$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Miejsca eksperymentalne
Próby przeprowadzono w dwóch lokalizacjach oddalonych od siebie o 7 km; w każdej z nich zastosowano inne zabiegi inokulacyjne. W pierwszym doświadczeniu w gospodarstwie badawczym Molelwane należącym do North-West University (NWU) (25,810°S, 25,630°E, 1276 m) w prowincji Północno-Zachodniej w RPA, przygotowano tunel z siatką zapewniającą 40% zacienienia. Czerwona gleba piaszczysto-gliniasta została sklasyfikowana jako forma Hutton i zawierała 75% piasku, 4% pyłu oraz 21% gliny25. Drugi eksperyment przeprowadzono w tunelu z siatką na kampusie NWU w Mafikeng (25,8278 °S, 25,6079 °E, 1276 m). Gleby w drugiej lokalizacji były piaszczysto-gliniaste z zawartością 82% piasku, 3% pyłu i 15% gliny i zostały wcześniej sklasyfikowane jako forma Arcadia25. Zielone hybrydowe NPs CuO/ZnO zostały zsyntetyzowane w laboratorium Katedry Chemii w Szkole Nauk Fizycznych i Chemicznych na Wydziale Nauk Przyrodniczych i Rolniczych NWU w RPA.
Synteza zielonych hybrydowych NP CuO/ZnO
Dziesięć (10) g wysuszonego podłoża grzybowego (SMS) po uprawie Pleurotus ostreatus dodano do 100 mL wody dejonizowanej, podgrzano do 70 °C i mieszano przez 2 h26. Mieszaninę schłodzono następnie do temperatury pokojowej, przefiltrowano, a 30 mL filtratu dodano do roztworu zawierającego 2,5 g octanu miedzi i 2 g octanu cynku w 30 mL wody destylowanej. pH tego roztworu skorygowano do 8 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH), podgrzano do 80 °C przez 2 h, a po zakończeniu reakcji odwirowano, suszono przez noc w piekarniku i kalcynowano w temperaturze 650 °C przez 2 h26. Zsyntetyzowane NP poddano charakterystyce, która potwierdziła uzyskanie zielonych hybrydowych NP CuO/ZnO.
Pobieranie i analiza próbek gleby
Próbki gleby pobrano z Farmy Uniwersyteckiej w Molelwane oraz z obszaru doświadczalnego kampusu z głębokości 0–15 cm i 15–30 cm. Następnie zostały one skategoryzowane i przebadane pod kątem właściwości fizycznych i chemicznych zgodnie z opisem przedstawionym przez27.
Projekt eksperymentalny
W badaniu zastosowano eksperyment czynnikowy ułożony w zrandomizowany schemat blokowy (RCBD) z trzema powtórzeniami. Aby ocenić skuteczność hybrydowych NP CuO-ZnO otrzymanych metodą zielonej syntezy w różnych scenariuszach zanieczyszczenia, ustanowiono dwa niezależne tryby ekspozycji w oddzielnych lokalizacjach: Lokalizacja 1 (Kampus North-West University) reprezentowała model zanieczyszczenia egzogennego, w którym glebę wzbogacono wyekstrahowaną AFB1 w stężeniu 160 ppb/kg, aby ocenić zdolność NP do bezpośredniej adsorpcji i blokowania translokacji. Lokalizacja 2 (Gospodarstwo Badawcze Molelwane) reprezentowała model infekcji biologicznej, w którym glebę zaszczepiono zarodnikami A. flavus w dawce 160 zarodników/kg, aby zbadać wpływ przeciwgrzybiczy NP na produkcję mikotoksyn de novo i ich późniejsze pobieranie przez rośliny. Sproszkowane NP odważono i równomiernie wymieszano z 1 kg gleby w plastikowej torbie do sadzenia po inokulacji (AFB1 lub zarodniki A. flavus). Każda seria zabiegów była wykonywana oddzielnie, a dłonie dezynfekowano pomiędzy nimi. Następnie w każdej doniczce (średnica górna 9 cm, dolna 6,5 cm) posadzono początkowo cztery nasiona kukurydzy. Aby zachować trzy zdrowe siewki w doniczce, siewki przycięto tydzień po ich wykiełkowaniu. Zgodnie z zaleceniami dotyczącymi optymalnej produkcji kukurydzy wynikającymi z analizy gleby, glebę nawożono. Doniczki ustawiono w odstępach międzyrzędowych i wewnątrzrzędowych wynoszących 0,75 m × 0,3 m, co dało łącznie 216 doniczek. Po wysiewie nasion glebę w doniczkach podlano do 60% pojemności polowej. Próbki gleby i roślin pobierano w trzech stadiach rozwojowych: V10 (rozwój), R1 (kwitnienie) i R6 (dojrzałość). Próbki transportowano następnie do laboratorium w chłodni wypełnionej lodem i przechowywano w temperaturze -20 °C do dalszych analiz. Do przechowywania i głębokiego mrożenia pozostałych próbek roślin do oznaczania stężeń AFB1 oraz innych testów wykorzystano brązowe papierowe torby. Pozostałe próbki roślin do oznaczania stężeń AFB1 i innych analiz przechowywano w brązowych papierowych torbach i zamrożono do czasu analizy.
Analiza aflatoksyn w kukurydzy
Części rozwojowe kukurydzy (korzeń, łodyga, liść i ziarno) na różnych etapach wzrostu zostały zebrane do sterylnych plastikowych woreczków, starannie oznakowane i przetransportowane do laboratorium. Aby zachować spójność danych o wzroście i zapewnić niezależne obserwacje dla każdego etapu rozwojowego, zastosowano protokół pobierania próbek metodą destrukcyjną. W celu wyeliminowania kontaminacji krzyżowej między stężeniami nanocząstek a rodzajami inokulacji, narzędzia do zbiorów i rękawiczki były czyszczone 70% etanolem i płukane wodą dejonizowaną pomiędzy każdą grupą zabiegową. Przy użyciu moździerza i tłuczka sproszkowano 10 g materiału roślinnego i 1 g chlorku sodu (NaCl) przez 10 min w 25 mL 80% metanolu i 20% wody destylowanej. W przypadku ziaren kukurydzy i rdzenia kukurydzy, 25 g zmielonej próbki oraz 2,5 g NaCl zmieszano z 100 mL 80% metanolu:20 wody destylowanej przy wysokiej prędkości przez 10 min. Następnie zhomogenizowany ekstrakt przefiltrowano przez szklany filtr z włókien mikroskopowych, po czym przemyto go 20 mL 20% Tween-2 w solance fosforanowej (PBS). Aflatoksyny wyekstrahowano z kolumny powinowactwa odpornościowego poprzez elucję przy szybkości przepływu jednej kropli na sekundę, a supernatant (cytoplazmę) zebrano do bursztynowej fiolki. Następnie poziom AFB1 oraz innych aflatoksyn zmierzono metodą chromatografii cieczowej28, która obejmowała derywatyzację aflatoksyn roztworem o-ftaldialdehydu i wstrzyknięcie derywatyzowanych związków do systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). System HPLC był wyposażony w detektor fluorescencyjny Jasco FP-920 ustawiony na wzbudzenie 362 nm i emisję 425 nm. AFB1 posiadał naturalną strukturę fizjologiczną umożliwiającą detekcję przy długości fali wzbudzenia 362 nm. Użyto kolumny Hichrom (4,6 mm × 150 mm) z cząstkami 5 µm, a reaktorem derywatyzacji był program KOBRA Cell przy 100 µA. Rozdzielanie pików chromatograficznych przeprowadzono na kolumnie Hichrom, do której dopasowano przedkolumnę o podobnej fazie stacjonarnej. Jako wkład ochronny i analityczny zastosowano odpowiednio Inertsil ODS-3 i ODS-3 V, natomiast injektor stanowił autosampler z zaworem reodyne. Faza ruchoma składała się z wody:metanolu (65:35, v/v), bromku potasu (119 mg) i 4 M kwasu azotowego (350 µL) na litr i była pompowana z szybkością przepływu 1,0 mL/min w programie izokratycznym. Detekcję aflatoksyn uznano za pozytywną dla każdego piku o czasie zatrzymania zbliżonym do każdego standardu i o wysokości pięciokrotnie przekraczającej szum tła29.
Aby potwierdzić analityczne podejście metody HPLC, obliczono granice wykrywalności (LOD), granice oznaczalności (LOQ) oraz procentowy (%) odzysk, korzystając odpowiednio z równań 1, 2 i 3. LOD to najniższe stężenie aflatoksyny, które można wiarygodnie odróżnić od szumu tła, natomiast LOQ to najniższe stężenie aflatoksyny, które można zmierzyć ilościowo z akceptowalną precyzją i dokładnością30. Odzysk AFB1 i jej metabolitów określono poprzez dodanie 10 µL standardów całkowitej zawartości aflatoksyn (AFB1, AFB2, AFG1 oraz AFG2) do negatywnych próbek kontrolnych kukurydzy w trzech powtórzeniach. Następnie próbki poddano ekstrakcji za pomocą HPLC, stosując wcześniej opisane procedury.
LOD = X + 3s 1
LOQ = X + 10s 2
3
Gdzie: „X” to średnia koncentracja wartości próbek ślepych po wzbogaceniu, a „s” to odchylenie standardowe próby.
Szacowanie narażenia na AFB1
Do obliczenia szacowanego spożycia dziennego (EDI) wykorzystano średnie poziomy aflatoksyn w diecie kukurydzianej, dzienne spożycie kukurydzy oraz średnią masę ciała (dzieci, dorosłych, bydła mięsnego, krów mlecznych i piskląt). EDI dla średnich poziomów aflatoksyn obliczono zgodnie z równaniem 2 i wyrażono w (ng/kg masy ciała/dzień); w celu obliczenia indeksu zagrożenia (HI) wartości EDI przekształcono na ng/kg masy ciała/dzień (1 ppb/kg/dzień = 1 000 ng/kg masy ciała/dzień), aby dopasować jednostki do TD503231.
4
Ocena i charakterystyka ryzyka
Wskaźnik zagrożenia (HI) obliczono, dzieląc EDI przez TD50 i mnożąc wynik przez współczynnik bezpieczeństwa wynoszący 50 000. Mediana dawki toksycznej (TD) 50 to dawka (ng/kg/masa ciała/dzień) niezbędna do wywołania nowotworów u 50% zwierząt badawczych, które nie rozwinęłyby nowotworów przy dawce zerowej31,32.
Analiza danych
Analizę wariancji zgromadzonych danych dotyczących wzrostu i plonu przeprowadzono z wykorzystaniem procedury RCBD w programie SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Wielokrotne porównania średnich najmniejszych kwadratów wykonano przy użyciu testu Tukey’s honestly significant difference (HSD)33.