocenianą za pomocą konfokalnego obrazu z mikroskopu konfokalnego Olympus IX81 przed przystąpieniem do akwizycji superrozdzielczości.

Ob...

Discussion

Przygotowanie jąder Arabidopsis thaliana do mikroskopii lokalizującej pojedynczych cząstek (SMLM) wymaga kilku kluczowych kroków, które znacząco wpływają na ostateczną jakość próbki. Jak opisano wcześniej^19,35, dokładne i spójne siekanie tkanki jest niezbędne, aby zmaksymalizować odzyskiwanie nienaruszonych jąder. Użycie ostrza mikrotomowego zamiast standardowych ostrza do golenki daje czystsze i bardziej jednolite rozdrobnienie tkanki, co poprawia uwaln...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Pierwotne przeciwciało używane w rozcieńczeniu 1/200 w buforze immunostaining do uwidocznienia aktywnej formy polimerazy (Przeciwciało poliklonalne wytwarzane u królika)
Oprogramowanie do akwizycji	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albumina bycza	Sigma-Aldrich	A7906
Katalaza	Sigma-Aldrich	C40
Certyfikowana żelatyna niskotopliwa	Bio-Rad	1613111
Pokrywy szklane o grubości 1,5H, okrągłe	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glukoza, bezwodna, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Zwierciadło dichoiczne	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Zwierciadło dichoiczne do separacji wzbudzenia/emisji
Puffer fosforanowy Dulbecco 10’	biowest	X0515 - 500	Praca w warunkach sterylnych
Ostrza do mikrotomów jednorazowych Epredia Ultra	FisherScientific	12191830	Niska sylwetka, jednorazowe
Płytka 6-dołkowa Falcon Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, z pokrywką	Falcon	353046
Roztwór formalinowy 37%	Carl Roth	7398	Praca pod kapturowym urządzeniem odpylającym
Oksydaza glukozy	Sigma-Aldrich	G2133
Glikolka	VWR	24388.295
Kozłem przeciw-Królikowi IgG (H+L) bardzo silnie adsorpcyjne przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Używane w rozcieńczeniu 1/200 jako przeciwciało wtórne sprzężone z AF647
Roztwór Hoescht 33258	Sigma-Aldrich	94403	Używane w rozcieńczeniu 1/500 do kontrastowania DNA, dodane do podłoża żelatynowego
Roztwór kwasu chlorowodorowego	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Używane do kontrastowania DNA, dodane do podłoża żelatynowego w końcowej koncentracji 1,5 nM
Zestaw szlifierki do tkanki KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL probówki z dużymi (0,0030-0,0050 cala) i małymi (0,0005-0,0025 cala) szczelinami tłoków
Jednostka laserów	Oxxius	L6Cc	Wyposażony w sześć laserów: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW i 730 nm - 30 mW
Chlorek magnezu sześciowodorowy	Carl Roth	HN03
Merkaptoetyloamina (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
Sól sodowa MOPS 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Filtr emisji wielozakresowy	Semrock	FF01-446/523/600/677	Filtracja emisji wielozakresowej w celu blokowania światła rozproszonego laserem
Nanodiam	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Zapas 1 mg/mL
Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Miszka Petri, 100/20 mm, PS, przezroczysta, z wentylacją, sterylna	Greiner Bio-One	664161	Używane do uprawy roślin na półpłynie MS
Miszka Petri, kwadratowa, PS, przezroczysta, 120/120/17 mm, sterylna	Greiner Bio-One	688161	Używane podczas krojenia sadzonek roślin
Filtr komórek pluriStrainer Mini	pluriSelect	43-10030-50	Rozmiar siatki 30 µm, nadający się do 1,5 mL probówki Eppendorf
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333
Filtr emisji jednozakresowej	Semrock	FF01-698/70	Specyficzny filtr emisji dla kanału AF647
Filtr emisji jednozakresowej	Chroma	ET600/50m	Specyficzny filtr emisji dla kanału JF549
Chlorkowa sód (99,5%)	Euromedex	1112-A
Szlajdki Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterylny filtr strzykawkowyø 33 mm porowatość 0,2 µm Luer Lock stożek	ClearLine	146560
System superrozdzielczości	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 wyposażony w obiektyw 100x NA1.5 do zanurzenia w oleju
Cytrynian trójnatry 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Trisola zasad biologicznych molekularnych	Promega	H5135
Trisso(2-karboksyetyl)fosfiny chlorowodorek (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001