Uproszczony protokół do mikroskopii lokalizacji pojedyncząsteczki w jądrach Arabidopsis

Summary

Protokół ten oferuje efektywny sposób pracy do mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki w izolowanych jądrach Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowaną izolację, fiksację i znakowanie, aby zapewnić wiarygodną wizualizację chromatyny i polimerazy RNA II na skali nano. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów do obrazowania wysokiej rozdzielczości.

Abstract

Chociaż mikroskopia fluorescencyjna konfokalna dostarczyła cennych informacji na temat organizacji chromatyny w jądrach roślin, jej rozdzielczość ograniczona przez dyfrakcję ogranicza badania architektury chromatyny, co motywuje stosowanie technik superrozdzielczych, takich jak mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM). Wśród tych podejść bezpośrednia stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcyjna (dSTORM) zapewnia rozdzielczość na skalę nanoskalową w pojedynczych komórkach, umożliwiając precyzyjną wizualizację domen chromatycznych, modyfikacji histonów oraz organizacji jądrowej. Chociaż takie metody są coraz częściej stosowane w systemach ssaków, ich zastosowanie w biologii roślin pozostaje ograniczone, głównie z powodu wyzwań technicznych przy przygotowywaniu próbek.

Przedstawiamy tutaj uprościony i powtarzalny workflow do obrazowania SMLM jąder izolowanych z Arabidopsis thaliana. Protokół ten rozpoczyna się od utrwalenia siewek w celu zachowania morfologii jądrowej, następnie następuje delikatne cięcie tkanek i wirowanie, aby wzbogacić nienaruszone jądra. Izolowane jądra są następnie znakowane fluoroforem w ciekłym medium i unieruchomiane na niskotopniących się agarozowych podkładkach, co zwiększa stabilność podczas długotrwałych sesji obrazowania pojedynczą. Te kroki łącznie minimalizują fluorescencję tła, poprawiają spójność znakowania i zwiększają powtarzalność w biologicznych replikacjach.

Uzyskane preparaty zapewniają zwiększoną klarowność do wizualizacji modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w elektrowniach. Poprzez obniżenie barier technicznych w implementacji obrazowania SMLM w Arabidopsis, protokół ten zapewnia wszechstronne narzędzie do badania regulacji epigenetycznej, organizacji chromatyny oraz wariantów topologicznych jądrowych na skali nano. Prace te ustanawiają metodologiczne podstawy do stosowania SMLM do roślin, łącząc z biologią komórek ssaków i otwierając nowe możliwości badania, jak architektura jądrowa przyczynia się do regulacji genomu w odpowiedzi na sygnały rozwojowe i środowiskowe w systemach roślinnych.

Introduction

Mikroskopia od dawna stanowi fundament badań nad organizacją chromatyny i architekturą jądrową, ujawniając, jak DNA i białka związane z histonami układają się w trójwymiarowej przestrzeni jądrowej i wpływają na regulację genów ^1,2. Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna dostarczyła cennych informacji o dużych domenach chromatyny, takich jak terytoria chromosomów, chromocentra i ciała jądrowe ^3,4, możliwe in situ, w szczególności w tkankach korzeniowych roślin ^3,5,6.

Protocol

UWAGA: Szczegółowe informacje o materiałach i instrumentach używanych w tym protokole są dostępne w Tabeli Materiałów. O ile nie zaznaczono inaczej, bufory są oczyszczane na filtrach apyrogenicznych 0,2 μm. Podwójnie destylowany ultraczysty H₂O (ddH₂O) jest stosowany w całym tym protokole. Etapy wirowania przeprowadzane są w mikrorurkach o pojemności 1,5 mL, używając wirnika o stałym kącie.

1. Fiksacja i uwalnianie jąder przez sadzonki

1. Umieść 6-dołkowy płytę hodowlową na lodzie pod osłoną oparową, a następnie dodaj do każdego odwiertu około 4 mL lodowatego roztworu utrwalaj....

Results

Opisany powyżej protokół umożliwia przygotowanie wysokiej jakości jąder Arabidopsis thaliana odpowiednich dla SMLM. Przeprowadzono kilka rund optymalizacji w celu poprawy integralności jądra oraz zmniejszenia ilości szczątków cytoplazmatycznych i komórkowych, które obniżają jakość obrazu. Po każdym etapie optymalizacji jakość preparatów jądrowych oceniano za pomocą obrazowania konfokalnego za pomocą mikroskopu obrotowego Olympus IX81, a następnie przechodząc do akwizycji w nadrozdzielczości.

Discussion

Przygotowanie jąder Arabidopsis thaliana do mikroskopii lokalizacji pojedyncząsteczki (SMLM) wymaga kilku kluczowych kroków, które silnie wpływają na jakość końcowej próbki. Jak opisano^{wcześniej 19,35}, dokładne i konsekwentne cięcie tkanek jest niezbędne, aby zmaksymalizować odzyskanie nienaruszonych jąder. Stosowanie mikrotomowych ostrzy zamiast standardowych żyletek prowadzi do czystszej i bardziej równomiernej fragmentacji tkanek, co poprawia uwalnian.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przeciwciało przeciwko polimerazie anty-RNA II powtórzenia YSPTSPS (fosfor S2)	Abcam	ab5095	Przeciwciało pierwotne stosowane w rozcieńczeniu 1/200 w buforze immunobarwionym do wizualizacji aktywnej formy polimerazy (przeciwciało poliklonalne wyhodowane u królika)
Oprogramowanie do pozyskiwania	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906
Katalaza	Sigma-Aldrich	C40
Certyfikowana niskotopniąca agaroza	Bio-Rad	1613111
Pokrywki o grubości 1,5H okrągłe	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-glukoza, bezwodna, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Lustro dichroiczne	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Lustro dichroiczne do rozdzielania wzbudzenia/emisji
Dulbecco' Fosforanowa buforowana sól fizjologiczna 10 i ostra;	biowest	X0515 - 500	Praca w warunkach sterylnych
Jednorazowe mikrotomowe ostrza Epredia Ultra	FisherScientific	12191830	Niski profil, jednorazowe zastosowanie
Falcon 6-dołkowa płytka z przezroczystym płaskim dnem TC z wielodołową hodowlą wielowarstwową z pokrywką	Falcon	353046
Roztwór formaldehydu 37%	Carl Roth	7398	Pracuj pod maską oparową
Oksydaza glukozy	Sigma-Aldrich	G2133
Glicerol	VWR	24388.295
Przeciwciało przeciwwtórne przeciw koziczym przeciw królikom (H+L) o silnej krzyżowej adsorbcji, Alexa Fluor plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Stosowany w 1/200 jako przeciwciało wtórne sprzężone z AF647
Rozwiązanie Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Stosowany w skali 1/500 do przeciwbarwienia DNA, dodany do agarozowego podkładu
Roztwór kwasu solnego	Laboratorium chemiczne	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Laboratorium Lavisa i zespół Otwartej Chemii (Janelia)	JF549-Hoechst	Używany do przeciwbarwienia DNA, dodany do agarozowej podkładki przy końcowym stężeniu 1,5 nM
Zestaw młynka do chusteczek KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL probówki z dużymi (0,0030-0,0050 cala) i małymi (0,0005-0,0025 cala) tłuczkami przepustowymi
Jednostka laserowa	Oxxius	L6Cc	Wyposażony w sześć laserów: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW oraz 730 nm - 30 mW
Heksahydrat chlorku magnezu	Carl Roth	HN03
Merkaptoetylamina (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sól sodowa 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Wielopasmowy filtr emisji	Semrock	FF01-446/523/600/677	Wielopasmowa filtracja emisyjna blokująca światło rozpraszania laserowego
Nanodiamenty	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Magazyn 1 mg/mL
Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Szalka Petriego, 100/20 mm, PS, przezroczysta, z otworami wentylacyjnymi, sterylna	Greiner Bio-One	664161	Używa się do uprawy roślin na podłożu o masie 1/2 MS
Szalka Petriego, kwadratowa, PS, przezroczysta, 120/120/17 mm, sterylna	Greiner Bio-One	688161	Używany do cięcia sadzonek roślin
Sitnik pluriStrainer Mini cell sit	pluriSelect	43-10030-50	Rozmiar siatki 30 & micro; m, odpowiedni dla 1,5 mL sondy Eppendorfa
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P9333
Jednopasmowy filtr emisji	Semrock	FF01-698/70	Filtr emisji specyficznej dla kanału AF647
Jednopasmowy filtr emisji	Chroma	ET600/50m	Filtr emisji specyficznej dla kanału JF549
Chlorek sodu (99,5%)	Euromedex	1112-A
Zamki Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterylny filtr strzykawkowy i oslash; 33 mm porowatość 0,2 & mikro; stożek śluzy m Luer	ClearLine	146560
System superrozdzielczości	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 wyposażony w obiektyw NA1.5 z olejem 100x
Biomol Gen-apex z cytrynianem trisodu 2H2O	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-karboksyetylo)fosfinochlorkowodorek (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Silikonowy uszczelniacz
System czyszczenia ultrafioletowego ozonu UVOCS	UVOCS Inc.	T10X10	20 minut ekspozycji na czyszczenie pokrywek i nbsp;
Pompa próżniowa	Vacuubrand	VP 100C
Wirówka Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Wirowanie przeprowadzono za pomocą rurek Eppendorfa.