Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przedstawiono protokół do izolacji i pierwotnej kultury komórek endotelialnych drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) z mózgu mysiego noworodka w celu stworzenia solidnego modelu in vitro do badania funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Komórki endotelialne mikrokrążenia mózgowego (BMEC) są głównym składnikiem komórkowym bariery krew-mózg (BBB) i odgrywają kluczową rolę w regulowaniu transportu cząstek i utrzymaniu homeostazy układu nerwowego. Niezawodne modele in vitro endotelium mózgu są niezbędne do badania fizjologii BBB oraz jej dysfunkcji w chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Opisano wzorcowy protokół dotyczący izolowaniu i pierwotnej kultury BMEC z młodzieńczej kory mózgowej myszy. Metoda obejmuje rozcięcie tkanki korowej, mechaniczne i enzymatyczne dysocjację, usunięcie resztków mieliny za pomocą gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz wzbogacanie komórek endotelialnych poprzez immunoselekcję opartą na CD31. Izolowane komórki są następnie hodowane na płytkach pokrytych kolagenem i charakteryzowane poprzez ocenę morfologiczną, wykrywanie markerów endotelialnych immunofluorescencyjne, testy formowania angiogennych tubul i pomiary transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER) w celu oceny właściwości barierowych. Ten protokół zapewnia niezawodne podejście do uzyskania pierwotnych kultur BMEC, nadających się do badania biologii BBB, sygnałowania endotelialnego i interakcji neuronaczyniowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Bariera krew-mózg (BBB) to wysoce wyspecjalizowana struktura, która ściśle reguluje wymianę substancji między otoczem ośrodkowego układu nerwowego (OUN) a krążeniem ogólnoustrojowym1. BBB jest głównie utworzona przez komórki śródbłonka drobnych naczyń krwionośnych mózgu połączone szczelnymi złączami. Te komórki śródbłonka funkcjonują w ramach wielokomórkowego układu zwanego neuronaczyniowym (NVU), który obejmuje również komórki glejowe, perycyte, neurony, komórki gleju i błonę podstawową2. Wśród tych składników, komórki śródbłonka drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) odgrywają kluczową rolę, tworząc ciągłą warstwę z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Komitet Bioetyki i Biobezpieczeństwa Uniwersytetu Bío-Bío zatwierdził ten projekt (grant Fondecyt 1240925). Praca ze zwierzętami była prowadzona zgodnie z kardynalnymi zasadami trzech R's w zakresie stosowania zwierząt eksperymentalnych13 oraz zgodnie z zaleceniami Wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi opublikowanych przez National Institutes of Health Stanów Zjednoczonych14. Zwierzęta były trzymane w odpowiednich środowiskach w Bioterium Uniwersytetu Bío-Bío w standardowych warunkach zakwaterowania (cykl 12 h światło/ciemność, kontrolowana temperatura 22 ± 2 °C, z ad libitum dostępem do ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisany tutaj protokół umożliwia izolację i hodowlę pierwotnych BMEC z myszy noworodkowych (P5). Komórki te stanowią główny komponent komórkowy BBB i są zatem cennym narzędziem eksperymentalnym do badania fizjologii i patofizjologii naczyniowej mózgu. Pomyślną izolację i hodowlę komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (BMEC) wykazano za pomocą ocen morfologicznych, fenotypowych i funkcjonalnych.
Procedura izolacji pozwoliła na uzyskanie zawiesiny komórkowej pochodzącej z wypreparowanej kory.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Izolacja BMEC jest narzędziem instrumentalnym do badania mechanizmów regulujących fizjologię BBB oraz jej dysfunkcji w różnych patologiach układu nerwowego (CNS)4,9, w tym udarów. W przeciwieństwie do unieszlachetnionych linii komórkowych, pierwotne kultury BMEC zachowują kluczowe cechy fenotypowe i funkcjonalne śródbłonka mózgowego, w tym ekspresję białek ściśle związanych oraz zdolność angiogenową reprezentatywną dla kontekstu in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
Części tego rękopisu zostały napisane z pomocą modelu AI OpenAI's ChatGPT (wersja GPT-4, lipiec 2025) w celu poprawy jasności, języka i spójności. Autorzy krytycznie przejrzeli, edytowali i zatwierdzili wszystkie treści wspierane przez AI. Żadne narzędzia AI nie zostały użyte do analizy danych, interpretacji wyników czy formułowania wniosków naukowych.
Autorzy chcieliby podziękować badaczom należącym do GRIVAS Health i NEUROVAS za ich cenny wkład. To badanie zostało sfinansowane przez Fondecyt Regular 1240295.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 60 mm culture plates | Corning | 430166 | |
| 96 Well culture plates | Corning | 41122107 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Antibiotic-Antimycotic (optional) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-CD31 | Santa Cruz | sc-46694 | 1:100 |
| Anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | 1:500 |
| Anti-GLUT1 | Abcam | ab115730 | 1:200 |
| Anti-Iba1 | Santa Cruz | sc-32725 | 1:500 |
| Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye) | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | 1:500 |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor (488 Dye) | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | 1:500 |
| Automatic and serological pipettes | Oxford LP | OXL.OXL.OSP-5C | |
| Basal medium (for collagen solution) | Gibco (DMEM) | 11965092 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Collagenase type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | 1 µg/mL |
| DMEM (high glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| EndoGRO-MV Complete Medium | Merck Millipore | SCME004 | Endothelial cell growth medium |
| Falcon tubes (15 & 50 mL) | Corning® | 352096 / 352070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | |
| Fluorescence Microscope | Motic | BA410 | |
| Gloves, masks, lab consumables | Various suppliers | — | |
| Heparin (100 U/mL) | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Magnetic separation magnet | EasySep | NC9284020 | |
| Orbital Shaker (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | SK-0180-S | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PBS (1×) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Refrigerated Centrifuge | HITACHI | CT5RE | |
| Scalpel | Fine Science Tools | Various | |
| Scissors and fine tweezers | Fine Science Tools | Various | |
| Sterile nitrocellulose membrane | BIO-RAD | 1620094 | |
| Type I collagen | Corning | 30394 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny