Przedstawiono protokół do izolacji i pierwotnej kultury komórek endotelialnych drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) z mózgu mysiego noworodka w celu stworzenia solidnego modelu in vitro do badania funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla komórek endoteliowych mikrokrążenia mózgu myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki endotelialne mikrokrążenia mózgowego (BMEC) są głównym składnikiem komórkowym bariery krew-mózg (BBB) i odgrywają kluczową rolę w regulowaniu transportu cząstek i utrzymaniu homeostazy układu nerwowego. Niezawodne modele in vitro endotelium mózgu są niezbędne do badania fizjologii BBB oraz jej dysfunkcji w chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Opisano wzorcowy protokół dotyczący izolowaniu i pierwotnej kultury BMEC z młodzieńczej kory mózgowej myszy. Metoda obejmuje rozcięcie tkanki korowej, mechaniczne i enzymatyczne dysocjację, usunięcie resztków mieliny za pomocą gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz wzbogacanie komórek endotelialnych poprzez immunoselekcję opartą na CD31. Izolowane komórki są następnie hodowane na płytkach pokrytych kolagenem i charakteryzowane poprzez ocenę morfologiczną, wykrywanie markerów endotelialnych immunofluorescencyjne, testy formowania angiogennych tubul i pomiary transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER) w celu oceny właściwości barierowych. Ten protokół zapewnia niezawodne podejście do uzyskania pierwotnych kultur BMEC, nadających się do badania biologii BBB, sygnałowania endotelialnego i interakcji neuronaczyniowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Wprowadzenie
Bariera krew-mózg (BBB) to wysoce wyspecjalizowana struktura, która ściśle reguluje wymianę substancji między otoczem ośrodkowego układu nerwowego (OUN) a krążeniem ogólnoustrojowym1. BBB jest głównie utworzona przez komórki śródbłonka drobnych naczyń krwionośnych mózgu połączone szczelnymi złączami. Te komórki śródbłonka funkcjonują w ramach wielokomórkowego układu zwanego neuronaczyniowym (NVU), który obejmuje również komórki glejowe, perycyte, neurony, komórki gleju i błonę podstawową2. Wśród tych składników, komórki śródbłonka drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) odgrywają kluczową rolę, tworząc ciągłą warstwę ze szczelnymi złączami, tysiącami selektywnych układów transportowych, ograniczając przepływ pęcherzyków i ograniczając infiltrację komórek odpornościowych poprzez niską ekspresję cząstek adhezji, które ograniczają przenikanie substancji rozpuszczonych i komórek do parenchymy mózgu3,4.
Oprócz roli fizycznej i selektywnej bariery, BMEC są aktywnie zaangażowane w istotne procesy, w tym w sygnalizację neuronaczyniową, regulację przepływu krwi mózgowej, lokalne odpowiedzi immunologiczne, a szczególnie w angiogeneszę mózgu5. Ten ostatni proces jest kluczowy podczas rozwoju embrionalnego, ale jest również reaktywowany w patologicznych warunkach, takich jak udar, niedokrwienie lub zapalenie. BMEC reagują na sygnały proangiogenne, takie jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF) i czynnik wzrostu łożyska (PLGF), koordynując tworzenie i dojrzewanie nowych naczyń6,7. Dlatego dysfunkcja śródbłonka mózgu poważnie naruszyłaby integralność BBB i homeostazę mózgu.
Badanie BMEC in vitro pozwala nam na modelowaniu zarówno fizjologii BBB, jak i mechanizmów regulujących angiogeneszę mózgu. Jednak izolowanie tych komórek z tkanki mózgowej stanowi znaczne wyzwania techniczne z powodu złożoności tkanki nerwowej, obfitości mieliny i potrzeby uzyskania kultur o wysokiej czystości śródbłonkowej. Chociaż dostępne są uodparnione linie komórkowe, mają one istotne ograniczenia w zakresie reprezentatywności fenotypowo i funkcjonalnie8.
W tym kontekście, protokoły pierwotnej kultury BMEC z noworodkowych modeli mysich stanowią potężne narzędzie eksperymentalne, ponieważ zachowują wiele cech morfologicznych, molekularnych i funkcjonalnych śródbłonka mózgu in vivo. Jednak kilka uznanych protokołów izolacji BMEC mysich opiera się na dysocjacji mechanicznej w połączeniu ze stężeniowymi gradientami (dekstran lub Percoll), często dając zmienne wzbogacenie śródbłonkowe i resztkowe zanieczyszczenie przez perycyte, komórki glejowe i resztki mieliny9. Oczyszczanie oparte na antybiotykach z zastosowaniem puromycyny poprawia czystość śródbłonkową (do ~95%), ale może powodować stres komórkowy z powodu hamowania syntezy białek i potencjalnych skutków dla fenotypu śródbłonka10. Alternatywnie, podejścia oparte na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) zapewniają wysoce wyczyszczone populacje, ale wymagają specjalistycznego sprzętu i rozległej obróbki, co może zmniejszyć żywotność i skalowalność11. Bardziej aktualne protokoły noworodkowe unikają gradientów stężeniowych i zmniejszają liczbę etapów wirowania, poprawiając wydajność i ograniczając zanieczyszczenie12.
Opierając się na tym tle, praca ta opisuje zoptymalizowany protokół izolacji i hodowania komórek śródbłonkowych z drobnego unaczynienia mózgu noworodków myszy. Metoda ta łączy precyzyjną anatomiczną dysekcję, wydajne trawienie enzymatyczne, usuwanie mieliny za pomocą gradientu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz wzbogacanie poprzez immunoselekcję z magnetycznymi mikrosferami sprzężonymi z markerem CD31. Protokół umożliwia uzyskanie żywych, powtarzalnych i wzbogaconych kultur pierwotnych, nadających się do badań nad angiogenesą mózgu, interakcją neuronaczyniową, sygnalizacją śródbłonkową i dysfunkcją BBB w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komitet Bioetyki i Biobezpieczeństwa Uniwersytetu Bío-Bío zatwierdził ten projekt (grant Fondecyt 1240925). Praca ze zwierzętami była prowadzona zgodnie z kardynalnymi zasadami trzech R's w zakresie stosowania zwierząt eksperymentalnych13 oraz zgodnie z zaleceniami Wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi opublikowanych przez National Institutes of Health Stanów Zjednoczonych14. Zwierzęta były trzymane w odpowiednich środowiskach w Bioterium Uniwersytetu Bío-Bío w standardowych warunkach zakwaterowania (cykl 12 h światło/ciemność, kontrolowana temperatura 22 ± 2 °C, z ad libitum dostępem do pokarmu i wody).
Aby uzyskać komórki, użyto dziki typu (WT) ciążowych myszy (C57BL/6), w wieku od 4 do 6 miesięcy. Po porodzie młode pozostały z matką do 5 dnia po urodzeniu (P5). W tym momencie potomstwo było głęboko znieczulone za pomocą izofluranu aż do utraty odruchów przed eutanazją. Hipotermia była używana wyłącznie jako uzupełnienie w celu zminimalizowania ruchów i była natychmiast poprzedzona dekapitacją. Wszystkie procedury były wykonywane zgodnie z wytycznymi American Veterinary Medical Association (AVMA) dotyczącymi eutanazji zwierząt (2020)15 oraz międzynarodowymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (NIH)14. Izolowany korteks mózgowy był używany do opracowania tego protokołu eksperymentalnego (patrz Krok 3 protokołu). Tabela Materiałów zawiera listę materiałów i przeciwciał użytych w tym protokole.
1. Przygotowanie pożywki do kultury endotelialnej
- Aby przygotować 500 mL pożywki do kultury komórek endotelialnych mózgu myszy, w sterylnym pojemniku wymieszaj 250 mL DMEM uzupełnione o 10% surowicy płodowej bydlęcej (FBS), 250 mL pożywki do kultury komórek endotelialnych uzupełnionej o 10% FBS.
UWAGA: Pożywka zapewnia istotne czynniki wzrostu endotelialnego i wspiera proliferację komórek. Jeśli wskazany produkt (patrz Tabela Materiałów) nie jest dostępny, można dodać do DMEM + FBS równoważne suplementy dla komórek endotelialnych (np. ECGS, hydrokortyzon i L-glutamina), aby osiągnąć podobne warunki wzrostu16. - Przefiltruj całą pożywkę (10% FBS) przez filtr 0,22 µm, aby zapewnić sterylność.
- Przechowywaj przygotowaną pożywkę w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Przygotowywaj świeżą pożywkę co 2–4 tygodnie, aby zachować aktywność czynników wzrostu.
2. Pokrywanie płytek kulturowych
UWAGA: Aby promować przyleganie komórek i utrzymać fenotyp endotelialny, płytki kulturowe muszą być wstępnie pokryte kolagenem typu I. Kroki tego procesu są następujące:
- Przygotuj roztwór pokrywający, mieszając kolagen typu I (0,1 mg/mL), M octowane kwasu octowego do rozpuszczenia kolagenu i sterylnego pożywki bazowej, aby osiągnąć łączną objętość 15 mL. Delikatnie mieszaj, aż kolagen całkowicie się rozpuści i dostosuj roztwór do pH 4,0 w razie potrzeby. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 µm i przechowuj na lodzie do momentu użycia, aby zachować stabilność kolagenu.
UWAGA: Kolagen typu I naśladuje błonę podstawową, wspiera przyleganie komórek endotelialnych i pomaga utrzymać fenotyp komórek. - Wyrównaj roztwór w warunkach sterylnych. Równomiernie nałóż roztwór, aby pokryć całą powierzchnię płytek kulturowych.
UWAGA: Stosuje się tylko objętość niezbędna do pokrycia powierzchni. - Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc (12–16 h), aby kolagen mógł odpowiednio się zaadsorbować. Przed zasiewem komórek usuń nadmiar roztworu pokrywającego i wypłucz płytki 2 razy sterylnym 1x buforem fosforanowym (1x PBS, pH 7,4), aby usunąć resztki kwasu i niezwiązany kolagen.
3. Izolacja kultury mieszanych komórek mózgowych
UWAGA: Ten protokół opiera się na wcześniejszych doniesieniach9,17, które miały na celu izolację BMEC z kory mózgowej myszy P5.
- Ofiaruj pięć myszy P5 przy użyciu głębokiego znieczulenia za pomocą izofluranu; hipotermię stosuj tylko jako uzupełnienie, po czym wykonaj dekapitację szyjną.
UWAGA: Od tego kroku wszystkie procedury muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z czystym przepływem powietrza. - Zbierz mózgi (Rysunek 1A) i umieść je w sterylnym zimnym PBS (1x) w 50 mL sterylnej probówce stożkowej, dopóki wszystkie mózgi nie zostaną przetworzone.
- Oddziel oponę twardówkową, ostrożnie przewracając każdy m
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany tutaj protokół umożliwia izolację i hodowlę pierwotnych BMEC z myszy noworodkowych (P5). Komórki te stanowią główny komponent komórkowy BBB i są zatem cennym narzędziem eksperymentalnym do badania fizjologii i patofizjologii naczyniowej mózgu. Pomyślną izolację i hodowlę komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (BMECs) wykazano za pomocą ocen morfologicznych, fenotypowych i funkcjonalnych.
Przebieg izolacji doprowadził do uzyskania zawiesiny komórkowej pochodzącej z wypreparowanej ko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Izolacja BMEC jest narzędziem instrumentalnym do badania mechanizmów regulujących fizjologię BBB oraz jej dysfunkcji w różnych patologiach układu nerwowego (CNS)4,9, w tym udarów. W przeciwieństwie do unieszlachetnionych linii komórkowych, pierwotne kultury BMEC zachowują kluczowe cechy fenotypowe i funkcjonalne śródbłonka mózgowego, w tym ekspresję białek ściśle związanych oraz zdolność angiogenową reprezentatywną dla kontekstu in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
Części tego rękopisu zostały napisane z pomocą modelu AI OpenAI's ChatGPT (wersja GPT-4, lipiec 2025) w celu poprawy jasności, języka i spójności. Autorzy krytycznie przejrzeli, edytowali i zatwierdzili wszystkie treści wspierane przez AI. Żadne narzędzia AI nie zostały użyte do analizy danych, interpretacji wyników czy formułowania wniosków naukowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować badaczom należącym do GRIVAS Health i NEUROVAS za ich cenny wkład. To badanie zostało sfinansowane przez Fondecyt Regular 1240295.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 60 mm culture plates | Corning | 430166 | |
| 96 Well culture plates | Corning | 41122107 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Antibiotic-Antimycotic (optional) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-CD31 | Santa Cruz | sc-46694 | 1:100 |
| Anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | 1:500 |
| Anti-GLUT1 | Abcam | ab115730 | 1:200 |
| Anti-Iba1 | Santa Cruz | sc-32725 | 1:500 |
| Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye) | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | 1:500 |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor (488 Dye) | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | 1:500 |
| Automatic and serological pipettes | Oxford LP | OXL.OXL.OSP-5C | |
| Basal medium (for collagen solution) | Gibco (DMEM) | 11965092 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Collagenase type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | 1 µg/mL |
| DMEM (high glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| EndoGRO-MV Complete Medium | Merck Millipore | SCME004 | Endothelial cell growth medium |
| Falcon tubes (15 & 50 mL) | Corning® | 352096 / 352070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | |
| Fluorescence Microscope | Motic | BA410 | |
| Gloves, masks, lab consumables | Various suppliers | — | |
| Heparin (100 U/mL) | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Magnetic separation magnet | EasySep | NC9284020 | |
| Orbital Shaker (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | SK-0180-S | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PBS (1×) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Refrigerated Centrifuge | HITACHI | CT5RE | |
| Scalpel | Fine Science Tools | Various | |
| Scissors and fine tweezers | Fine Science Tools | Various | |
| Sterile nitrocellulose membrane | BIO-RAD | 1620094 | |
| Type I collagen | Corning | 30394 |
Bibliografia
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
- Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
- Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
- Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
- Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
- Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
- Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
- Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
- Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
- Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
- Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
- National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
- Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
- Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
- Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
- Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
- Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
- Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
- Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
- Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
- Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
