Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Reine Khoury; Laura Montermini; Nadim Tawil; Corina Nagy

doi:10.3791/70894

Artykuł metodologiczny

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

207 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70894

⸱

23 czerwca 2026

Reine Khoury¹^,² , Laura Montermini³ , Nadim Tawil³ , Corina Nagy¹^,²^,⁴

¹Integrated Program in Neuroscience, McGill University, ²McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, ³Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, ⁴Department of Psychiatry, McGill University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Streszczenie

Małe zewnątrzkomórkowe wezykuły (sEVs) to nanoskalowe, związane z lipidami cząstki, które pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transfer białek, lipidów i kwasów rybonukleinowych (RNA). Izolowanie sEVs z tkanek stałych, takich jak mięsień szkieletowy (SkM) i szpik kostny (BM), pozostaje wyzwaniem ze względu na niski wydajność i skażenie niewezykularnymi składnikami. Ten protokół opisuje reprodukowalny proces izolacji sEVs z mysiego SkM i BM. SkM jest trawiony enzymatycznie, podczas gdy BM jest przetwarzany bezpośrednio, a następnie poddawany różnicowemu wirowaniu i chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). W przypadku SkM, objętość próżni (~2,5 mL) jest odrzucana, a następnie zbiera się kolejne ~1,6 mL jako frakcje wzbogacone w EV, zazwyczaj podzielone na sekwencyjne frakcje po 400 µL (F1–F4). W przypadku BM, odrzucana jest objętość próżni 700 µL, a następnie zbiera się frakcję wzbogaconą w EV o objętości ~850 µL, którą można podzielić na sekwencyjne frakcje po ~170 µL (F1–F5) i zespolić w oparciu o wzbogacenie markerem EV. Stosując tę metodę, sEVs można odizolować z małych objętości tkanki (około 500 µL z pojedynczego czworogłowego uda i 150 µL z zespolonego szpiku BM z kości udowej i piszczelowej), uzyskując około 10⁸ cząstek·mL⁻¹·mg⁻¹ tkanki, przy średnicy cząstek przeważnie mniejszej niż 200 nm. Integralność wezykuł i ich czystość są walidowany za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, analizy nanocząstek oraz techniki Western blot do wykrycia kanonicznych markerów EV, z dodatkową charakteryzacją poprzez wykrywanie interferencyjne pojedynczych cząstek w celu ilościowego określenia podpopulacji wezykuł zdefiniowanych przez tetraspaniny. Ta metoda umożliwia reprodukowalne izolację wysokiej czystości sEVs ze skomplikowanej strukturalnie tkanki przy minimalnym materiale wejściowym, wspierając dalsze molekularne i funkcjonalne analizy wezykuł pochodzenia tkankowego.

Wprowadzenie

Małe pęcherzyki pozakomórkowe (sEV) to nanoskopowe, związane z lipidami cząstki, które pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez przenoszenie białek, lipidów i kwasów nukleinowych¹. Są uwalniane przez wszystkie typy komórek i występują praktycznie we wszystkich płynach biologicznych, gdzie pełnią funkcję kluczowych nośników aktywnych biologicznie ładunków, w tym peptydów i mikro rybonukleinowych kwasów nukleinowych (RNA)². Ich ładunek jest selektywnie sortowany, umożliwiając precyzyjne dostarczanie określonych sygnałów³, a ich pęcherzykowa struktura pozwala im omijać typowe gradienty i ograniczenia rozcieńczania czynników wydzielania swobodnego, dostarczając skoncentrowane ładunki molekularne na duże odległości⁴. Chociaż pęcherzyki pozakomórkowe z płynów biologicznych (np. osocza, surowicy i śliny) zapewniają wygodny przekrój układowej sygnalizacji, reprezentują wysoce mieszaną populację pochodzącą z wielu tkanek⁵. Powoduje to trudności w określeniu, która tkanka produkuje określony sygnał biologiczny lub jak komunikacja pęcherzyków pozakomórkowych jest regulowana na poziomie tkankowym. Ponieważ krążące pęcherzyki są łączone razem, zmiany specyficzne dla tkanki mogą być rozcieńczane lub maskowane, ograniczając zdolność do zidentyfikowania prawdziwego źródła sygnałów⁶.

Mięśnie szkieletowe (SkM) i szpik kostny (BM) to główne metabolicznie i funkcjonalnie aktywne tkanki o odrębnych składach komórkowym i rolach sygnalizacyjnych⁷^,⁸. Obie tkanki mogą wydzielać populacje pęcherzyków pozakomórkowych wzbogacone o unikalne, specyficzne dla tkanki ładunki; jednak te sygnały mogą być łatwo przytłumione w osoczu przez pęcherzyki z tkanek o wysokim obrocie, takich jak komórki układu odpornościowego⁸^,⁹. Bezpośrednie izolacja pęcherzyków pozakomórkowych z mięśni lub szpiku kostnego zwiększa czułość i umożliwia wykrycie subtelnych, specyficznych dla tkanki adaptacji, które mogą nie być obserwowalne w krążeniu. Pęcherzyki pozakomórkowe pochodzące z tkanek dostarczają zatem istotnych uzupełniających informacji, ujawniając, kiedy określony narząd uwalnia pęcherzyki pozakomórkowe, jak długo te sygnały utrzymują się i jakie adaptacje są ostre w porównaniu z przewlekłymi. Pomimo rosnącego zainteresowania pęcherzykami pozakomórkowymi, większość uznanych metod izolacją została opracowana dla płynów biologicznych (np. osocza i surowicy) lub systemów hodowlany komórek. W tych kontekstach pęcherzyki pozakomórkowe można uzyskać z stosunkowo wysoką wydajnością i minimalnymi zaburzeniami strukturalnymi. Jednak izolowanie pęcherzyków pozakomórkowych bezpośrednio z tkanek stałych, takich jak SkM i BM, stanowi znaczne wyzwania techniczne. Te tkanki są strukturalnie złożone i heterogeniczne, wymagając mechanicznych lub enzymatycznych etapów dysocjacji, które mogą wprowadzać artefakty, w tym wysokie poziomy białek rozpuszczalnych, fragmentów organelli i niepęcherzykowych nanocząstek, utrudniając osiągnięcie wysokiej czystości przygotowania pęcherzyków pozakomórkowych.

Kolejnym dużym wyzwaniem w izolowaniu pęcherzyków pozakomórkowych pochodzących z tkanek jest brak znormalizowanych procesów pracy dla definicji i separacji frakcji¹⁰. Samo różnicowe wirowanie często prowadzi do współizolowania agregatów białek i dużych pęcherzyków, podczas gdy metody oparte na ultrawirowaniu, choć szeroko stosowane, mogą prowadzić do agregacji, deformacji pęcherzyków i zmiennej wydajności w zależności od typu wirnika i warunków eksperymentalnych. Podejścia oparte na gradiencie gęstości poprawiają czystość, ale są czasochłonne, o niskiej wydajności i trudne do standaryzacji między laboratoriami¹¹. W związku z tym obecnie nie ma powszechnie przyjętej, powtarzalnej metody zoptymalizowanej do izolowywania małych pęcherzyków pozakomórkowych z tkanek stałych o wysokiej czystości i spójnej wydajności¹⁰.

Chromatografia wykluczania rozmiarowego (SEC) stała się obiecującą alternatywą dla izolowywania pęcherzyków pozakomórkowych, ponieważ oddziela cząstki na podstawie wielkości bez poddawania pęcherzyków wysokim siłom odśrodkowym. SEC umożliwia efektywne oddzielenie małych pęcherzyków pozakomórkowych od białek rozpuszczalnych i zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej, zachowując integralność i funkcję biologiczną pęcherzyków. Co ważne, SEC umożliwia jasne zdefiniowanie frakcji elucji, umożliwiając powtarzalne identyfikowanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki pozakomórkowe i poprawioną spójność w eksperymentach¹². Jednak procesy SEC wymagają starannej optymalizacji dla próbek pochodzących z tkanek, szczególnie w odniesieniu do wstępnego przetwarzania tkanek, usuwania zanieczyszczeń i zbierania frakcji. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowałeśmy zoptymalizowany i znormalizowany protok